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無聚集和血清結(jié)合的水溶性熒光染料和相關產(chǎn)品及方法

文檔序號:6142042閱讀:862來源:國知局
專利名稱:無聚集和血清結(jié)合的水溶性熒光染料和相關產(chǎn)品及方法
介紹本發(fā)明主要涉及無聚集和血清結(jié)合的水溶性熒光染料和相關產(chǎn)品及方法。優(yōu)選的染料包括連接到兩個或更多增溶配體上的發(fā)光的基本上為平面的熒光團。
相關申請本申請要求Dandliker等于1998年11月25日申請的、標題為“無聚集和血清結(jié)合的水溶性熒光染料和相關產(chǎn)品及方法”的美國臨時申請60/109,969的在先權(quán)益,在此將其完整地(包括附圖)結(jié)合到本文中作為參考。
本發(fā)明背景將本文涉及的出版物和其他參考資料結(jié)合到本文中作為參考。以下對本發(fā)明背景的描述是為了幫助理解本發(fā)明,并不是對本發(fā)明的特征的描述或是以先有技術來構(gòu)成本發(fā)明。
卟啉(porphyins)、酞菁和其他氮雜卟啉(azaporphyrin)和某些其他含氮的芳族大環(huán)化合物的近紅外線吸收和發(fā)射有時使這些化合物作為用作熒光標記的具有吸引力的選擇物。
酞菁,特別是由于它們較強的近紅外線吸收(摩爾消光系數(shù)約200,000)、它們在有機溶劑中的高量子產(chǎn)額和眾所周知的抵抗普通金屬酞菁染料褪色的能力,使人們在利用它們作為熒光標記方面作出了許多嘗試。但是,沿著這條思路的早期的嘗試沒有得到完全令人滿意的產(chǎn)品,很大原因在于酞菁的非同尋常的強締合趨勢,特別是以面對面聚集體的方式進行堆積以及還很強地結(jié)合于各種其他分子表面(非特定結(jié)合(non-specific binding))。
分子內(nèi)堆積的結(jié)果使未取代的酞菁在有機和水溶劑中都有極低的溶解度。正如現(xiàn)在所熟知的,堆積的趨勢可以通過引入一種或多種帶電基團(如磺酸根)得到顯著降低。而具有這種取代的酞菁可以在水和電解質(zhì)的水溶液中具有高溶解度,基本上保留了其非特定結(jié)合的趨勢。
目前,大多數(shù)關于熒光標記的科學研究集中在涉及生物材料的應用領域,其中所述生物材料如組織切片、細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì),包括糖蛋白和脂蛋白、肽寡-和多-糖,寡-和多-核苷酸和類脂。在涉及這些材料的熒光測定中的非特定結(jié)合的趨勢可以通過部分掩蔽有關的特定相互作用來干擾。
非特定結(jié)合與堆積的趨勢都可以通過將酞菁染料與一種或多種聚氧化烴基基團(polyoxyhydrocarbyl groups一般為甲氧基封端的聚(乙二醇)(PEG))偶聯(lián),將其減少到在治療藥物檢測中可忽略的水平。同時,這種基團的附著保留了所需的吸收和發(fā)射特性。這種技術對于大量其他近紅外線染料同樣有效。參看Dandliker等人于1995年6月7日申請、標題為“用于熒光檢測的聚氧化烴基相關產(chǎn)品和方法”的美國專利申請第08/476,544號,Lyon & Lyon Docket 211/167號(以及其中所指的在先申請),將其完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
最近,在可發(fā)熒光的染料方面有了顯著的發(fā)展。一方面,目前能夠得到通過更長波長(如紅光和紅外光波長)的輻射激發(fā)的染料。這些染料在下述兩個共同轉(zhuǎn)讓的專利申請中有描述。Arrhenius于1991年5月15日申請、標題為“熒光標記組分和熒光探針”的美國專利申請系列701,449號(這是1990年5月15日申請的美國專利申請523,601號的連續(xù)部分),Dandliker和Hsu于1991年5月15日申請、標題為“無聚集和血清結(jié)合的熒光染料”的美國專利申請系列701,465號(這是1990年5月15日申請的美國專利申請系列524,212號的連續(xù)部分)。將這些申請完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
通過數(shù)據(jù)收集和分析技術在提高靈敏度方面有了更加顯著的改進。如Dandliker等在標題為“熒光計”的美國專利第4,877,965號中所述(將其完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖),將數(shù)據(jù)收集和分析技術與時間門控技術(time gating techniques)結(jié)合使用得到相對于背景改進的信號。通常,4,877,965號專利認為檢測強度作為時間的函數(shù),由來自不同來源的信號組成,包括所需的信號源和各種不需要的背景源。通過數(shù)據(jù)收集和分析技術能夠?qū)崿F(xiàn)所需信號的最佳化。
在免疫測定中對檢測相關物質(zhì)的能力方面也取得了顯著的改進。例如,使用Dandliker等于1990年3月6日申請、標題為“過渡態(tài)(transient state)熒光測定”的美國專利申請系列490,770號(這是1989年6月13日申請的美國專利申請系列365,420號的繼續(xù)部分)中所描述的技術,能夠在均相測定中檢測到物質(zhì)的結(jié)合和游離形式,該專利被完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有的附圖。通常,該技術要求對平行和垂直極化組分的強度隨時間的衰變進行測量。通過測量不同極化狀態(tài)的時間相關的衰變,在均相分析形式下能夠確定物質(zhì)(如半抗原、肽或小的蛋白質(zhì))的結(jié)合和游離形式。重要的是,這種技術不要求對結(jié)合和游離物質(zhì)進行分離。
盡管在可發(fā)熒光的染料領域和在數(shù)據(jù)分析方面有了顯著和大有希望的改進,在該技術領域仍舊需要具有這些和/或其他優(yōu)勢的另外的染料,并且這種染料也具有有利的化學反應性。
本發(fā)明概述本發(fā)明開發(fā)出了一種意想不到的結(jié)果即使是非常小的基團,如-OH,如果在平面分子上存在兩個這樣的基團,其中的一個在分子平面的任一面上,也能有效地阻止分子發(fā)生非特定結(jié)合和堆積。通過提高凈負電荷增強了這些配體對許多生物體系的有利效果,這些生物體系中大多數(shù)“生物分子”自身攜帶有負的凈電荷。
