動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS)測定動物血清中 次野鳶尾黃素含量的方法，屬于藥物分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 射干是鳶尾科射干屬植物射干的干燥根莖，為常用藥材，具有清熱解毒、利咽祛痰 的功效，臨床主要用于咽喉疼痛、痰咳氣喘等癥。次野鳶尾黃素是射干中重要的異黃酮類成 分之一，也是藥典中評價射干藥材質(zhì)量的標(biāo)示性成分。目前，次野鳶尾黃素的含量測定多見 于體外測定，而在動物體內(nèi)血藥濃度的檢測方法尚未見報道。近年來，越來越多的研宄表明 射干中次野鳶尾黃素等異黃酮類物質(zhì)具有多種藥理作用，如抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及抗炎 等活性，而次野鳶尾黃素在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄過程有待進(jìn)一步研宄，因此， 次野鳶尾黃素在血清中的含量測定方法亟需研宄。
[0003] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)是二十世紀(jì)九十年的發(fā)展起來的一 門綜合分析技術(shù)，LC的高分離效能與MS的高靈敏度、高選擇性使其成為當(dāng)代最重要的分離 和鑒定分析方法之一，同時近年來也成為藥物研宄中最可靠實用的分析手段。該分析技術(shù) 需樣量少、檢測限低，尤其適用于藥物在機(jī)體代謝等因素的作用下所產(chǎn)生的分解物或代謝 物的結(jié)構(gòu)研宄和量的變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了 一種方便快捷、準(zhǔn)確的檢測 動物血清中次野鳶尾黃素的含量的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來具體實現(xiàn)：
[0006] -種動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，將高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的含量測定，以山奈酚為內(nèi)標(biāo)，測定動物血清中次野鳶尾 黃素的含量。
[0007] 作為優(yōu)選方案，上述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，具體步驟如 下：
[0008] 1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)液的配制
[0009] 精密稱取次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容得到次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品 溶液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容得到內(nèi)標(biāo)溶液；
[0010] 2)標(biāo)準(zhǔn)血清溶液的制備
[0011] 向動物空白血清中加入次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，加NaCl， 渦旋混勻，加乙酸乙酯，充分渦旋混勻，離心分離有機(jī)層，于40°C水浴中氮氣吹干，加超純水 溶解殘渣，過微孔濾膜，得標(biāo)準(zhǔn)血清溶液；
[0012] 3)供試品溶液的制備
[0013] 取給藥后的動物血清，加入內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，加入NaCl，渦旋混勻，加乙酸乙 酯，充分渦旋混勻，離心分離有機(jī)層，于40°C水浴中氮氣吹干，加超純水溶解殘渣，過微孔濾 膜，得供試品溶液；
[0014] 4)測定
[0015] 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)血清溶液和供試品溶液各2 y 1，用微孔濾膜過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS 分析。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟2)中，空白血清：次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液：內(nèi)標(biāo)溶液： NaCl :乙酸乙酯為 0? 5ml :10 y L :10 y L :0? lg :2mL。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟3)中，空白血清：內(nèi)標(biāo)溶液：NaCl :乙酸乙酯為0.5ml : 10 u L :0. lg :2mL。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述微孔濾膜有孔徑為0. 22 ym。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟4)中，測定條件為：
[0020] 色譜條件：C18反相色譜柱；流動相：乙腈和0. 1%甲酸水溶液，二元梯度洗脫；柱 溫30°C ;進(jìn)樣體積為2uL ;
[0021] 色譜條件：采用電噴霧電離源；毛細(xì)管電壓為4kv ;霧化溫度：350°C ;霧化氣： 50kPa ;干燥氣體流速：10L ? mirT1;碰撞能量：48v ;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測。
[0022] 所述梯度洗脫的程序優(yōu)選為：0min- 2min- 6min-lOmin- 15min、乙腈15% -25%- 40%- 80%- 15% ;流速為 0? 4mL?mirT1。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟4)中，測定后，根據(jù)得到的總離子流圖和質(zhì)譜圖，測定峰 面積，以次野鳶尾黃素和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為Y軸對血清中次野鳶尾黃素濃度為X軸進(jìn)行線 性回歸，得線性關(guān)系和回歸方程，計算待測物濃度。
[0024] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟1)，具體為：精密稱取次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇 溶解并定容得到〇. 1 U g mr1次野鳶尾黃素溶液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容 得到0. 1 y g ? mr1內(nèi)標(biāo)溶液。
[0025] 上述所述動物可為家兔、鼠及禽類等。
[0026] 本發(fā)明提供的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法方法，將高效液相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的含量測定，以山奈酚為內(nèi)標(biāo)，能準(zhǔn)確 測定動物血清中次野鳶尾黃素的含量。本發(fā)明方法樣品處理方法簡便易操作，方法回收率 滿足分析檢測要求。采用本發(fā)明將HPLC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的檢 測，被測組分檢測靈敏度提高，分離度好，分析時間短，需樣量少，溶劑用量少，含量測定結(jié) 果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性好。次野鳶尾黃素具有多種藥理活性，如抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等 活性。本發(fā)明能方便快捷、準(zhǔn)確的檢測動物血清中次野鳶尾黃素的含量，為次野鳶尾黃素在 動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)和生物等效性研宄奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0027] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028] 實施例1 :
