一種林可霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其檢測方法。特別是檢測牛奶、奶粉等樣 品中林可霉素殘留量的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。屬于免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 林可霉素（LinC〇mycin，LIN)又稱潔霉素，是由林肯鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺 類抗生素。林可霉素具有較強的抑菌活性，主要作用于革蘭氏陽性細菌，是一個RNA依賴的 乙酰膽堿酯酶抑制劑。林可霉素作為飼料添加劑，有提高增重速率、改善飼料報酬的功效。 使用方法主要是添加林可霉素制品混合于飼料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治療 奶牛乳房炎，兩種給藥方式都會造成藥物在牛乳中殘留。據(jù)文獻報道對奶牛乳房灌注給藥 以后，其排泄主要經(jīng)乳腺隨乳汁排出，可能導(dǎo)致在牛奶產(chǎn)品中相當(dāng)水平的藥物殘留。我國食 品衛(wèi)生法規(guī)定，在應(yīng)用抗生素期間和停藥后5天內(nèi)的乳不能食用，牛奶中殘留的抗生素會 危害飲用者身體健康。因此，各國對其殘留均作出限量要求。歐盟和中國農(nóng)業(yè)部235號文件 規(guī)定食品中林可霉素最大殘留限量：牛奶中150yg/L，肌肉中100yg/kg，肝臟中500yg/ kg〇
[0003] 林可霉素殘留量常用的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法（HPLC)、氣相 色譜法（GC)、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法（HPLC-MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)、 氮磷氣相色譜檢測法、薄層色譜法（TLC)、免疫測定法等。由于昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜繁瑣 的操作過程，以及對檢驗人員的高技能要求，使得上述儀器檢測方法不適合大量樣品的篩 查。酶聯(lián)免疫檢測法和膠體金免疫層析檢測法雖然屬于快速篩檢方法，但由于方法靈敏度 較低，假陰性率和假陽性率較高，逐漸被靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測時間短的化學(xué)發(fā)光免疫 檢測方法所替代，磁免疫化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑配套磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測食品中林 可霉素的殘留，實現(xiàn)檢測過程的全自動化，減少人為操作誤差，靈敏度可達到〇. 3yg/L，準(zhǔn) 確度高，檢測成本低，適用于大批量樣品中林可霉素殘留量的篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題自在于提供一種林可霉素檢測試劑盒，采用該試劑盒 進行林可霉素的檢測時具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種林可霉素的檢測方法，采用該試劑盒配合化學(xué) 發(fā)光檢測儀進行林可霉素的檢測時不僅具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，而且實現(xiàn)了 全自動化檢測，縮短檢測時間，減少人為操作誤差。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種林可霉素檢測試劑盒，其包含的主要試劑有：酶 標(biāo)抗原、酶標(biāo)抗原稀釋液、磁標(biāo)抗體、磁標(biāo)抗體稀釋液、林可霉素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、化學(xué)發(fā) 光底物A、B液。
[0007] 所述的酶標(biāo)抗原是辣根過氧化物酶標(biāo)記的林可霉素半抗原的標(biāo)記物，林可霉素半 抗原是由林可霉素中的醇羥基經(jīng)重鉻酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再與 氨基丁酸進行縮合反應(yīng)，得到四碳鏈羧基半抗原。
[0008] 所述磁標(biāo)抗體是林可霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到。
[0009] 所述磁珠表面含有-0H、-C00H或_順2活性基團。
[0010] 所述林可霉素單克隆抗體是由林可霉素半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作 為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得。
[0011] 所述化學(xué)發(fā)光底物A液為含有魯米諾和對甲苯酚的三羥甲基氨基甲烷的溶液?；?學(xué)發(fā)光液B液為含有檸檬酸、無水Na2HP0jPC0(NH2)2 ?H202的水溶液。