因此,本發(fā)明的一個方面在于只要染料上的凈電荷足夠大,通過用兩個極小的軸向配體(axial ligands)(如-OH)代替將工程酞菁和其他熒光染料偶聯(lián)到聚氧化烴基基團上,能夠?qū)崿F(xiàn)所需的效果。在大多數(shù)情況下,優(yōu)選這種凈電荷為負的,這是由于在生理學的pH范圍內(nèi)大多數(shù)生物物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和DNA也會攜帶負的凈電荷。因此,我們發(fā)現(xiàn)高度磺化的二羥基-硅-二羧基-酞菁具有幾乎與PEG共扼的未磺化的染料同樣低的對血清蛋白質(zhì)的非特定結(jié)合。
此外,本發(fā)明的一個優(yōu)勢表現(xiàn)在不存在由PEG形成的分子團。PEG工程染料在染料濃度為10-4M和以上時,其表現(xiàn)非常類似于大分子,因此當其通過設計為防止約30K道爾頓或更高的分子通過的膜時受到了極大的阻礙。而且,在設計用來從小分子中分離大分子的凝膠滲透色譜法中,染料在色譜的空隙容積中移動。相反,經(jīng)磺化的二羥基-二羧基-硅-酞菁(SDDSiPc)的表現(xiàn)正如對具有這種式量的分子所預期的那樣。
至于通過改變熒光極化和強度所測得的非特定結(jié)合,當這些染料暴露于例如稀釋的人體血清時,SDDSiPc的表現(xiàn)與PEG偶聯(lián)染料(參見實施例6)大體相同。在這方面,鑒于未磺化的二羥基-二羧基-硅-酞菁(DDSiPc)表現(xiàn)出明顯的非特定結(jié)合,很重要的一點是注意其本身的負電荷在降低非特定結(jié)合方面具有顯著作用。羥基-鋁-酞菁-三磺酸鹽表現(xiàn)出對離子強度很強的敏感性,也具有很強的非特定結(jié)合??磥硖挤肿颖仨氃谄浞肿悠矫娴膬擅嫔隙季哂休S向配體,但如果凈電荷足夠高時,-OH基團的是也要足夠大以事實上消除非特定結(jié)合。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于即使被標記的分子(如蛋白質(zhì)和寡核苷酸)自身帶有負電荷,用-OH或其他小的增溶軸向配體與高電荷一起改造的染料似乎更具有化學活性(在標記反應中)。這表明盡管通常易于對半抗原和其他小分子進行標記,但PEG配體確實干擾了對分子的標記。
由于羥基-鋁-酞菁-三磺酸鹽具有很強的非特定結(jié)合,從這一點人們可推測帶有較小負凈電荷的二羥基-二羧基-硅-酞菁將會表現(xiàn)出比鋁染料更強的非特定結(jié)合,因此本發(fā)明是非常出乎意料的。本發(fā)明的一部分正是基于這些表現(xiàn)出恰恰相反的發(fā)現(xiàn)上(參看

圖1和2)。根據(jù)這里所報導的發(fā)現(xiàn),期望其他小的軸向配體如-OCH3、-OCH2OH、-Cl、-Br和-F具有同樣的效果。
許多其他含氮原子的大環(huán)可以被14族的原子金屬化,而表現(xiàn)出相似的結(jié)果。這種大環(huán)包括卟啉、氮雜卟啉(azaporphyrin)、咕啉、sapphyrin、pentaphyrin、porphycene以及其他類似的具有廣泛離域的π電子體系的大環(huán)的衍生物和結(jié)構(gòu)變體。由于大環(huán)結(jié)合了許多所需性質(zhì)的事實,特別優(yōu)選的大環(huán)類型包括氮雜卟啉衍生物和結(jié)構(gòu)變體。氮雜卟啉衍生物包括單-、二-和三氮雜卟啉和porphyrazine的衍生物。任何這些大環(huán)可以任選還含有稠合的芳環(huán)。這種氮雜卟啉衍生物和變體包括酞菁、苯并三氮雜卟啉和naphthalocyanine和它們的衍生物及它們的氧雜、硫雜或氮雜結(jié)構(gòu)變體。
因此本發(fā)明涉及標記組分、熒光探針、寡核苷酸、雜交試樣和使用這些產(chǎn)品的免疫測定和生產(chǎn)這些產(chǎn)品的方法。本發(fā)明提供了可檢測的已標記的標記組分,該組分含有偶聯(lián)到兩個或多個通常為軸向的小增溶配體的熒光團部分,軸由中心金屬原子形成的絡合物的八面體幾何學確定,優(yōu)選這種組分可減少或消除溶劑敏感性和非特定結(jié)合的問題。
在免疫測定中使用這種可檢測的標記或標記組分的優(yōu)點在于在生物流體如血清存在和不存在時,這些標記的過渡態(tài)熒光發(fā)射的平行和垂直組分的強度基本上相同。因此,使用這些標記的測定方法能夠檢測出生物流體中低濃度的分析物、目標分析物或其類似物。術語“分析物”是指在測定中的化合物或被測量的化合物,可以是任何其受體是天然存在的或能夠制備的化合物,其可以是單-或多表位(polyepitopic)、抗原的或半抗原的單一的或多個共享至少一個共同表位(epitopic site)或受體的化合物。術語“目標分析物”是指在測定中的化合物或被測量的化合物,可以是任何其受體是天然存在的或能夠制備的化合物,其可以是單-或多表位、抗原的或半抗原的、單一的或多個共享至少一個共同表位或受體的化合物。目標分析物的“類似物”是指能夠與目標分析物競爭結(jié)合到受體上的化合物或各種化合物。術語“受體”是指能夠通過特定識別目標分析物或其類似物或被目標分析物或其類似物識別的分子或分子絡合物。例如,抗體可以作為抗原的受體。
這些標記組分可以用作標記來標記分析物、抗原、抗體或其他分子??梢匀芜x將這些標記組分功能化,使其包括連接臂,從而可將標記組分連接到分析物、抗原、抗體或其他分子上。對適合于該目的的連接臂在Kricka,J.J.的配體-結(jié)合物分析,標記和分析對策,第15-51頁(紐約Marcel Dekker Inc.,NY(1985))中已有描述。使用常規(guī)技術將標記組分連接到分析物、抗原、抗體或其他分子上。
一方面,本發(fā)明提供了可檢測的已標記的標記組分,其包括(1)含發(fā)光的基本上為平面分子結(jié)構(gòu)的熒光團部分,優(yōu)選具有至少約500nm的激發(fā)波長,和(2)偶聯(lián)到(1)的熒光團部分上的兩個或多個小的增溶軸向配體。優(yōu)選的熒光團、小的增溶軸向配體和兩者的連接的例子在本文中有詳細描述。此外,提供了能證明標記組分在降低溶劑敏感性和非特定結(jié)合方面的具有有效性的證據(jù)。
在特別優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的標記組分能夠用于制造探針,如主要在共同擁有的于1993年4月21日申請的美國申請系列08/051,446號中所描述,也可以用于免疫測定,如主要在共同擁有的1993年3月23日申請的美國申請系列08/035,633號中所述,將這兩個專利的公開內(nèi)容完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
本發(fā)明的標記組分可用作可檢測的標記,如用作診斷試劑和測定(如熒光結(jié)合測定和其他免疫測定)中用作可檢測的標記。本發(fā)明提供了可檢測的已標記的標記組分,其具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的熒光團部分,在水溶液中存在血清組分時,標記組分的特征為過渡態(tài)熒光發(fā)射具有與沒有血清時基本相同強度的平行和垂直組分。術語“軸向配體”是指取代基,它和大環(huán)配體一起與中心原子形成配位化合物。軸向配體垂直于由大環(huán)構(gòu)成的平面。
