后加入慶 大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液50yL，再加入細(xì)胞上清液50yL和羊抗鼠IgG-HRP50yL，于37°C反應(yīng) 30min，洗板，再加入底物液顯色液100yL，于25°C下避光反應(yīng)15min，再加入終止液50yL， 測(cè)定〇D45(J直下降到對(duì)照孔的50%以下，判為陽(yáng)性，經(jīng)2~3次檢測(cè)都為陽(yáng)性的孔，立即用 有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。
[0047] D)單克隆抗體制備：將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清 液用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8~10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL/ 只，7~10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1~2X1〇7只，7~10日后抽取小鼠腹水，離心取上 清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0048] 5?磁標(biāo)抗體的制備
[0049]A)磁珠活化
[0050]表面有-C00H基團(tuán)的磁珠（購(gòu)于DYNAL，粒徑為2. 8ym)，其含量是0?leq/g~ 0. 3eq/g，取100yL磁珠，用含有pH5. 0、0. 05%的吐溫-20的濃度為25mmol/L的2- (N-嗎 啉）乙磺酸一水合物（MES)lOOmL洗滌兩次，磁分離后移除上清；磁珠活化前，用4°C貯存的 上述MES溶液分別配制50mmol/L的EDC和NHS溶液；分別向裝有磁珠的離心管中加入新配 置的EDC和NHS溶液各50yL，渦旋混勾，室溫活化30min;將離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁 分離4min，移除上清液，再向其中加入100yL、pH5. 0、25mmol/L的MES清洗2~3次后即 可得到表面有羧基活化的磁珠。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0051] B)磁珠偶聯(lián)慶大霉素單克隆抗體的制備
[0052] 將6yg~12yg慶大霉素單克隆抗體溶解到60yL、pH5. 0、25mmol/L的MES中， 向其中加入3mg~6mg活化的磁珠，并用上述濃度MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100yL，輕柔地 混勻磁珠與慶大霉素單克隆抗體；室溫條件下偶聯(lián)30min~40min或4°C偶聯(lián)2h，該期間 可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離3min~5min，移 除上清液；為了淬滅未反應(yīng)的-COOH，可加入100yL，pH7. 2~pH7. 6的三羥甲基氨基甲烷 (TRIS)反應(yīng)15min或100yL、pH8. 0、乙醇胺濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液封閉磁珠；用 100yL、0. 1 %~0. 3%BSA、0. 1 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液清洗封閉好的磁珠3~5次，將 磁珠復(fù)溶于含0. 1%~0. 5%的BSA、0. 01%~0. 1%吐溫-20、0. 02%NaNj^磷酸鹽緩沖液 中，于2°C~8°C保藏。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0053] 實(shí)施例2 :試劑盒的組建
[0054] 組建檢測(cè)慶大霉素類藥物的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，使其含有下列組分：
[0055] 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的慶大霉素半抗原的標(biāo)記物
[0056] 酶標(biāo)抗原稀釋液
[0057] 慶大霉素單克隆抗體與磁珠的偶聯(lián)物
[0058] 磁標(biāo)抗體稀釋液
[0059] 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為：0 yg/L、0. 1yg/L、0. 3yg/L、0. 6yg/L、 1.8 1^/1、5.41^/1，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為口117.4，含0.05%吐溫-20,0.05111〇1/1的磷酸鹽緩沖 液。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0060] 濃縮復(fù)溶液為濃縮磷酸鹽緩沖液，是每升含5. 0g~8. 0g的NaH2P04 ? 2H20、 30. 0g~35. 0gNa2HP04 ? 12H20 的水溶液。
[0061] 濃縮洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)0? 03 %~0? 08 %吐溫-20的pH= 7. 4~7. 6， 0. lmol/L~0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0062] 實(shí)施例3 :樣品中慶大霉素殘留量的檢測(cè)
[0063] 1?樣品前處理方法
[0064](1)牛奶
[0065] 取50yL鮮牛奶樣品加入950yL樣品稀釋液（用去離子水將濃縮復(fù)溶液按1:1 體積比進(jìn)行稀釋），渦動(dòng)混勻，取該溶液用于樣品分析。
[0066] (2)奶粉
[0067] 稱取1. 0g±0. 05g奶粉樣品，加入5mL樣品稀釋液，渦動(dòng)混勾，從中取出200yL加 入至600yL樣品稀釋液中，渦動(dòng)混勻，取該溶液用于樣品分析。
[0068] 2?用試劑盒檢測(cè)與結(jié)果分析
