多元電致化學(xué)發(fā)光dna傳感器及用于病毒的檢測的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于量子點和石墨締應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于雙色CdTe量子點、 石墨締和金納米粒子（AuNPs)構(gòu)建的多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器及用于同時檢測兩種 病毒目標DNA，本發(fā)明W檢測己肝病毒目標DNA和丙肝病毒目標DNA為例。
【背景技術(shù)】
[000引半導(dǎo)體納米粒子又叫量子點（Quantumdots,孤S)，由II-VI族或III-V族元素組 成，也可由兩種或兩種W上的半導(dǎo)體材料組成核殼型量子點。通常包含幾百到幾千個原子， 一般為球形或類球形，粒徑為1~lOnm。與傳統(tǒng)的有機染料和巧光蛋白相比，量子點在許多 方面擁有著獨特的優(yōu)勢：可調(diào)變的巧光性、高的量子產(chǎn)率、較寬的激發(fā)波長范圍、對稱的發(fā) 射峰且半峰寬較窄、W及良好的光化學(xué)穩(wěn)定性等。與傳統(tǒng)的巧光染料比較，量子點作為一種 新型的發(fā)光體具有許多良好的光學(xué)特性：
[0003] (1)發(fā)射光譜可調(diào)。量子點的發(fā)射波長的大小可通過在合成過程中控制試劑的組 成和合成的時間來調(diào)解。通過改變量子點的種類和量子點粒徑的大小，可產(chǎn)生一系列的發(fā) 射波長和顏色分明的量子點。
[0004] (2)吸收光譜很寬，發(fā)射光譜很窄。量子點的有效激發(fā)的波段很寬。利用同一個激 發(fā)光源，就可激發(fā)不同尺寸、不同種類的量子點。
[0005] (3)巧光壽命長，穩(wěn)定性好。量子點的巧光壽命很長，即使連續(xù)激發(fā)，巧光強度也不 會有明顯的下降。量子點即使在激光的高強度和長時間的照射下，光學(xué)特性也不會有明顯 變化。它的穩(wěn)定性遠遠高于尋常的巧光染料，可進行對標記物長時間的動態(tài)觀察。
[0006] (4)生物相容性好。表面修飾后的量子點可W特異性聯(lián)接，細胞毒性小，可用于活 體標記。
[0007] (5)具有空間兼容性。一個量子點可偶聯(lián)兩種或兩種W上的生物分子或配體。
[000引量子點作為一種新型的納米材料，在過去的十年里，吸引了許多關(guān)注。作為一個優(yōu) 良的光學(xué)材料，量子點已被廣泛用于檢測分析領(lǐng)域中的各種物質(zhì)，比如；小分子、蛋白質(zhì)和 DM。量子點優(yōu)異的光學(xué)和電學(xué)特性，令量子點在生物分析中應(yīng)用廣泛，并具有很強的競爭 力。尺寸可控的性質(zhì)令量子點在多組分生物分析中大放異彩。
[0009] 電致化學(xué)發(fā)光巧lectrochemiluminescence，簡稱E化），是一種將電能轉(zhuǎn)化為福 射能量的方法。電致化學(xué)發(fā)光是指對電極施加電壓或電流，反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物與體系中其 它組分之間發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，使發(fā)光體激發(fā)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，W光福射的 形式釋放能量而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。電致化學(xué)發(fā)光是在化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā) 展的一種新型的產(chǎn)物。