我們認為這種分子組分在下述方法中也是有用的。由Walker等在Clinical Chemistry 421(1996)、Clinical Chemistry 399(1993)、美國專利5,593,867號和歐洲專利申請93117909.7中所述方法,將它們完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
令人驚訝的是,我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的具有偶合了兩個小的增溶軸向配體的大環(huán)多齒配體,其中一個軸向配體位于所述多齒配體平面的任一側(cè)的標記組分表現(xiàn)出顯著降低的對于血清組分的非特定結(jié)合,并表現(xiàn)出可忽略的溶劑敏感性。術語“溶劑敏感性”是指分子的熒光性能取決于所用的溶劑體系而改變,尤其是指與有機溶劑(如DMF)相比,在水溶液中的熒光性能方面的差異。許多在有機溶劑(如DMF)中表現(xiàn)出高熒光強度的熒光團在水溶液中表現(xiàn)出大為降低的熒光強度。熒光強度與試樣濃度和激發(fā)輻射的強度有關。具體的染料的熒光強度可與其特征光吸收系數(shù)(消光系數(shù))和熒光量子效率、以及環(huán)境因數(shù)有關。這些標記組分也表現(xiàn)出增強的衰變時間,該時間接近它們的輻射壽命或未猝滅壽命。我們使用的術語“衰變時間”通常是指將受激原子的濃度由其原始濃度降低到該值的1/e所必需消耗的時間。對于“壽命”一詞的使用不同于,如Demos,J.N.,受激態(tài)壽命測量(Excited State Lifetime Measurements),Academic Press,紐約,N.Y.(1983),第10、35、44和158頁。
這些標記組分可用作引入熒光探針中的熒光標記。術語“熒光探針”是指含熒光團部分的標記組分,其直接或通過連接臂結(jié)合到或配位到在測定(如熒光免疫測定)中使用的分析物、抗原、半抗原、抗體或其他分子上,以確定有關物質(zhì)的存在和/或存在量。一些這種標記組分可用作磷光標記。本發(fā)明的組分可用作用于體內(nèi)成像的試劑的標記,也可以用作體內(nèi)腫瘤療法中所用試劑的標記。
因此,通常來說,優(yōu)選的熒光團為在波長為約200-約1000nm,優(yōu)選約600-800nm范圍的光的激發(fā)下能有效產(chǎn)生熒光的熒光團。適當?shù)臒晒鈭F包括那些在不同于其他溶液組分(如存在于試樣中的蛋白質(zhì))的激發(fā)和發(fā)射最大值的波長下吸收和/或發(fā)射,使背景熒光最小化的熒光團。
由于這些標記組分在使用生物流體的試樣的測定中特別有用,優(yōu)選用于那些用途的是具有至少約500nm的激發(fā)和/或發(fā)射波長的熒光團,其降低了來自其他試樣組分的環(huán)境熒光的干擾。當使用小于500nm的激發(fā)波長時,一些試樣,如血清會表現(xiàn)出相當大的來自黃素、黃素蛋白、NADH等的干擾背景熒光。
對某些應用領域如熒光極化免疫測定來說,優(yōu)選的熒光團在結(jié)合形式下也可以表現(xiàn)出很高的熒光極化程度,優(yōu)選比可觀察到的極化作用的理論最大值高出大約10%。術語“結(jié)合”是指在分子和它的特定結(jié)合物之間形成相互結(jié)合的狀態(tài)。對于某些應用領域如熒光過渡態(tài)測定來說,優(yōu)選的熒光團的特征也在于測得的熒光衰變時間范圍為約1納秒-約50納秒,優(yōu)選范圍為約5-約20納秒。對于其他應用如磷光標記來說,可以使用具有更長衰變時間的熒光團。
因此,優(yōu)選那些能有效產(chǎn)生熒光的熒光團,即這些熒光團的特征為在適當?shù)牟ㄩL下具有高吸收系數(shù)和具有高熒光量子產(chǎn)額。對于某些應用來說,優(yōu)選的熒光團測得的熒光衰變時間為至少大約2納秒,并表現(xiàn)出很高的熒光極化程度。
優(yōu)選的小的增溶軸向配體包括-OH、-氧-叔丁基-、-OCH2OH、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH2CH2-O-CH2CH2OH、-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH、Cl、Br和F。對于任何通過-O-連接到中心原子的這些軸向配體來說,對水解的穩(wěn)定性或許可以通過采用直接的碳與金屬的鍵(如碳-硅)代替-O-連接得到改進。
在優(yōu)選的實施方案中,熒光部分具有一個配位到中心原子的基本上為平面的多齒大環(huán)配體,所述中心原子能夠與兩個小的增溶軸向配體配位。就在熒光結(jié)合測定中作為標記組分來說,適當?shù)闹行脑訛槟切﹥蓚€軸向配體可以配位到其上的原子,其原子序數(shù)不高,不會引起由于轉(zhuǎn)化到三重線態(tài)而導致的大量的熒光猝滅。優(yōu)選的作為中心原子的元素包括硅、鍺和錫,特別優(yōu)選硅和鍺。
本發(fā)明也涉及通過使用熒光團部分作為目標分析物或受體的標記確定試樣中目標分析物的存在或存在量的方法,該標記能夠特定識別目標分析物,所述熒光團具有發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上,其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
在免疫測定中使用這種可檢測的標記或標記組分的優(yōu)點在于在生物流體(如血清)存在和不存在時,這些標記的熒光發(fā)射的平行和垂直組分的強度基本相同。因此,使用這些標記的測定方法能夠檢測出生物流體中低濃度的目標分析物。
本發(fā)明的方法特別適合與改進的熒光檢測系統(tǒng)一起使用,這種系統(tǒng)描述在1992年3月23日申請、標題為“熒光計檢測體系”的共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請、Lyon & Lyon Docket 195/129號、系列號07/855,238中。相信標記組分和標記也可用于下述方法中,包括Walker等在Clinical Chemistry 421(1996)、Clinical Chemistry 399(1993)、美國專利5,593,867號和歐洲專利申請93117909.7中所述的方法,將所有這些完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
