一種基于NP-NiGdAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于NP-NiGdOAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體涉及一種AuNCsOBSA作為發(fā)光材料，利用納米多孔材料NP-NiGdOAu優(yōu)良的生物兼容性和大的比表面積作為基底材料增加抗體的固載量。用G0/AuNCs@BSA作為二抗標(biāo)記物，屬于電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌在其發(fā)生及發(fā)展過程中，胃癌細(xì)胞通常會產(chǎn)生酶、同功酶、激素和免疫球蛋白等物質(zhì)，這些與胃癌相關(guān)的物質(zhì)被稱為胃癌標(biāo)志物。這些標(biāo)志物不僅存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面，而且還可分泌入血液或體腔，因此可在體液或黏膜組織中測出胃癌標(biāo)志物，用于胃癌的早期預(yù)警或輔助診斷、分析病程、指導(dǎo)治療、監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后等。
[0003]目前檢測胃癌標(biāo)志物的分析方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和試劑盒法，但是所用的試劑有效期短，具有放射性污染，檢測周期長，靈敏度低，步驟繁瑣等缺點(diǎn)。為了克服以上傳統(tǒng)分析方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種特異性強(qiáng)，靈敏度高，無放射性污染，操作快速簡便的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的胃癌標(biāo)志物檢測方法存在的問題，提供一種簡單快速可靠的基于NP-NiGdOAu和G0/AuNCs@BSA的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對胃癌標(biāo)志物的快速、靈敏、特異、高效檢測。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種基于NP-NiGdOAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6μ L、0.5-2 mg mL—1的捕獲抗體基底材料NP-NiGd@Au/Ab i溶液與電極表面，4 °C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用ρΗ6.4-8.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同濃度的待測物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH6.4-8.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(5 )滴涂6 μ L 二抗標(biāo)記物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用ρΗ6.4-8.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干。
[0006]2.捕獲抗體基底材料NP-NiGdOAuAb1溶液的制備
(I)NP-NiGdiAu 的制備將NiGdAl合金放入過量的1.5?2.5 mol/L的氫氧化鈉溶液中，在室溫下化學(xué)腐蝕32?74 h，離心洗滌至中性，在真空干燥箱里干燥12?48 h，制得納米多孔NiGd ；
將80?120 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005?0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2?3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5?1.5%的檸檬酸三鈉水溶液，加熱回流10?20 min，待溶液顏色變成酒紅色，將溶液冷卻至室溫，得到的金納米粒子，4°C下避光保存。
[0007]將I?3 mg的NP-NiGd分散到I mL超純水中，加入0.5?L 5 mL金納米粒子，得到的混合溶液在室溫下振蕩12?32 h，離心分離，除去過量的金納米粒子，并將產(chǎn)物NP-NiGdiAu重新分散到I mL超純水中，制得基底材料NP-NiGdOAu溶液；
(2)捕獲抗體基底材料NP-NiGdOAu/Abi溶液的制備
在基底材料NP-NiGdOAu溶液中，加入10?100 μ L、I mg/mL的待測物抗體Ab1溶液，在4°C下振蕩孵化24 h，離心除去過量的待測物抗體Ab1，將產(chǎn)物分散到I mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得捕獲抗體基底材料NP-NiGdOAuAb1溶液，儲存在4 °0下備用。
[0008]3.二抗標(biāo)記物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液的制備
(1)氧化石墨烯GO的制備
將0.2?0.4 g石墨和1.5?2.1 g高錳酸鉀加入到帶有磁子的500 mL三口燒瓶中，加入提前混合好的體積比為9:1的濃硫酸和濃磷酸混合液，30?70°C下反應(yīng)6?24 h，反應(yīng)結(jié)束后，將樣品傾倒在預(yù)先凍好的30?50 mL的冰塊上，緩慢的攪拌下加入200?400μ L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫，反應(yīng)20?40 min，離心分離，并依次用0.2 mol/L的鹽酸溶液，乙醇洗滌三次，最后用乙醚離心洗滌一次，得到的固體在35 °C下真空干燥，得到棕黃色的固體粉末；
(2)金納米簇AuNCsOBSA的制備
將0.3?0.8 mmol氯金酸乙醇溶液和0.5 mmol巰基琥泊酸MSA通過通氮?dú)夤呐莸姆椒ㄅc100 mL甲醇混合均勻，在劇烈攪拌下逐滴加入20?30 mL，0.1?0.3 mol/L的新鮮配置的硼氫化鈉溶液，生成的深棕色的沉淀，離心分離并用體積比為1:4的水/乙醇溶液洗滌，在真空下干燥，得到MSAOAuNCs固體；
MSAOAuNCs和BSA以質(zhì)量比為1:10的比例加入5 mL水中，攪拌3?8 min，用I?3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為12，37 °C下攪拌6?8 h，得到的產(chǎn)物透析24 h，冷凍干燥得到 AuNCsiBSA ；
(3)二抗標(biāo)記物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液的制備
將I?3 mg的氧化石墨稀GO和2 mg的AuNCsOBSA加入2 mL超純水中，振蕩32?72 h，離心并重新分散到I mL，pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入0.05?0.15 mg待測物抗體Ab2，在4 °C下孵化12?32 h，離心并重新分散到I mL，pH 7.4的PBS緩沖溶液中，儲存在4 °C備用。
[0009]4.待測物的檢測方法
(1)使用電化學(xué)工作站的三電極體系進(jìn)行測試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，所制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器為工作電極，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設(shè)置為800 V，循環(huán)伏安掃描電位范圍為-1.8V?-0.6V，掃描速率為0.1 V/s ；
(2)在10mL、pH 6.4?8.4的含26?46 mmol/L過硫酸鉀的PBS溶液中，通過電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，檢測對不同濃度的待測物抗原產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替待測物抗原進(jìn)行檢測。
[0010]5.上述所述待測物，選自下列胃癌抗原之一:CEA、CA199、CA50、CA724、CA195、CA242、CYFRA2H。
[0011]本發(fā)明的有益成果
Cl)電化學(xué)發(fā)光傳感器制備方法，以AuNCsOBSA為發(fā)光材料，利用AuNCsOBSA良好的光學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建的傳感器具有更高的靈敏度；
(2)以NP-NiGdOAu作為捕獲抗體基底，G0/AuNCs@BSA作為二抗標(biāo)記物，NP-NiGdOAu和GO/AuNCsiBSA生物兼容性好，比表面積大等優(yōu)點(diǎn)有效地增加了抗體的固載量。
[0012](3)本發(fā)明制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器用于胃癌標(biāo)志物的檢測，操作簡單，反應(yīng)快速，信號響應(yīng)范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡單、快速、靈敏、特異性檢測。
[0013]實(shí)施例1一種基于NP-NiGdOAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6μ L、0.5 mg mL—1的捕獲抗體基底材料NP-NiGd@Au/Ab i溶液與電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4y L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用pH 6.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同濃度的待測物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH 6.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(5)滴涂6μ L 二抗標(biāo)記物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用pH 6.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干。
[0014]實(shí)施例2—種基于NP-NiGdOAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6μ L、I mg mL—1的捕獲抗體基底材料NP-NiGd@Au/Ab:溶液與電極表面，4°C
保存至干燥；
(3)滴加4y L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用pH 7.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同濃度的待測物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH 7.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干；
(5)滴涂6μ L 二抗標(biāo)記物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用pH 7.4的PBS溶液沖洗電極表面，4 °C晾干。
[0015]實(shí)施例3—種基于NP-NiGdOAu的胃癌標(biāo)志物金納米簇電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方