[0010] 量子點的E化現(xiàn)象是在本世紀初才發(fā)展起來的。量子點作為新型的E化發(fā)光體，其 E化的產(chǎn)生是在電極上施加電壓后，產(chǎn)生氧化型空穴和還原型電子分別通過電化學(xué)氧化還 原反應(yīng)注入到量子點的表面或者中屯、導(dǎo)帶，產(chǎn)生了激發(fā)態(tài)量子點，當激發(fā)態(tài)量子點躍遷回 到基發(fā)態(tài)時就產(chǎn)生了電致化學(xué)發(fā)光。量子點的電致化學(xué)發(fā)光的發(fā)光機理同時遵循煙滅型電 致化學(xué)發(fā)光和共反應(yīng)劑參與的電致化學(xué)發(fā)光的發(fā)光機理。量子點的常用共反應(yīng)劑有S2〇s2\ &〇2、溶解氧及C2O42哪。量子點的電致化學(xué)發(fā)光不要求小尺寸的納米粒子，因而不需要苛刻 的合成條件來控制量子點的粒徑大小。目前除了理論研究外，量子點作為E化標記物，在傳 感分析方面也已拓展到生物小分子、免疫分析、核酸分析W及細胞分析等領(lǐng)域。水相合成的 量子點可直接通過表面修飾來制備電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器分析檢測生物分子已經(jīng)報道 了很多，但有關(guān)電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器的報道還很少。探索一種基于雙色CdTe量子點構(gòu) 建多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器的方法，對降低成本W(wǎng)及提高其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實際應(yīng) 用價值有著重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[ocm] 本發(fā)明針對一元電致化學(xué)發(fā)光DM傳感器，提出了一種新穎的基于雙色CdTe量子 點、石墨締和金納米粒子（AuNPs)構(gòu)建的多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器。
[001引本發(fā)明所述的多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器提供了一種簡單、便捷、低成本和高 靈敏的方法來同時檢測己肝病毒目標DNA和丙肝病毒目標DNA。并且，本發(fā)明所述的電致化 學(xué)發(fā)光DNA傳感器已經(jīng)成功地應(yīng)用到同時檢測人血清中己肝病毒目標DNA和丙肝病毒目標 DNA的含量，并取得了滿意的結(jié)果。
[0013] 本發(fā)明所述的一種多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器，其特征在于是由如下步驟制備 得到：
[0014] 1)首先，使用1.0ym~0.05ym納米氧化侶粉末（a-Al2〇3)將玻碳電極佑啦拋 光，拋光后的玻碳電極用蒸饋水、己醇和蒸饋水超聲清洗去除吸附的物質(zhì)，然后純氮氣環(huán)境 下吹干，得到表面拋光的玻碳電極；
[00巧]。將10~30yL、0. 10~0. 3mg?m。氧化石墨締佑0)水溶液滴到步驟1)制備 的玻碳電極表面，20~30°C下干燥，在GCE表面得到GO薄膜，記為G0/GCE;
[0016] 3)在0V到-1.5V的電位下、0.IVS-1~0. 5VS-1的掃描速率下、pH= 7. 0~7. 5 的磯酸鹽緩沖溶液（PBS)中，W玻碳電極作為工作電極，銷絲電極作為對電極，飽和甘隸電 極作為參比電極，連續(xù)掃描步驟2)得到的G0/GCE10~20個周期，氧化石墨締（GO)經(jīng)過 電化學(xué)還原得到石墨締片層佑Ns)，從而在GCE表面得到G化薄膜，記為GNs/GCE;
[0017] 4)將5~10yL、530~550nmCdTe孤S標記的己肝病毒捕獲DM和5~lOuL、 600~620皿CdTe孤S標記的丙肝病毒捕獲DM溶液一同滴到步驟3)制備的GNs/GCE表 面，20~30°C下干燥，在GCE表面得到CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs復(fù)合薄膜，記為 CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs/GCE;
[00化]5)將步驟4)制備的CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs/GCE浸到與其堿基互補的 己肝病毒目標DNA和丙肝病毒目標DNA的混合溶液中，90~95°C下混合5~lOmin，然后快 速冷卻到20~30°C，在GCE表面得到病毒目標DNA/CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs復(fù) 合薄膜，記為病毒目標DNA/CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs/GCE;