一方面,本發(fā)明涉及利用特殊標記的競爭性抑制測定方法。在這方面,本發(fā)明涉及確定目標分析物的存在或存在量的方法,該方法為使推測含有目標分析物的試樣與已知量的加入的連接到熒光探針上的目標分析物或其類似物接觸,熒光探針包括由熒光團部分形成的可檢測到的已標記的標記組分,熒光團部分包括發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上,其中一個配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);使試樣與能夠特定識別所述目標配體的受體接觸;和確定結(jié)合到受體的熒光探針或游離的熒光探針的量。未知試樣中結(jié)合的或游離的熒光探針的量可以與空白試樣和含已知量的目標分析物的試樣進行比較。
在優(yōu)選的實施方案中,將所得的試樣的混合物、熒光探針和受體在測量結(jié)合的和/或游離的熒光探針數(shù)量之前迅速稀釋。稀釋步驟使測定具有更高的靈敏度。特別優(yōu)選是2-100倍,優(yōu)選約7-約50倍,更優(yōu)選約35倍的稀釋。
一方面,本發(fā)明使用用于目標分析物(或其類似物)或受體的標記改進了免疫測定方法。這種改進使用了熒光團部分,其具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。使用這類標記進行測定的優(yōu)點在于它們不存在血清結(jié)合和聚集,因此特別適用于檢測生物流體如血清、血漿、全血和尿。
另一方面,本發(fā)明提供了一種進行“夾心(sandwich)”或“兩位點(two-site)”免疫測定的方法,包括以下步驟(a)使推測含有目標分析物的試樣與能夠特定識別所述目標分析物的第一受體接觸,以形成所述目標分析物和第一受體的絡合物,用熒光探針對第一受體進行標記,熒光探針具有一個熒光團部分,其具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);(b)使所述絡合物與能夠特定識別所述目標分析物或第一受體的第二受體(結(jié)合在固體載體上)接觸,以形成第一標記受體、目標分析物和結(jié)合到固體載體的第二受體的絡合物;和(c)測量與固體載體結(jié)合的標記的第一受體的量或未反應的標記的第一受體的量。
夾心型測定可以是多相測定或均相測定。如果是多相測定,可以引入從未反應的標記第一受體中分離出固體載體的附加步驟。通常優(yōu)選均相測定,原因是它們速更快。
在另一個實施方案中,測定可以引入將在未知試樣中測得的標記第一受體的量與在不含目標分析物的對照試樣中測得的標記第一受體的量、或與在含已知量目標分析物的試樣中測得的標記第一受體的量進行關聯(lián)的附加步驟。
另一方面,本發(fā)明提供了同時進行夾心型測定的方法,用于確定試樣中目標分析物的存在或存在量,包括以下步驟(a)同時使推測含有目標分析物的試樣與能夠特定識別所述目標分析物的第一和第二受體接觸,以形成所述第一受體、目標分析物和第二受體的絡合物,所述第一受體采用熒光探針進行標記,所述熒光探針具有熒光團部分,其具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè),第二受體被結(jié)合到固體載體之上;(b)測量結(jié)合到固體載體上的標記第一受體的量或未反應的標記第一受體的量。
另一方面,本發(fā)明提供了同時進行夾心型測定的方法,進一步包括下述步驟將測得的標記第一受體的量與在不含上述目標分析物的對照試樣中測得的標記第一受體的量進行關聯(lián),或?qū)y得的標記第一受體的量與在含已知量目標分析物的試樣中測得的標記第一受體的量進行關聯(lián)。
另一方面,本發(fā)明提供了一種用于測定目標分析物的夾心型熒光免疫測定方法,該目標分析物能夠獨立識別兩種不同的受體而不互相干擾。這種方法利用兩種受體,每種受體用不同的染料標記。例如,一種受體用吸收和發(fā)射最大值分別為680nm和690nm的第一染料標記,另一種受體用吸收和發(fā)射最大值分別為695nm和705nm的第二染料標記。使用穩(wěn)態(tài)或過渡態(tài)測量法可以對分析物進行檢測和量化。在任一種情況下,對于實施例中所給出的,都在680nm下激發(fā)和在705nm下檢測。這類測定的基礎是能量傳遞,優(yōu)點在于它是均相的。
在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明涉及生物流體,包括血清、血漿、全血和尿的免疫測定。優(yōu)選在測定全血試樣之前,將全血中的紅細胞溶解。優(yōu)選的溶解紅細胞的方法包括加入硬脂酰溶血卵磷脂、十六酰溶血卵磷脂和肉豆蔻酰溶血卵磷脂。
根據(jù)所用免疫測定的類型,目標分析物可以是抗原、半抗原或抗體,受體可以是抗原或抗體??贵w可以是多克隆的或單克隆的。優(yōu)選抗體為單克隆抗體。本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以通過自然(Nature)256第495-497頁(1975)所報導的Kohler & Milstein方法得到,或者可以通過科學(Science)246第1275-1281頁(1989)的重組方法制備。
在一個實施方案中,目標分析物為藥物或藥物的代謝物。藥物可以是類固醇、激素、抗生素、免疫抑制劑、止喘藥、抗瘤劑、抗心律不齊藥、抗驚厥藥、抗關節(jié)炎藥、抗抑郁藥或強心甙。這些藥物的例子包括地高辛、洋地黃毒苷、茶堿、苯巴比妥、甲狀腺素、N-乙?;蒸斂ㄒ虬?、普奈米東、阿米卡星、慶大霉素、奈替米星、妥布霉素、卡馬西平、乙琥胺、丙戊酸、丙吡胺、利多卡因、普魯卡因胺、奎尼丁、甲氨蝶呤、阿米替林、mortriptyline、丙米嗪、地昔帕明、萬古霉素和環(huán)孢霉素。在優(yōu)選的實施方案中,藥物為地高辛。
在另一個實施方案中,目標分析物為肽,例如肽類激素如黃體生成素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺素、血管緊張肽I、血管緊張肽II、促乳素或胰島素。肽也可以是腫瘤標記,如癌胚抗原?;蛘?,肽也可以是病毒或病毒的一部分,例如風疹病毒或它的一部分。
本發(fā)明的方法提供了測量濃度為約1×10-5M/L-約1×10-13M,特別是濃度范圍為約1×10-9M/L-約1×10-12M/L的目標分析物的方法。對于藥物和它們的代謝物的測量來說,本發(fā)明的方法能夠測量的范圍為約5×10-9M/L-約5×10-12M/L,特別是約1×10-10M/L-約5×10-10M/L的濃度。對于肽的測量來說,本發(fā)明的方法能夠測量的范圍為約1×10-11M/L-約1×10-12M/L。