[0029] 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)，申請對本發(fā)明方法進(jìn)行了以下實驗分析。
[0030] 本發(fā)明所使用的射干提取物由蘭州畜牧與獸藥研宄所制備，以山奈酚為內(nèi)標(biāo)物 質(zhì)。
[0031] 1材料與方法
[0032]1. 1儀器6410型三重四極桿質(zhì)譜（美國Aglient)，200型高效液相色譜 儀（美國Aglient)，電噴霧離子源（ESI)，高速離心機(jī)（Allegra X-15R)，漩渦混合器 (Equl-Glascol)〇
[0033] 1. 2藥品與試劑次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；射干提取物 (蘭州畜牧與獸藥研宄所制備）；山奈酚（sigma);乙腈為色譜純，乙酸乙酯為化學(xué)純，甲酸 為優(yōu)級純，水為超純水。
[0034] 1. 3色譜條件色譜柱為Aglient Zorbax 018柱（2. lX50mm，3. 5um);流動相為乙 腈和0. 1 %甲酸水，二元梯度洗脫，具體見表1。流速0. 4mL ? mirT1;柱溫30°C ;進(jìn)樣體積為 2uL〇
[0035] 表1流動相梯度洗脫
【主權(quán)項】
1. 一種動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：將高效液相色譜-質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的含量測定，以山奈酚為內(nèi)標(biāo)，測定動物血清 中次野鳶尾黃素的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：具 體步驟如下： 1) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)液的配制 精密稱取次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容得到次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶 液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容得到內(nèi)標(biāo)溶液； 2) 標(biāo)準(zhǔn)血清溶液的制備 向動物空白血清中加入次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，加NaCl，渦旋 混勻，加乙酸乙酯，充分渦旋混勻，離心分離有機(jī)層，于40°C水浴中氮氣吹干，加超純水溶解 殘渣，過微孔濾膜，得標(biāo)準(zhǔn)血清溶液； 3) 供試品溶液的制備 取給藥后的動物血清，加入內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，加入NaCl，渦旋混勻，加乙酸乙酯，充 分渦旋混勻，離心分離有機(jī)層，于40°C水浴中氮氣吹干，加超純水溶解殘渣，過微孔濾膜，得 供試品溶液； 4) 測定 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)血清溶液和供試品溶液各2 y 1，用微孔濾膜過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS分 析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：所 述步驟2)中，空白血清：次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液：內(nèi)標(biāo)溶液：NaCl :乙酸乙酯為0. 5ml : 10uL:10]iL:0.1g :2mL〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：所 述步驟3)中，空白血清：內(nèi)標(biāo)溶液：NaCl :乙酸乙酯為0. 5ml :10yL :0.1 g :2mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：所 述微孔濾膜有孔徑為〇. 22 y m。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：所 述步驟4)中，測定條件為： 色譜條件：C18反相色譜柱；流動相：乙腈和0. 1%甲酸水溶液，二元梯度洗脫；柱溫 30°C ;進(jìn)樣體積為2uL ; 色譜條件：采用電噴霧電離源；毛細(xì)管電壓為4kv ;霧化溫度：350°C ;霧化氣：50kPa ; 干燥氣體流速：l〇L ? miiT1;碰撞能量：48v ;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特 征在于：所述梯度洗脫的程序為：〇min - 2min - 6min - IOmin - 15min、乙腈 15% - 25% - 40% - 80% - 15% ;流速為 0? 4mL ? mirT1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在于：所 述步驟4)中，測定后，根據(jù)得到的總離子流圖和質(zhì)譜圖，測定峰面積，以次野鳶尾黃素和內(nèi) 標(biāo)的峰面積比為Y軸對血清中次野鳶尾黃素濃度為X軸進(jìn)行線性回歸，得線性關(guān)系和回歸 方程，計算待測物濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，其特征在 于：所述步驟1)，具體為：精密稱取次野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容得 到0.Iyg^mr1次野鳶尾黃素溶液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容得到 0.Iyg?mr1內(nèi)標(biāo)溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，將高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的含量測定，以山奈酚為內(nèi)標(biāo)，測定動物血清中次野鳶尾黃素的含量。本發(fā)明方法樣品處理方法簡便易操作，方法回收率滿足分析檢測要求。采用本發(fā)明將HPLC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于動物血清中次野鳶尾黃素的檢測，被測組分檢測靈敏度提高，分離度好，分析時間短，需樣量少，溶劑用量少，含量測定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性好。
【IPC分類】G01N30-06, G01N30-02
【公開號】CN104849359
【申請?zhí)枴緾N201510055264
【發(fā)明人】辛蕊華, 李維, 鄭繼方, 羅永江, 謝家聲, 王貴波, 羅超應(yīng), 李錦宇
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年2月3日