[0012] 所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮復(fù)溶液和濃縮洗滌液。
[0013] 所述試劑盒可以配套化學(xué)發(fā)光檢測儀進行動物源性樣品中林可霉素殘留量的檢 測。
[0014] 本發(fā)明還提供一種利用試劑盒配套化學(xué)發(fā)光儀檢測林可霉素的方法，包括下列步 驟：
[0015] 1)將酶標(biāo)抗原與酶標(biāo)抗原稀釋液按照1:10~1:20的體積比進行稀釋，裝入化學(xué) 發(fā)光檢測儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；
[0016] 2)將磁標(biāo)抗體與磁標(biāo)抗體稀釋液按照1:10~1:20的體積比進行稀釋，裝入化學(xué) 發(fā)光檢測儀磁標(biāo)抗體工作液容器中；
[0017] 3)化學(xué)發(fā)光檢測儀自分別動吸取30yL~80yL酶標(biāo)抗原、30yL~80yL樣品 提取液和30yL~80yL磁標(biāo)抗體，依次加入到反應(yīng)區(qū)，在室溫下反應(yīng)15min，在磁分離區(qū)分 離4min，棄上清液后用洗滌液300yL~500yL對復(fù)合物沉淀清洗3~5次；
[0018] 4)將分離好的復(fù)合物放入測量暗箱，加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各30yL~ 80yL，檢測發(fā)出的相對光強度（RLU)，樣品中林可霉素的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以 通過RLU標(biāo)準(zhǔn)曲線計算林可霉素的殘留濃度。
[0019] 本發(fā)明中分析測試方法所用的化學(xué)發(fā)光檢測儀包括電源電路、反應(yīng)杯存儲裝置、 樣品存儲裝置、樣品臂、試劑存儲裝置、試劑臂、運動式冷藏裝置、清洗裝置、自動注射泵、微 光檢測器，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結(jié)果匯 總、質(zhì)量控制、結(jié)果存儲和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告 結(jié)果，自動生成并儲存和更新功能，兩點自動修正標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020] 本發(fā)明所述的酶標(biāo)抗原是辣根過氧化物酶標(biāo)記的林可霉素半抗原的標(biāo)記物，其保 存于含？耵.2~7.6，含吐溫0.03%~0.05%吐溫-20,0.02111〇1/1~0.05111〇1/1的磷酸鹽 緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0021] 所述酶標(biāo)抗原稀釋液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04濃度為0? 01mol/L、NaCl濃度為 0? 25mol/L的緩沖溶液。
[0022] 所述磁標(biāo)抗體是林可霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到。磁珠表面基團的含量是 0?leq/g~0? 3eq/g，所述磁標(biāo)抗體保存在pH7. 2~7. 6,含吐溫0? 1 %~0? 3 %吐溫-20， 0. 02mol/L~0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0023] 所述磁標(biāo)抗體稀釋液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04&度為0? 01mol/L、NaCl濃度為 0? 25mol/L的緩沖溶液。
[0024] 所述林可霉素單克隆抗體通過林可霉素半抗原與牛血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作 為免疫原免疫Balb/c小鼠、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選、亞克隆和小鼠腹水的效價測定 得到。
[0025] 所述化學(xué)發(fā)光底物A液為魯米諾含量為0. 01yg/L~0. 03yg/L、對甲苯酚含量 為0? 001yg/L~0? 005yg/L、pH為8. 0~9. 0的三輕甲基氨基甲燒溶液，B液為每100mL 水溶液含檸檬酸1.7§~2.3§，無水似2即0 42.2§~3.(^和體積百分含量為0.75%的 C0(NH2)2 ?H2020. 5mL~0? 8mL〇
[0026] 所述林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為：0yg/L、0. 3yg/L、0. 9yg/L、l. 8yg/L、 5.41^/1、10.8 1^/1，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為口117.4，含0.05%吐溫-20,0.05111〇1/1的磷酸鹽緩沖 液。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0027] 所述濃縮復(fù)溶液具體為濃縮磷酸鹽緩沖液，是每升含5.Og~8.Og的 NaH2P04 ? 2H20、30. 0g~35. 0gNa2HP04 ? 12H20 的水溶液。