對熒光探針(結(jié)合的或游離的或兩者)的量的測量可以通過測量穩(wěn)態(tài)熒光或通過測量過渡態(tài)熒光來確定。在優(yōu)選的實施方案中,測量光的波長大于約500nm,優(yōu)選大于約650nm,更優(yōu)選大于約680nm或690nm。由于過渡態(tài)檢測體系采用了激光二極管,染料必須具有與二極管輸出波長匹配的激發(fā)最大值。我們使染料能夠與輸出波長為680、690、720、750或780 nm的其他商品激光二極管相匹配。因此,測量光的波長可以大于約680nm、690nm、720nm、750nm或780nm。濾長越向光譜的紅色區(qū)域移進,即,波長更大,背景上的信號就越密集(enrichment)。
在優(yōu)選的實施方案中,用過渡態(tài)測量方法來進行檢測和量化。由于優(yōu)化了吸收和發(fā)射波長,以及由于優(yōu)化了第一和第二染料的衰變時間,因此過渡態(tài)能量傳遞提供了改進的測量方法。這種優(yōu)化消除了瑞利(Rayleigh)和喇曼(Raman)散射,并最大程度地提高了傳遞效率,和最大程度地減少了通過第一染料使第二染料的直接激發(fā)。
因此,本發(fā)明的主要目的是提供具有極大增強的敏感性的改進的各種FIA。本發(fā)明的另一個目的是提供能夠快速(通常在幾分鐘內(nèi))而準確測量的FIA方法。本發(fā)明的一個目的是提供能夠測量極低濃度的可發(fā)熒光的物質(zhì)的FIA方法。本發(fā)明的一個目的是提供用于臨床調(diào)整(Clinical Setting)的FIA方法,該方法快速而準確,成本相對較低,并且能夠使用未修飾的生物試樣,如全血。
本發(fā)明的另一個目的是提供FIA方法,特別適合于利用改進的熒光檢測體系,該體系在上述引用的1992年3月22日申請、標題為“熒光計檢測體系”、系列號為07/855,238的美國專利申請中描述。本發(fā)明的又一個目的是提供均相“混合和閱讀(mix and read)”治療藥物測定方法,這種方法可用于確定在血清、血漿或全血中的地高辛水平。本發(fā)明的還一個目的是提供用于肽,例如風疹病毒或它的一部分的測定方法。本發(fā)明也提供了用于免疫測定的特殊熒光標記和探針,如本文所述。
本發(fā)明也提供了一種通過使熒光團部分與增溶軸向配體的活化形式反應合成標記組分的方法。本發(fā)明的特征還在于具有本發(fā)明的標記組分的熒光探針,它連接到特定結(jié)合對的一個成員或目標分析物或類似物上。術語“特定結(jié)合對”是指兩個不同分子(或組合物),其中一個分子在表面上或在腔中具有一定的面積,這個分子特定識別并結(jié)合到其他分子或包括其他分子的分子絡合物的特定空間和極性組織上。
本發(fā)明也提供了合成熒光探針的方法,包括將本發(fā)明的標記組分連接到兩個或多個增溶軸向配體的步驟。本發(fā)明也提供了在檢測推測含有目標分析物的試樣中的目標分析物時有用的工具(kit),包括本發(fā)明的標記組分或探針。
本發(fā)明也涉及新型的染料寡核苷酸共扼體、合成它們的方法及使用它們的方法。使用這些共扼體或探針的方法包括核酸雜交方法、核酸擴增法和核酸測序法。染料-寡核苷酸共扼體的染料部分是一種可檢測的已標記的標記組分,其具有熒光團部分,該熒光團部分具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
因此,一方面,本發(fā)明涉及具有連接到可檢測的已標記的標記組分上的低寡核苷酸的組合物,該標記組分具有熒光團部分,其具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
術語“寡核苷酸”是指核苷酸殘基的鏈。一般在本發(fā)明中有用的寡核苷酸長度為5-50個核苷酸。本發(fā)明的方法中使用的寡核苷酸探針包括DNA、RNA或可雜交為核酸序列的任何其他序列種類的多核苷酸。將會理解到這種核酸序列除了天然存在的堿基胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶外,還可以包括堿基類似物。這種堿基類似物包括次黃嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和8-氮鳥嘌呤。探針可以是雙鏈或單鏈的形式,但優(yōu)選單鏈形式。探針可以通過直接合成、聚合酶中介的延伸反應或通過克隆或其他常規(guī)方法制備。術語“連接”是指通過連接到兩個部分的中間體分子的化學結(jié)合。
在一個優(yōu)選方面,本發(fā)明涉及具有連接到可檢測的已標記的標記組分上的寡核苷酸的組合物,標記組分具有熒光團部分,其具有配位在中心原子上的基本上為平面的多齒大環(huán)配體,所述中心原子能與兩個軸向配體配位,這兩個軸向配體在所述大環(huán)配體任一側(cè)與中心原子配位。
優(yōu)選可檢測的已標記的標記組分的衰變時間范圍為約1納秒-約50納秒,更優(yōu)選衰變時間范圍為約5納秒-約20納秒。
特別優(yōu)選的是籠形二羧基硅酞菁。籠形二羧基硅酞菁染料可具有各種可用于偶聯(lián)的官能團。這些基團包括游離羧基、游離氨基和N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)。
優(yōu)選所要求保護的組合物的寡核苷酸長度為約5-約50個堿基。
寡核苷酸或多核苷酸與標記之間的連接可以使用縮合反應導致形成例如酰胺、酯、腙、縮氨基脲、硫代縮氨基脲、脲和硫脲得到實現(xiàn)。例如,連接體可以以氨基,優(yōu)選伯氨基終止。其他連接體可以以羧基終止。
另一方面,本發(fā)明提供了制備某些與染料共扼的寡核苷酸的方法。在一個實施方案中,這種方法包括以下步驟(a)使具有氨基末端的附著連接體的寡核苷酸與N-羥基丁二酰亞胺酯、或可檢測的已標記的標記組分的imidazolide反應以形成共扼體,所述標記組分含有熒光團部分,所述熒光團部分含有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);和從未反應的寡核苷酸或多核苷酸以及從未反應的染料中分離出在步驟(a)中形成的共扼體。通過使用二胺和氨基醇可以實現(xiàn)連接體對寡核苷酸的附著。優(yōu)選可檢測的已標記的標記組分含籠形二羧基硅酞菁染料。
或者,與染料共扼的寡核苷酸的制備可以通過下述步驟實現(xiàn)在羥基苯并三唑及寡核苷酸或多核苷酸的存在下,使可檢測的已標記的標記組分與碳化二亞胺反應形成共扼體,所述標記組分具有熒光團部分,所述熒光團部分具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);從反應混合物的其他組分中分離出產(chǎn)生的共扼體。優(yōu)選可檢測的已標記的標記組分含籠形二羧基硅酞菁染料。
另一方面,本發(fā)明涉及確定試樣中目標核酸序列的方法,包含以下步驟使試樣核酸與寡核苷酸標記的標記組分接觸,優(yōu)選標記組分為能在均相溶液中與上述目標核酸序列雜交的寡核苷酸籠形二羧基硅酞菁染料共扼體;通過過渡態(tài)極化熒光檢測這種雜交的存在和數(shù)量。
