一種富含玉米黃素的錦燈籠肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種富含玉米黃素的錦燈籠肽的制備方法及其抗氧化活性，具體地說利用錦燈籠果實制備具有抗氧化活性的富含玉米黃素的生物活性肽。利用本發(fā)明的方法不僅將錦燈籠果實的蛋白質(zhì)制備成為小分子的肽，而且富集了錦燈籠中玉米黃素；所制備的產(chǎn)品不僅具有抗氧化活性，而且可緩解眼疲勞、對于老年性黃斑變性、白內(nèi)障等眼疾具有很好的預(yù)防作用，可應(yīng)用于食品保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種富含玉米黃素的錦燈籠肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種富含玉米黃素的錦燈籠肽制備方法及其抗氧化活性，具體地說利用錦燈籠果實制備具有抗氧化的富含玉米黃素的活性肽。利用本發(fā)明的方法不僅可將錦燈籠果實的蛋白質(zhì)制備成為小分子的肽，而且保留了錦燈籠中玉米黃素；所制備的產(chǎn)品不僅具有抗氧化活性，而且對于老年性黃斑變性、白內(nèi)障等眼疾具有很好的預(yù)防作用，可應(yīng)用于食品保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景。
【背景技術(shù)】
[0002]人體在氧的利用過程中，會因各種內(nèi)因性和外因性因素而產(chǎn)生各種活性氧和自由基，這些自由基在維持機體正常代謝和疾病防治中起到積極的作用。但是過量的自由基可以攻擊生物膜不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)等，引發(fā)氧化損傷，使機體抵抗力下降，從而導(dǎo)致各種疾病發(fā)生，如癌癥和老化等病理性變化。人體可通過補充外源性抗氧化物質(zhì)消除過量自由基，從而達到增強身體抵抗力、促進機體健康的目的。不同的抗氧化物質(zhì)可清除不同的自由基，機制和效果各不相同。目前有一些人工合成的抗氧化物質(zhì)，但是長期服用會有一定副作用，因此從動植物中篩選的天然抗氧化物質(zhì)更具有吸引力(FoodChemistry 94 (2006)550 - 557 ；Comprehensive Reviews in FoodScience and FoodSafety, 10(2011)221-247)。生物活性肽是一類重要的抗氧化物質(zhì)。
[0003]錦燈籠，為爺科植物酸衆(zhòng)(Physalis alkekeng L.var.franchetii),又名酸衆(zhòng)草、燈籠草、紅姑娘、掛金燈。果實味甘，微酸。其干燥宿存萼或帶果實的宿存萼作為錦燈籠藥用，具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿的功效。藥材栽培或野生，廣泛分布于全國各地，資源豐
邑O
[0004]錦燈籠果實中含有`豐富的類胡蘿卜素，以玉米黃素為主。玉米黃素(Zeaxanthin，3，3’ - 二羥基-β-胡蘿卜素，C4tlH56O2),亦稱玉米黃質(zhì)，是帶有羥基的類胡蘿卜素黃質(zhì)。錦燈籠果實中的玉米黃素是全反式(3R，3’R)_玉米黃素。從安全角度考慮從植物中直接提取的 3R, 3’R-玉米黃素是最安全可靠的。(Food and Chemical Toxicology 49 (2011) 2841 -2848)。人體無法自身合成玉米黃素，只能通過食物攝取，對于老年性黃斑變性(AMD)高風(fēng)險人群僅依靠從食品中獲取玉米黃素是非常有限的，需要額外補充劑補充玉米黃質(zhì)。
[0005]玉米黃素與葉黃素是人體視網(wǎng)膜的黃斑部位唯一的類胡蘿卜素，是黃斑色素的主要組成色素(Clinics in Dermatology (2009) 27，195-201 )。玉米黃素主要集中在視網(wǎng)膜的黃斑區(qū)中心，具有特異性的吸收紫外線中藍光的作用，可避免藍光對視網(wǎng)膜損傷。玉米黃素還具有抗氧化的作用，可防止視網(wǎng)膜、上皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜等由于氧化引起的眼損傷，因此玉米黃素對于人體視力和眼睛的營養(yǎng)保護具有重要的作用(Br J Ophthalmol 199983:867-877)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的富含玉米黃素的錦燈籠肽的制備方法:本發(fā)明以錦燈籠果實為原料，通過提取、分離、酶解等方法制備富含玉米黃素的錦燈籠肽，錦燈籠肽具有抗氧化活性，可應(yīng)用于食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]以錦燈籠果實為原料，通過提取、蛋白質(zhì)沉淀、分離、酶解、干燥等步驟，獲得富含玉米黃素的錦燈籠肽。
[0009]所述富含玉米黃素錦燈籠肽的制備方法:
[0010]1)錦燈籠果實干燥后磨碎，按照錦燈籠:水質(zhì)量比=1:10-100的比例加入去離子水，用2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0-10.0，20-60?攪拌提取1~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣；