[0019] 6)將步驟5)制備的病毒目標DNA/CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/GNs/GCE進一 步浸到與病毒捕獲DNA堿基互補的AuNPs標記的己肝病毒探針DM和AuNPs標記的丙肝 病毒探針DNA的混合溶液中，90~95°C下混合5~lOmin，然后快速冷卻到20~30°C，在 GCE表面得到AuNPs標記的病毒探針DNA/病毒目標DNA/CdTe孤S標記的病毒捕獲DNA/ GNs復(fù)合薄膜，記為AuNPs標記的病毒探針DM/病毒目標DNA/CdTe孤s標記的病毒捕獲DNA/GNs/GCE;從而得到基于AuNPs標記的病毒探針DNA/病毒目標DNA/CdTe孤S標記的 病毒捕獲DNA/GNs/GCE構(gòu)建的一種新型的多元電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器。
[0020] 上述步驟中所述的530~550皿CdTe孤S標記的己肝病毒捕獲DNA和600~ 620nmCdTe孤S標記的丙肝病毒捕獲DNA，是由如下驟制備得到：
[002U1)通過W琉基丙酸（MPA)為穩(wěn)定劑的回流冷卻水熱合成方法（WANGC，MQ，SU X.SynthesisofCdTeNanocrystalswithMercaptosuccinicAcidasStabilizer[J]. J.Nanosci.Nanotechnol.，2008,8, 4408-4414)合成發(fā)射波長為 530 ~550nm的CdTe孤s 和600~620皿的CdTe孤s水溶液；
[002引 2)分別在3~5血的發(fā)射波長為530~550nm的CdTe孤S和600~620nm的 CdTe孤S水溶液中加入0. 45~0. 75血、1~5ymol?己基-(3-二甲基氨基丙基） 碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)水溶液和0. 18~0. 30血、1~5ymol?L-iN-哲基硫代班巧酷亞胺 (Sul化-N服）水溶液，攬拌0. 5~比來活化CdTe量子點上的駿基；
[002引 3)然后，向步驟2)制備的活化后的發(fā)射波長為530~550皿的CdTe孤S水溶液 中加入90~110yL、5~10ymol?L-1的己肝病毒捕獲DNA;向步驟2制備的活化后的發(fā) 射波長為600~620皿的CdTeQ化水溶液中加入90~110yL、5~10ymol?L-1的丙肝 病毒捕獲DNA;分別繼續(xù)攬拌3~化；通過CdTe量子點上的駿基和病毒捕獲DNA上的氨基 結(jié)合形成穩(wěn)定的酷胺鍵來制備發(fā)射波長為530~550nmCdTe孤S標記的己肝病毒捕獲DNA 和發(fā)射波長為600~620皿CdTe孤S標記的丙肝病毒捕獲DNA;
[0024] 4)接著，分別向步驟3)制備的兩種溶液中加入2~5mL的異丙醇來沉淀CdTe 孤S標記的病毒捕獲DNA，未反應(yīng)的試劑通過高速離屯、10~20min去除（轉(zhuǎn)速為10000~ 15000巧m);
[0025] 5)最后分別用3~5血、5~lOmmol.L-iTris-肥1緩沖溶液溶解530~550nmCdTe 孤s標記的己肝病毒捕獲DNA和600~620nmCdTe孤s標記的丙肝病毒捕獲DM,之后放 在4~5°C冰箱里儲存?zhèn)溆茫?br>[0026] 上述步驟中所述的AuNPs標記的己肝病毒探針DNA和AuNPs標記的丙肝病毒探 針DNA，是由如下步驟制備得到；
[0027] 1)、通過巧樣酸鹽還原氯金酸（HA11CI4)來合成金納米粒子（AuNPs)。（GA0F,CUI P,CHENX，etal.ADNAhybridizationdetectionbasedonfluorescenceresonance energytransferbetweendye-dopedcore-shellsilicananoparticlesandgold nanoparticles[J].Analyst, 2011，136, 3973-3980);再分別使用 300 ~400 4L、1 ~ 5umol?L-i化is-HCl緩沖溶液來溶解乙肝病毒探針DNA和丙肝病毒探針DNA;
[002引 2)、將步驟^制備的溶解后的乙肝病毒探針DNA和丙肝病毒探針DNA溶液分別 與3~5mL的AuNPs溶液溜合，并避光過夜靜置；然后每隔30~40min分別向溜合物中 重復(fù)2~3次緩慢地加入50~60yL、3~4mol??；疌1水溶液來調(diào)節(jié)鹽濃度為300~ 400mmol?L-1;
[0029] 3)、經(jīng)過避光過夜靜置后，