再一方面,本發(fā)明涉及檢測試樣中目標核酸序列的方法,包括以下步驟使推測含有目標核酸序列的試樣與能夠和上述目標序列雜交的互補寡核苷酸接觸;使上述試樣與寡核苷酸標記的標記組分接觸,優(yōu)選標記組分為能夠與上述互補寡核苷酸雜交的寡核苷酸籠形二羧基硅酞菁染料共扼體;檢測上述共扼體與上述互補寡核苷酸雜交的存在和數(shù)量。
另一方面,本發(fā)明涉及檢測或量化目標核酸的方法,其中目標核酸為核酸擴增的產(chǎn)物。核酸擴增方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、自動維持序列擴增(3SR)和基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS),本文將對這些方法進行討論。
另一方面,本發(fā)明涉及使用熒光探針作為標記改進核酸雜交方法或核酸擴增方法。熒光探針具有含熒光團部分的可檢測的已標記的標記組分,所述熒光團部分含偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
當與時間相關的過渡態(tài)檢測體系一起使用時,本發(fā)明的方法特別有用,如在共同轉(zhuǎn)讓的Studholme等于1992年3月23日申請、標題為“熒光計檢測體系”、系列號為07/855,238的美國專利申請中所述。該體系的特征在于過渡態(tài)檢測允許直接讀出試樣的時間相關的極化。該體系使用的激光二極管可以在非常高的頻率如10MHz速率下調(diào)諧,并表現(xiàn)出高輸出功率。一般激光“存在(ON)”時間約為2-3納秒。來自溶液的光子使用在單光子計數(shù)模式下操作的光電倍增管(PMT)進行檢測。與激光脈沖時間相比,光子事件與光子事件的相對時間是確定的。通過存儲單獨的光子事件時間,可以得到作為時間函數(shù)的光子頻率的直方圖。
另一方面,本發(fā)明提供了監(jiān)測核酸擴增過程的動力學的方法和/或量化目標試樣中核酸的方法。例如,在PCR擴增過程中,由寡核苷酸組成的探針被“蓋上(capped)”,并用含連接到可檢測的已標記的標記組分的寡核苷酸或多核苷酸的組合物標記,所述標記組分具有熒光團部分,所述熒光團部分具有偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。這種探針可以被直接加入到PCR反應中。術語“蓋上”是指3′末端已進行雙脫氧核苷酸反應。
與擴增產(chǎn)品的雜交可以在每種冷卻相中按動力學(kinetically)進行。隨著擴增產(chǎn)品濃度的增加,探針與擴增產(chǎn)品的結(jié)合速率也增加,并可對擴增產(chǎn)品的濃度進行量化。該信息與周期數(shù)一起對擴增前試樣中原始DNA的數(shù)量進行量化。
在序列測定中的應用。本發(fā)明的另一方面是在DNA測序中的應用,其中將可檢測的已標記的標記組分通過化學或酶的方式引入DNADNA在許多點發(fā)生斷裂,用凝膠電泳法分析收集的片段。如果需要,可以使用不同的標記組分進行標記,其中一種有助于各種堿基的分析。本發(fā)明的另一方面是關于熒光計的各種設計、變化或修改的較大范圍的應用。這種廣泛的應用將在下文特定類型的設備的實施例中有詳細描述。在非吸收性介質(zhì)中,如果入射角大于臨界角,當光波穿越被折射率較低的第二介質(zhì)B包圍的介質(zhì)A時,在介質(zhì)A的邊界發(fā)生全內(nèi)反射。但總的反射光的電磁場穿透邊界很短一段距離,能夠產(chǎn)生物理效應,如能激發(fā)靠近A和B的分界面的熒光團分子。
這種效應使均相、基于熒光的測定成為可能,在該測定中與固定在介質(zhì)A表面的分子發(fā)生特定反應,因此在界面(是僅有的位置)能夠發(fā)生熒光的激發(fā)。普通玻璃或塑料板不僅作為入射光的光學波導,而且也作為預先沉積在表面的已知位置的特定受體的載體。這種方法論被稱為“瞬逝光熒光免疫測定法(evanescent lightfluoroimmunoassay”(Herron等,美國專利第5,512,492號)。
有利的是,本發(fā)明將非常大的Stokes移位(Stokes′s shifts)的特征與在光譜近紅外區(qū)的發(fā)射結(jié)合,Stokes移位利用通常具有近UV激發(fā)區(qū)的基于含N大環(huán)(分類列于下文)的熒光染料。這類染料適用于以穩(wěn)態(tài)或過渡態(tài)模式進行的免疫/受體測定。激發(fā)源包括汞弧、氮激光器和氮激光抽運的染料激光器(nitrogen laser pumped dye laser)?;蛘?,這些相同的染料可以在近紅外中被二極管激光器激發(fā),得到極好的脈沖激發(fā)和過渡態(tài)檢測結(jié)果。激發(fā)源的選擇取決于上述具體的染料的吸光帶的位置、優(yōu)選的激發(fā)和檢測模式(無論是穩(wěn)態(tài)還是過渡態(tài))以及空間要求。
所總結(jié)的化學和設計用在“瞬逝光熒光免疫測定”中的設備的這些特征應當引起極低的背景和很高的信號水平,由此有利于高的測定靈敏度。
上述對本發(fā)明的概述是非限定性的,從下文對優(yōu)選實施方案的描述和從權(quán)利要求書中,本發(fā)明的其他特征與優(yōu)點將變得顯而易見。
附圖簡述圖1表示非特定結(jié)合和溶劑對熒光強度的影響,該圖顯示出與Al相比,Si的保護效果,這大概是由于Si具有兩個軸向配體,而Al只有一個配體??s寫Al trisulf=羥基三磺酸鋁、Si dicarb=雙-羥基(2,3-二羧基酞菁)硅IV、Si dicarb sulf=磺化的雙-羥基(2,3-二羧基酞菁)硅IV、BBKCl=硼酸鹽緩沖的KCl(參看實施例6中材料)、NHS=混合的正常人體血清、Cts=在FAST1過渡態(tài)熒光計的一個測量周期得到的讀數(shù)。Cts與熒光強度成比例。
圖2表示硅和鋁酞菁衍生物在溶劑效應和非特定結(jié)合方面的比較。結(jié)果表明作為中心原子,Si(具有兩個軸向配體)的存在比Al具有顯著的更佳性能。這一點由二羥基二羧基硅酞菁(Si dicarb)與三磺酸鋁(Al trisulf)相比,其在極化中具有極小的相對變化得到證明。通過磺化得到進一步提高,如二羥基二羧基硅酞菁磺酸鹽(Si dicarb,sulf)所示,該磺酸鹽可能具有兩個或三個磺酸鹽基團。如果用染料作為標記,則在甘油中的極化值指示的大約是電位極限。極化單位為毫極化(millipolarization)(mP)。進一步的縮寫信息參看圖1的說明。本領域技術人員將會認識到本發(fā)明的染料可以在可見光譜的較寬的范圍內(nèi)在大量的熒光應用中使用。
從下文對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述和從權(quán)利要求書中,本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見。