[0069] 將酶標(biāo)抗原與酶標(biāo)抗原稀釋液按照1:10~1:20的體積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué)發(fā) 光檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；將磁標(biāo)抗體與磁標(biāo)抗體稀釋液按照1:10~1:20的體 積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；對(duì)每個(gè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置樣 品架上的位置，輸入樣品信息和需要檢測(cè)的測(cè)試項(xiàng)目名稱；將樣品管/標(biāo)準(zhǔn)品管放入已設(shè) 定好的樣品架上，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀依次吸取50yL酶標(biāo)抗原、50yL待測(cè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品和 50yL磁標(biāo)抗體加入到反應(yīng)杯中，混勻，并在室溫下反應(yīng)15min，再通過(guò)清洗裝置進(jìn)行磁分 離4min，再用洗滌液為pH7. 2~pH7. 6、300yL~500yL的磷酸鹽緩沖液清洗3次~5次， 再加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各50yL，檢測(cè)其發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度（RLU)，樣品中慶大霉 素的含量與RLU成負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以通過(guò)RLU結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算慶大霉素的濃度。
[0070] 本發(fā)明采用6個(gè)慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品（0yg/L、0. 1yg/L、0. 3yg/L、0. 6yg/L、 1. 8yg/L、5. 4yg/L)進(jìn)行曲線測(cè)繪。將所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品RLU值的平均值除以第一個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值（RLU。值）再乘以100,以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（％ ) =RLU/RLU。為縱坐標(biāo)，慶大 霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。標(biāo)準(zhǔn)曲 線如圖3所示。
[0071]實(shí)施例4 :試劑盒質(zhì)量的測(cè)定
[0072] 1?試劑盒的檢測(cè)限
[0073] 試劑盒檢測(cè)限的定義為：測(cè)定20次陰性樣品，測(cè)定的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差。該 試劑盒的檢測(cè)限為：牛奶2yg/L，奶粉5yg/kg。
[0074] 2.試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度
[0075] 準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真值間的符合程度，試劑盒準(zhǔn)確度常用回收率表示。精密度 又稱可重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。
[0076] 按照實(shí)施例3的樣品前處理方法，以2yg/L、4yg/L和8yg/L濃度的慶大霉素 對(duì)牛奶樣品進(jìn)行添加，以5yg/kg、10yg/kg和20yg/kg濃度的慶大霉素對(duì)奶粉樣品進(jìn)行 添加，每種樣品每個(gè)濃度測(cè)定4個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品的回收率及精密 度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0077] 表1準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定
[0079]
[0080] 從表1可知，牛奶樣品中慶大霉素的添加回收率范圍在72. 5 %~108. 8 %，奶粉樣 品中慶大霉素的添加回收率范圍在74. 0%~106. 0%。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。
[0081] 3.特異性
[0082] 以慶大霉素作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)慶大霉素的交叉反應(yīng)率為100%，用于抗體交叉反應(yīng)性 研宄的藥物均為與慶大霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物：慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉 素、新霉素。按試劑盒步驟操作，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計(jì)算各藥物的50%抑制濃度 (IC5(I)。交叉反應(yīng)率（％CR)即為抗體對(duì)慶大霉素的IC5(I與抗體對(duì)慶大霉素競(jìng)爭(zhēng)物的IC5(I 之比的百分?jǐn)?shù)，按下式進(jìn)行計(jì)算：
[0084] 結(jié)果列于表2:
[0085] 表2試劑盒特異性試驗(yàn)