[0011]2)步驟1)所得濾渣再次濾渣按照錦燈籠質(zhì)量:水質(zhì)量=1:10-100的比例加入去離子水進行第二次提取，用2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.(Tl0.0，2(T60°C攪拌提取1~10小時，提取
結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣；
[0012]3)步驟2)所得濾渣再次濾渣按照錦燈籠質(zhì)量:水質(zhì)量=1:10-100的比例加入去離子水進行第二次提取，用2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.(Tl0.0，2(T60°C攪拌提取1~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣；
[0013]提取共重復(fù)3次合并3次的提取液，用lmol/1 HCl溶液調(diào)節(jié)pH為1.0-7.0，沉淀錦燈籠蛋白質(zhì)；收集蛋白質(zhì)，用PH2~9的磷酸緩沖液溶解成重量濃度I~50%的溶液，加入蛋白質(zhì)水解酶，酶的加入量為酶:蛋白質(zhì)重量比=1:10~500，在20~80°C溫度下酶解
0.5~24小時，再冷凍干燥得到富含玉米黃素的錦燈籠肽。
[0014]本發(fā)明的特點如下:
[0015]1錦燈籠是我國傳統(tǒng)中藥，本發(fā)明在傳統(tǒng)中藥基礎(chǔ)上利用現(xiàn)代生物技術(shù)，提高了錦燈籠的生物功效。
[0016]2所制備的錦燈籠肽具有顯著的抗氧化活性。本發(fā)明首次從錦燈籠果實中獲得具有抗氧化活性的肽。
[0017]3錦燈籠肽富含玉米黃素，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明所制備的錦燈籠肽不僅具有抗氧化活性，而且富含對視網(wǎng)膜色素——玉米黃素，因此在食品添加劑、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例1錦燈籠肽中玉米黃素的色譜圖。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]以錦燈籠果實為原料，按照以下工藝制備錦燈籠肽:
[0021]取1000克燈籠果實冷凍干燥、磨成粉末，按照錦燈籠:水質(zhì)量比=1:10的比例加入去離子水，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，20°C攪拌提取10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；濾渣按照以上步驟進行提取，重復(fù)三次；合并提取液，用lmol/1 HCl溶液調(diào)節(jié)pH為1.0，沉淀錦燈籠蛋白質(zhì)；收集蛋白質(zhì)，用PH2的磷酸緩沖液溶解成重量濃度10%的溶液，加入木瓜蛋白酶，酶的加入量為酶:蛋白質(zhì)重量比=1: 10，在20°C溫度下酶解24小時，冷凍干燥得到錦燈籠肽；每克錦燈籠肽含有玉米黃素10.72毫克，錦燈籠肽中玉米黃素的色譜圖見圖1。通過鐵還原能力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力檢測錦燈籠肽的抗氧化能力。
[0022]1.鐵還原能力測定
[0023]取250uL樣品加入到4mL TPTZ (2，4，6_三吡啶基三嗪)工作液中(工作液組成:25ml 的 0.3M、pH=3.6 醋酸鹽緩沖液，2.5ml 的 IOmM 的 TPTZ 溶液，2.5ml 的 20mM 的 FeCl3,混合均勻)，于37°反應(yīng)lOmin，在593nm處測定其吸光度
[0024]Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制不同濃度的Vc溶液，分別取IOOuL與TPTZ工作液按上述條件下反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]樣品鐵還原能力以每暈克樣品相當(dāng)于UgVc的鐵還原能力表不。2.DPPH自由基清除能力
[0026]配制不同濃度的樣品溶液，取Iml樣品+1ml，0.1mM DPPH (2，2_聯(lián)苯基-1-苦基肼基，溶于95%乙醇)振蕩混勻，室溫放置30min，于517nm檢測吸光度變化。
[0027]清除率％= (Acontrol-Asample-As ) /Acontrol X 100% ；
[0028]AcontrolIlml的乙醇溶液加Iml的，0.1mM DPPH按照上述反應(yīng)后的吸光度值；
[0029]Asample:Iml的樣品溶液加Iml的，0.1mM DPPH按照上述反應(yīng)后的的吸光度值；
[0030]Ab:1ml樣品溶液加Iml水的吸光度值；
[0031]3.羥基自由基清除`能力測定
[0032]樣品溶液:1ml的0.2M，pH7.8磷酸鹽緩沖液+0.75ml的7.5mM的鄰二氮菲溶液+0.5ml 的 7.5mM 的 FeSO4 溶液 +0.5ml 樣品 +0.5ml, 30mMH202+l.75ml 水。同時設(shè)置參比 I(0.5ml水代替樣品溶液)和參比2 (用1.0ml水代替H2O2和樣品溶液)。以上配好溶液于37°放置60min，再于510nm檢測吸光度。