[0028] 所述濃縮洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)0? 03 %~0? 08 %吐溫-20的pH= 7. 4~7. 6， 0.lmol/L~0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0029] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0030] 1)本發(fā)明試劑盒的具有較高的靈敏度和特異性，對林可霉素的檢測靈敏度可達到 0. 3yg/L〇
[0031] 2)本發(fā)明試劑盒配套化學(xué)發(fā)光檢測儀對樣品中林可霉素殘留量進行檢測，實現(xiàn)檢 測過程的全自動化，減少人為操作誤差，檢測時間短，僅需20min即可完成對樣品中林可霉 素殘留量的檢測。
【附圖說明】
[0032] 圖1為林可霉素半抗原合成反應(yīng)式。
[0033] 圖2為林可霉素半抗原核磁共振氫譜圖。
[0034] 圖3為本發(fā)明磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1 :試劑盒具體組分的制備
[0036] L林可霉素半抗原合成
[0037] 林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羥基經(jīng)重鉻酸吡啶氧化后得到酮基林可霉 素，酮基林可霉素再與氨基丁酸進行縮合反應(yīng)，得到四碳鏈羧基半抗原。取〇. 8g~1. 2g林 可霉素加入到乙腈中溶解，再加入0. 80g~0. 85g重鉻酸吡啶，攪拌，加入0. 5mL~1.lmL 乙酸酐和〇. 3mL~0. 7mL乙酸，室溫攪拌6h，待反應(yīng)完全，停止反應(yīng)并蒸干，上硅膠柱純化， 乙酸乙酯：石油醚=1:1洗脫分離，得到產(chǎn)物1。取產(chǎn)物1加甲醇溶解，再加含1. 〇g~1. 4g 氨基丁酸的水溶液2mL~4mL和0. 5g~0. 8g氫氧化鉀的水溶液2mL，于60°C加熱反應(yīng)7h， 反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，旋蒸，加水，調(diào)節(jié)pH值至6,加乙酸乙酯萃取，蒸干，得到無色油狀物， 再加乙醇重結(jié)晶得到林可霉素半抗原產(chǎn)物0. 4g~0. 6g。合成反應(yīng)式如圖1所示。
[0038] 取上述林可霉素半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁氫譜測定，如圖2所示，化學(xué)位移S=llppm 的位置為羧基氫共振吸收峰，化學(xué)位移S=2.3、1.6、1.3ppm的位置為間隔臂上亞甲基的 氫共振吸收峰，證明間隔臂連接成功，林可霉素半抗原合成成功。
[0039] 2?酶標(biāo)抗原的制備
[0040] 取lOmg~15mg林可霉素半抗原，溶解于lmL~1. 5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF) 中；取27mg~32mg二氯乙烷（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0?lmL~0? 3mL水充分 溶解后于加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A;稱取辣根過氧化物酶 (HRP) 30mg~50mg，使之充分溶解在pH7. 2, 3. 8mL的磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢 滴加到HRP溶液中，并于室溫下攪拌24h;用0.Olmol/L的磷酸鹽緩沖液于4°C透析3天，每 天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到林可霉素酶標(biāo)抗原；分裝，于-20°C保存 備用。
[0041] 3.免疫原的制備
[0042] 將HRP30mg~50mg替換為牛血清白蛋白（BSA)40mg~60mg，制備方法同上，得到 免疫原。
[0043] 4.林可霉素單克隆抗體的制備
[0044] A)動物免疫：用上述制備出的免疫原（RAC-BSA)按100yg/只，以生理鹽水溶解 免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠，初次免 疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以 免疫復(fù)合物100Ug/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0045] B)細胞融合：按常規(guī)方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨 髓瘤細胞（SP2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000)進行融合，用 HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C，5 %C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進行全換液。
[0046] C)雜交瘤細胞的篩選：細胞融合后，待細胞長