[0087] 從表2可以看出，試劑盒對(duì)慶大霉素具有較高的特異性，對(duì)與慶大霉素結(jié)構(gòu)或者 功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物均無(wú)交叉反應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種慶大霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括的試劑有：酶標(biāo)抗 原，酶標(biāo)抗原稀釋液，磁標(biāo)抗體，磁標(biāo)抗體稀釋液，慶大霉素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，化學(xué)發(fā)光底物 A、B液，濃縮復(fù)溶液，濃縮洗滌液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述酶標(biāo)抗原是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的慶大霉素半抗原的標(biāo)記物，慶大霉素半抗原是用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基 氧化成酮基，得到單酮基慶大霉素，然后單酮基慶大霉素與對(duì)甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到 帶有羧基的慶大霉素半抗原產(chǎn)物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述磁標(biāo)抗體是慶大霉素單克隆抗體 與磁珠偶聯(lián)得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述磁珠表面含有-OH、-COOH或-NH2 活性基團(tuán)。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述慶大霉素單克隆抗體是由慶大霉 素半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述化學(xué)發(fā)光底物A液為含有魯米諾 和對(duì)甲苯酚的三羥甲基氨基甲烷的溶液?；瘜W(xué)發(fā)光液B液為含有檸檬酸、無(wú)水Na2HPO4* CO(NH2) 2 ?H2O2 的水溶液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮復(fù) 溶液和濃縮洗滌液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于可以配套化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)慶大霉素 的殘留量。9. 一種利用權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)慶大霉素的方法，包括下列步 驟： 1) 將酶標(biāo)抗原與酶標(biāo)抗原稀釋液按照1:10~1:20的體積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中； 2) 將磁標(biāo)抗體與磁標(biāo)抗體稀釋液按照1:10~1:20的體積比進(jìn)行稀釋，裝入化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)儀磁標(biāo)抗體工作液容器中； 3) 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀分別吸取30yL~60yL酶標(biāo)抗原、30yL~60yL樣品提取液和 30yL~60yL磁標(biāo)抗體，依次加入到反應(yīng)杯存儲(chǔ)裝置中，在室溫下反應(yīng)15min，再通過(guò)清洗 裝置進(jìn)行磁分離2min~4min，棄上清液后用洗滌液300yL~500yL對(duì)復(fù)合物沉淀清洗3 次~5次； 4) 將分離好的復(fù)合物放入測(cè)量暗箱，加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各50yL，檢測(cè)發(fā)出 的相對(duì)光強(qiáng)度（RLU)，樣品中慶大霉素的含量與RLU成負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以通過(guò)RLU標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算慶大霉素的殘留濃度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及了檢測(cè)慶大霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原稀釋液，磁標(biāo)抗體，磁標(biāo)抗體稀釋液，慶大霉素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，化學(xué)發(fā)光底物A、B液，濃縮復(fù)溶液，濃縮洗滌液。酶標(biāo)抗原是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的慶大霉素半抗原的標(biāo)記物，用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基氧化成酮基，得到單酮基慶大霉素，然后單酮基慶大霉素與對(duì)甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到帶有羧基的慶大霉素半抗原產(chǎn)物，磁標(biāo)抗體是慶大霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒配套化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)牛奶和奶粉中慶大霉素的方法，本方法對(duì)慶大霉素檢測(cè)具有較高的靈敏度、特異性和較短的檢測(cè)時(shí)間。
【IPC分類】G01N33/553, G01N21/76, G01N33/577
【公開(kāi)號(hào)】CN104897895
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510175688
【發(fā)明人】聶雯瑩, 馮靜, 杜美紅, 羅曉琴, 朱亮亮, 萬(wàn)宇平, 孫倩倩, 王然
【申請(qǐng)人】北京勤邦生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年4月14日