附圖沒有必要按比例。本發(fā)明的某些特征可以按比例擴大,或為了清晰和簡潔以示意的形式繪出。
本發(fā)明詳述本發(fā)明主要涉及改進的熒光標記組分和相關的產(chǎn)品和方法,所述組分具有連接到兩個或更多小的軸向配體上的基本上為平面的發(fā)光部分。優(yōu)選的熒光團包含有小的增溶軸向配體和熒光特性,下文描述了它的合成和應用方法。以下描述包括實施本發(fā)明的優(yōu)選模式,其主要目的是用于說明本發(fā)明的主要原理,而并非在任何意義對本發(fā)明作出限定。
I.優(yōu)選的標記組分下面是對在本發(fā)明的熒光免疫測定中使用的優(yōu)選標記組分的概述。更加完整的討論可以在共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列701,449號和201,465號中找到,如上所述,已將它們結(jié)合到本文作為參考。
A.優(yōu)選的熒光團部分適當?shù)臒晒鈭F部分含發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的熒光團部分中發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)具有基本上為平面的大環(huán)多齒配體,該配體絡合到中心原子上,中心原子可與兩個軸向配體絡合,其中一個軸向配體位于所述大環(huán)配體的任一側(cè)(即具有反式取向)。
優(yōu)選的中心原子為能形成八面體配位化合物的元素,該絡合物含兩個具有反式或軸向取向、位于平面大環(huán)配體的任一側(cè)且垂直于所述平面大環(huán)配體的配體。在某些應用中作為熒光標記組分使用時,中心原子不應具有太高的原子序數(shù)(約30或更小),這樣在通過與中心原子的軌道互相偶合時熒光不會減弱。
優(yōu)選的多齒配體包括含氮的大環(huán),其具有與π電子的共扼環(huán)體系。這些大環(huán)可任選被取代,包括在橋連碳原子或氮原子上的取代。適合的大環(huán)包括卟啉、氮雜卟啉、咕啉、sapphyrin、pentaphyrin和porphycene的衍生物結(jié)構(gòu)變體和其他含廣泛離域的電子的類似的大環(huán)。這些大環(huán)可以任選具有包含或不含雜原子如N、O或S的稠合芳環(huán)。由于它們包括有許多上述性質(zhì)的事實,特別優(yōu)選的一類大環(huán)包括卟啉衍生物和氮雜卟啉衍生物(其中至少一個橋連碳原子被氮原子置換的卟啉衍生物)。氮雜卟啉衍生物包括單-、雙-和三氮雜卟啉以及porphyrazine的衍生物。這些大環(huán)可任選具有包含或不含雜原子如O、N或S的稠合芳環(huán)。這些氮雜卟啉衍生物包括酞菁、苯并三氮雜卟啉和naphthalocyanine和它們的衍生物。許多這類化合物的制備方法和熒光質(zhì)量為已知的,并且一些這類化合物是商業(yè)可得的。參看美國專利申請系列201,465號和該文中所引用的參考文獻,特別是在該申請中的參考文獻2-5。
對某些應用如熒光極化檢測來說,優(yōu)選在結(jié)合形式下表現(xiàn)出高的極化度的氮雜卟啉衍生物,即那些能發(fā)射強極化光的衍生物。對于這些應用來說,優(yōu)選的是具有低對稱性程度的大環(huán),優(yōu)選具有低于D4h的對稱性程度的大環(huán)。優(yōu)選的一組包括具有至少一個稠合芳環(huán)的大環(huán)。因此,優(yōu)選的大環(huán)包括在能降低對稱性的位置上具有稠合芳環(huán)的氮雜卟啉衍生物。優(yōu)選的氮雜卟啉衍生物的種類包括具有低于D4h的對稱性程度的單氮雜卟啉、二氮雜卟啉和三氮雜卟啉。其他優(yōu)選的熒光染料在1995年6月6日申請、標題為“用于熒光測定的聚氧化烴基相關產(chǎn)品和方法”的美國專利申請08/476,544號,Lyon &Lyon Docket 211/167號中描述,將它們完整地結(jié)合到本文作為參考,包括所有附圖。
B優(yōu)選的小增溶軸向配體優(yōu)選的小增溶軸向配體包括-OH、-氧-叔丁基、-OCH2OH、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH2CH2O-CH2CH2OH、-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH、Cl、Br和F。
C優(yōu)選的標記組分的吸光率和極化性能含有偶合到兩個小的增溶軸向配體上的中心原子(如硅)的這些標記組分可通過過渡態(tài)熒光測量來表征。在這種測量中,對平行或垂直于激發(fā)脈沖的極化方向的兩種極化組分的強度進行監(jiān)測,監(jiān)測時間約為標記組分的衰變時間的3倍。這種曲線反映了消光系數(shù)、量子產(chǎn)額、衰變時間和極化狀態(tài),并在標記組分的化學和物理狀態(tài)方面提供了敏感性指示。例如,如果激發(fā)態(tài)被鈍化或被轉(zhuǎn)化為三重線態(tài),總的強度將會降低,并且衰變時間將會縮短。如果通過增加粘度或通過結(jié)合到大分子上而改變分子的旋轉(zhuǎn)布朗運動,平行組分與垂直組分的強度的比例將會增加。
在約5%的實驗誤差下,本發(fā)明的某些標記組分在DMF(有機溶劑)中與在SAP(含鹽疊氮化合物的磷酸鹽,一種中性含水緩沖液)中表現(xiàn)出相同的強度、衰變時間和極化。在某種程度上,在其他標記組分的制備中也具有這些特性。本發(fā)明的標記組分的區(qū)別性和重要的性質(zhì)在于對血清中組分的不敏感性(和不與其結(jié)合),這一點已經(jīng)通過血清在熒光極化組分的強度、衰變時間或相對數(shù)量方面不具有任何顯著的測量效果得到證明。對于在如使用生物材料的測定應用中使用的標記組分來說,這一點是至關重要的。
II優(yōu)選的標記組分的制備根據(jù)制備本發(fā)明的優(yōu)選標記組分的一個方法,在配體交換反應中以羥基或鹵素基團作為軸向配體的適當?shù)臒晒鈭F部分與活化形式的增溶部分反應,該反應按常規(guī)反應路線進行其中Mcl表示大環(huán)配體,CA為中心原子,X為被替換的配體,SM為增溶部分。該反應可以在凈相中(neat)進行,或者根據(jù)需要也可以在溶劑中進行。適合的溶劑包括喹啉、THF、DMF、咪唑(當其自身溶解在一種其他上述溶劑中時)等。適合的反應溫度可以根據(jù)大環(huán)原料和增溶基團的性質(zhì)而變化。反應通常在約2分鐘-約24小時內(nèi)完成。反應混合物可以在回流條件下或在例如沙浴的方式下方便地進行加熱。為了方便起見,反應可以在環(huán)境壓力下進行。
我們認為該反應以兩步進行,每次以一種共扼聚氧化烴基基團作為軸向配體進行絡合。
