一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食用菌培養(yǎng)液中有機(jī)酸的測(cè)定領(lǐng)域，特別涉及一種利用離子排阻色譜 柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 有機(jī)酸作為生物生長(zhǎng)過程中的代謝產(chǎn)物會(huì)不斷變化，食用菌生長(zhǎng)過程中培養(yǎng)料內(nèi) 的有機(jī)酸逐漸積累導(dǎo)致pH下降，直接影響菌絲細(xì)胞的新陳代謝和整個(gè)生命活動(dòng)，所以了解 菌絲有機(jī)酸的種類和變化，有利于了解其代謝機(jī)制，更好的調(diào)控培養(yǎng)條件使之更適合菌絲 的生長(zhǎng)。
[0003] 目前分析有機(jī)酸的方法主要有：酸堿滴定法、氣相色譜法、薄層色譜法及高效液相 色譜法等。酸堿滴定法只能測(cè)定總酸量，且操作繁瑣；氣相色譜法需衍生步驟，誤差較大； 薄層色譜法定量精度差；而高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可同時(shí)定量多 種有機(jī)酸，已被廣泛用于各種食品和天然物中有機(jī)酸的測(cè)定。但不同的柱子針對(duì)不同的物 質(zhì)分離所需的色譜條件不同，利用串聯(lián)離子排阻色譜柱（SH1011和KC-811，Shodex公司） 對(duì)食用菌培養(yǎng)液中有機(jī)酸的定性定量檢測(cè)尚未見報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液 中丁酸的方法，該方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好。
[0005] 本發(fā)明的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中丁酸的方法，包括：
[0006] (1)分別取草酸、檸檬酸、酒石酸、甲酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，加超純水定容 作儲(chǔ)備液；將儲(chǔ)備液稀釋配制不同濃度的混標(biāo)，進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積和有機(jī)酸含量繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線；
[0007] (2)選用SH1011柱和KC-811柱為分析柱，SH-G柱為保護(hù)柱，色譜條件為：流動(dòng) 相4mmol/L高氯酸溶液，柱溫為60°C，流動(dòng)相流速1.OmL/min，紫外可見檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng) 210nm；
[0008] (3)取待測(cè)食用菌斜面培養(yǎng)物，活化后打碎，接入到PDB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)， 定期取樣，無紡布過濾菌絲，濾液離心后取上清液備用；
[0009] (4)分別取步驟⑶中的上清液lmL，濾膜過濾后上樣，上樣量10yL，采用和標(biāo)準(zhǔn) 品相同的條件重復(fù)檢測(cè)；根據(jù)樣品對(duì)應(yīng)丁酸的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中丁酸的含量。
[0010] 所述步驟（1)中的不同濃度具體為草酸200yg/mL，檸檬酸200yg/mL，酒石酸 200yg/mL，甲酸 1yL/mL，丁酸 1yL/mL。
[0011] 所述步驟（1)中丁酸在精密度實(shí)驗(yàn)中的RSD為0. 33%，在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的RSD為 0. 44 %，在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的RSD為0. 43 %，標(biāo)樣回收率為95. 8 %。
[0012] 所述步驟⑵中的SH1011柱的參數(shù)為：8.0mmX3000mm，6ym;KC-811柱的參數(shù) 為：8.OmmX3000mm，6ym;SH_G柱的參數(shù)為：6.OmmX50mm，10ym。
[0013] 三個(gè)色譜柱串聯(lián)使用，串聯(lián)先后順序?yàn)镾H-G柱串聯(lián)SH1011柱串聯(lián)KC-811柱。
[0014] 所述步驟（3)中的食用菌為杏鮑菇XH、金針菇G1或金針菇F29。
[0015] 所述步驟（4)中的打碎具體為高低檔間隔打碎50s，直徑0. 6cm且菌齡相同的菌塊 個(gè)數(shù)與無菌水容積比為2. 5:1。
[0016] 所述步驟（4)中的濾膜孔徑為0. 22ym。
[0017] 所述步驟⑷中所取的樣品菌絲生長(zhǎng)要正常，平行間的差別盡量小。
[0018] 通過利用離子排阻色譜柱（SH1011和KC-811串聯(lián)，Shodex公司）對(duì)食用菌培養(yǎng) 液中的丁酸定性定量的測(cè)定方法，該方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可快速高效的檢 測(cè)出食用菌培養(yǎng)液中丁酸的含量。對(duì)特定種類真菌菌絲培養(yǎng)液的丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線一經(jīng)建立 可重復(fù)使用，且樣品前處理簡(jiǎn)單易行，需時(shí)少。
[0019] 本發(fā)明通過利用離子排阻色譜柱（SH1011和KC-811串聯(lián)，Shodex公司）對(duì)食用 菌培養(yǎng)液中的丁酸定性定量的測(cè)定方法，樣品前處理簡(jiǎn)單。檢測(cè)系統(tǒng)一經(jīng)確定可對(duì)相應(yīng)培 養(yǎng)模式或生長(zhǎng)環(huán)境中的真菌菌絲培養(yǎng)液中的丁酸進(jìn)行長(zhǎng)期、穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)。
[0020] 有益效果
[0021] (1)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，用時(shí)少，樣品前處理簡(jiǎn)單；待測(cè)種類真菌的菌絲培養(yǎng)液離 心取上清，0. 22ym濾膜過濾即可上樣；
[0022] (2)本發(fā)明的方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，丁酸的RSD都小于5% ;
[0023] (3)本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)一經(jīng)確定可對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)模式或生長(zhǎng)環(huán)境中的真菌菌絲培養(yǎng)液 中的丁酸進(jìn)行長(zhǎng)期、穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)的液相圖譜；其中，1為草酸；2為檸檬酸；3為酒石 酸；4為甲酸；5為丁酸。