[0033]清除率％= (As-A損傷)/ (A未損-A 損)X 100% ；
[0034]A參比::參比I的吸光度值；
[0035]A參比2:參比2的吸光度值；
[0036]As:樣品溶液的吸光度值；
[0037]錦燈籠肽的抗氧化活性見表1。
[0038]表1錦燈籠肽的抗氧化活性
1?原能力(相對于pg Vc/ml) 152.3
[0039]DPPH.清除率(lmg/ml)~82%
OH 清除率(lmg/ml)84%
[0040]實施例2
[0041]取1000克燈籠果實冷凍干燥、磨成粉末，按照錦燈籠:水質(zhì)量比=1:100的比例加入去離子水，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH為10.0，60°C攪拌提取I小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；濾渣按照以上步驟進行提取，重復(fù)三次；合并提取液，用lmol/1 HCl溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，沉淀錦燈籠蛋白質(zhì)；收集蛋白質(zhì)，用PH9的磷酸緩沖液溶解成重量濃度50%的溶液，加入胰蛋白酶，酶的加入量為酶:蛋白質(zhì)重量比=1:500，在50°C溫度下酶解4小時，再冷凍干燥得到錦燈籠肽；每克錦燈籠肽含有`玉米黃素12.32毫克，錦燈籠肽的抗氧化活性與表1相同。
【權(quán)利要求】
1.一種富含玉米黃素的錦燈籠肽的制備方法，其特征在于:用水提取錦燈籠果實中的蛋白質(zhì)并酶解為肽，所得到的產(chǎn)品富含玉米黃素。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于: 1)錦燈籠果實干燥后磨碎，進行提取操作； 提取操作過程為:按照錦燈籠:水質(zhì)量比=1:10-100的比例加入去離子水，用0.1-2ΜNaOH調(diào)節(jié)pH為7.0~l0.0，20~60°C攪拌提取1~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣； 濾渣重復(fù)進行上述提取操作過程1-3次； 2)合并上述1-4次的提取液，用0.1-lmol/l HCl溶液調(diào)節(jié)pH為1.0-7.0，沉淀錦燈籠蛋白質(zhì)；收集蛋白質(zhì)，用PH2~9的磷酸緩沖液溶解成重量濃度1~50%的溶液，加入蛋白質(zhì)水解酶，酶的加入量為酶:蛋白質(zhì)重量比=1:10~500，在20~80°C溫度下酶解0.5~24小時，再冷凍干燥得到富含玉米黃素的錦燈籠肽；錦燈籠肽含有玉米黃素，活性檢測顯示具有抗氧化活性。
3.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于: 所述步驟1)過程如下， A.錦燈籠果實干燥后磨碎，按照錦燈籠:水質(zhì)量比=1:10-100的比例加入去離子水，用0.1-2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0~l0.0，20~60°C攪拌提取1~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣； B.將步驟A)所得濾渣按照錦燈籠質(zhì)量:水質(zhì)量=1:10-100的比例加入去離子水進行第二次提取，用0.1-2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0~l0.0，20~60°C攪拌提取I~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣； C.將步驟B)所得濾渣按照錦燈籠質(zhì)量:水質(zhì)量=1:10-100的比例加入去離子水進行第二次提取，用0.1-2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0~l0.0，20~60°C攪拌提取1~10小時，提取結(jié)束后靜置沉淀分離；得提取液和濾渣； 合并3次的提取液待用。
4.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:蛋白水解酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白酶。
5.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述富含玉米黃素的錦燈籠肽；所述富含是指錦燈籠肽中玉米黃素的含量> 5mg/g。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:所得到的錦燈籠肽產(chǎn)品富含玉米黃素，活性檢測顯示具有抗氧化活性，而且是眼睛營養(yǎng)素。
【文檔編號】C12P21/06GK103805661SQ201210460751
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月15日
【發(fā)明者】鄒漢法, 靳艷 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所