[0025] 圖2為丁酸標(biāo)準(zhǔn)品圖譜；
[0026] 圖3為樣品中金針菇G1發(fā)酵液樣品中丁酸的圖譜；其中，1為丁酸。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 確定金針菇G1，金針菇F29,杏鮑菇XH菌絲搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)液中丁酸的含量：
[0030] (1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0031] 分別準(zhǔn)確稱取l〇mg草酸，檸檬酸，酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品，吸取甲酸，丁酸標(biāo)準(zhǔn)品50yL置 于10mL容量瓶中，加超純水定容作儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋配制不同濃度的混標(biāo)，進(jìn)樣分析， 根據(jù)峰面積和有機(jī)酸含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表1。
[0032] 表1標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法，包括： (1) 分別取草酸、巧樣酸、酒石酸、甲酸、了酸標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，加超純水定容作儲(chǔ) 備液；將儲(chǔ)備液稀釋配制不同濃度的混標(biāo)，進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積和有機(jī)酸含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線； (2) 選用甜1011柱和KC-811柱為分析柱，SH-G柱為保護(hù)柱，色譜條件為；流動(dòng)相 4mmol/L高氯酸溶液，柱溫為60°C，流動(dòng)相流速1. OmL/min，紫外可見檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng) 210nm ; (3) 取待測(cè)食用菌斜面培養(yǎng)物，活化后打碎，接入到PDB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，定期 取樣，無紡布過濾菌絲，濾液離屯、后取上清液備用； (4) 分別取步驟（3)中的上清液山以濾膜過濾后上樣，上樣量10 ^以采用和標(biāo)準(zhǔn)品相 同的條件重復(fù)檢測(cè)；根據(jù)樣品對(duì)應(yīng)了酸的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中了酸的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（1)中的不同濃度具體為草酸200 yg/mU巧樣酸200 yg/mU酒石酸 200 y g/mL，甲酸 1 y L/mL，了酸 1 y L/血。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（1)中了酸在精密度實(shí)驗(yàn)中的RSD為0. 33%，在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的RSD 為0. 44 %，在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的RSD為0. 43 %，標(biāo)樣回收率為95. 8 %。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（2)中的甜1011柱的參數(shù)為；8. 0mmX3000mm，6 ym ;KC-811柱的參 數(shù)為；8. OmmX 3000mm，6 y m ;甜-G 柱的參數(shù)為；6. OmmX 50mm，10 y m。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；S個(gè)色譜柱串聯(lián)使用，串聯(lián)先后順序?yàn)樘?G柱串聯(lián)甜1011柱串聯(lián)KC-811柱。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（3)中的食用菌為杏鮑茹XH、金針茹G1或金針茹巧9。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（4)中的打碎具體為高低檔間隔打碎50s，直徑0.6cm且菌齡相同的 菌塊個(gè)數(shù)與無菌水容積比為2. 5:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中了酸的方法， 其特征在于；所述步驟（4)中的濾膜孔徑為0. 22 ym。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用離子排阻色譜柱檢測(cè)食用菌培養(yǎng)液中丁酸的方法，包括：(1)配制標(biāo)準(zhǔn)品母液，梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)調(diào)整色譜條件；(3)PDB搖瓶培養(yǎng)食用菌，過濾離心后取上清液待用；(4)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的方法檢測(cè)培養(yǎng)基質(zhì)和樣品中丁酸的含量。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，有很好的精密度和穩(wěn)定性，能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出食用菌發(fā)酵液中丁酸的含量，一經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)確定可對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)模式或生長(zhǎng)環(huán)境中的食用菌培養(yǎng)液中的丁酸進(jìn)行長(zhǎng)期、穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)。
【IPC分類】G01N30-06, G01N30-02
【公開號(hào)】CN104535674
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410782338
【發(fā)明人】汪虹, 曹暉, 王言, 陳明杰, 唐慶九, 余昌霞
【申請(qǐng)人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日