當在熒光免疫測定中作為熒光標記時,這些標記組分可以連接到特定結(jié)合對的一個成員(“標記的結(jié)合配偶體”)或該成員的類似物上。術語“結(jié)合配偶體”是指分子或分子絡合物,它能夠特定識別特定分子或分子絡合物或被特定分子或分子絡合物識別。標記組分可以直接附著或共扼在結(jié)合對上或經(jīng)連接臂附著或共扼在結(jié)合對上。
III利用本發(fā)明的標記組分可以用作用于熒光探針的熒光標記,可以用于熒光結(jié)合測定,也可以在體內(nèi)成像和體內(nèi)腫瘤治療中作為標記。
這些標記組分在常規(guī)的熒光結(jié)合測定中,包括在熒光極化免疫測定中可以有利地作為熒光標記。當如此使用時,這些標記組分可以連接到特定結(jié)合對的一個成員(“標記的結(jié)合配偶體”)或該成員的類似物上。標記組分可以直接附著或共扼在結(jié)合對上或經(jīng)連接臂附著或共扼在結(jié)合對上。
這些標記結(jié)合配偶體在具有各種形式的測定中是很有用的,例如涉及分析物或分析物結(jié)合配偶體(如果使用標記分析物或分析物的類似物)的競爭的測定,也可以在均相或多相測定中使用。
由于標記組分在水溶液不發(fā)生聚集,不具有溶劑敏感性(表明未檢測到聚集)以及對血清組分和其他生物大分子無特定結(jié)合,這些標記特別適合在檢測含生物液體(如血清)的試樣中的分析物的測定中使用。因此,這些標記組分可以作為熒光探針的標記用來檢測溶液中的分析物,其中由血清組分引起的非特定結(jié)合將嚴重地損害測定的靈敏度,影響其準確性和精確度。
或者,這些標記組分可以用作體內(nèi)成像中的試劑。當作為成像劑使用時,這些標記組分與特定結(jié)合對的一個成員共扼成為一個標記的結(jié)合配偶體。將這種標記結(jié)合配偶體引入到動物體內(nèi)。如果存在特定結(jié)合對的其他成員,所述標記的結(jié)合配偶體將結(jié)合到其他成員上,并且可以測量由標記組分產(chǎn)生的信號,識別其位置。
這些標記組分也可以用在體內(nèi)腫瘤治療中。例如,光動力學療法(photodynamic therapy)涉及將標記組分用作光敏劑。標記組分(熒光標記)共扼到結(jié)合配偶體上,結(jié)合配偶體可以特殊識別并結(jié)合到癌細胞組分上。
本發(fā)明提供了核酸探針與制造和使用這種探針的方法。使用這種新型核酸探針的方法包括目前已知或以后開發(fā)的各種核酸雜交排序技術,目前已知或以后開發(fā)的各種核酸擴增技術。本發(fā)明的探針(本文也指共扼體)和方法能夠在均相雜交測定中實現(xiàn)1飛摩爾(fmole)的靈敏度。正如本文所說明的,該靈敏度與由目前的多相雜交測量技術實現(xiàn)的靈敏度相當。但是,如上所述,目前的多相測定具有幾個缺點,這些缺點是由測量中包括多個步驟產(chǎn)生的,包括增加了污染的風險,增加了進行測定所需的時間。通過閱讀本文所提供的實施例,本發(fā)明的組合物和方法的其他優(yōu)點對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。
實施例為了幫助理解本發(fā)明,本文包括了以下實施例,用于描述一系列實驗的結(jié)果。當然,以下關于本發(fā)明的實施例不應當被解釋為是對本發(fā)明的特別的限定并且在本領域技術人員的范圍之內(nèi)的目前已知或以后開發(fā)的本發(fā)明的變體,都認為是在本文所描述的發(fā)明和以下所要求保護的范圍內(nèi)。
實施例1從1,2,4,5-四氰基苯(TCNB)合成四(二亞氨基)1,2,4,5-苯四酸二酰亞胺將1L的3-頸燒瓶中的20.0g(0.112mol)TCNB在真空中干燥約1小時。燒瓶配備有緩慢、高扭矩、Teflon葉片的攪拌器,用于在氨水中鼓泡或加入液體時所用的入口以及水冷凝器。將整個設備用氮氣沖洗后,加入400ml的甲醇,在室溫下開始攪拌并緩慢地對氨水鼓泡。
氨水的吸收非常有效,在幾分鐘后懸浮液變?yōu)橥该鞯G色溶液。幾分鐘后(在氨水的恒定加入下)溶液變?yōu)榛鞚幔⑶覝囟壬杂猩?。從開始加入氨水起40分鐘后,反應混合物變得難以攪拌,在繼續(xù)攪拌和加入氨水下再加入200ml甲醇。此時,氨水的吸收仍然非常有效,這一點可以通過無泡沫從懸浮液表面冒出得到證明。100分鐘后,有必要再加入175ml甲醇以使攪拌能夠進行。在125分鐘后,在冷凝器的出口出現(xiàn)大量的氨水,將反應混合物放入45℃的水浴中,再繼續(xù)攪拌、加熱和加入氨水240分鐘。冷卻后,將反應混合物在4℃下儲存24小時。隨后將固體通過在Whatman#42濾紙上抽吸過濾,并在真空下干燥。產(chǎn)率23.2g(0.109mol)。
實施例2雙-氯(2,3-二羧基酞菁)硅(IV)的合成將二亞氨基異二氫吲哚(30.0g,0.207mol)和四亞氨基1,2,4,5-苯四酸二酰亞胺(10.5g,0.050mol)一起磨碎,并在1升的3頸燒瓶中在真空下干燥過夜。燒瓶配備Teflon葉片混合器、隔片、溫度計和帶有硅膠干燥管的回流冷凝器。將裝有攪拌的反應物的設備用干燥氮氣沖洗,在氮氣條件下加入600ml的喹啉并在氮氣流下攪拌30分鐘。得到均勻、流動的懸浮液。此后,在5分鐘內(nèi)通過隔片緩慢地加入60ml四氯化硅。溶液變黑,在不加熱條件下繼續(xù)攪拌15分鐘。
然后,在持續(xù)攪拌下,將預先加熱到195℃的油浴升高到浸沒燒瓶內(nèi)物質(zhì)的位置。5分鐘后,油浴溫度降到175℃,再經(jīng)15分鐘后油浴穩(wěn)定在185-190℃,將其再維持60分鐘。然后將油浴降低,使反應混合物冷卻約15分鐘。然后開始通入氮氣流以除去未反應的四氯化硅,其可以在冷凝器出口處用濕的pH試紙檢測到。在約45分鐘的通風后,將現(xiàn)為100℃的油浴恢復到原處,繼續(xù)緩慢加熱到約130℃以有利于除去四氯化硅,再經(jīng)過70分鐘后經(jīng)上述測試,當僅有明顯的喹啉煙霧時四氯化硅已完全除去。
然后除去油浴,當反應混合物冷卻至約80℃時,在混合下加入424ml水和424ml濃鹽酸的混合物。繼續(xù)加熱,最終混合物為酸性。將反應產(chǎn)物在室溫下保持過夜。第二天在混合下,再加入424ml水和424ml濃鹽酸,將混合物在室溫下放置一整夜。
然后將反應混合物在瓷漏斗(24cm濾紙)上過濾,用水洗滌,在通風櫥中風干一整夜。將濕濾餅在1升的丙酮中攪拌并過濾。將洗滌后的物質(zhì)在通風櫥中干燥2天,干燥后的物質(zhì)(50g)在有丙酮的研缽中磨碎,將混合物攪拌、過濾并在真空下干燥,剩下47.9g的黑色細碎的固體。
實施例3雙-氯(2,3-二羧基酞菁)硅(IV)(二羧基二氯染料)的水解用長頸漏斗將濃硫酸(98ml)裝入250ml的圓底燒瓶中,以避免沾濕燒瓶頸。在磁性攪拌下將16.3g的二羧基二氯染料分成小部分通過短頸漏斗加入。加入過程持續(xù)約1小時,以便在加入更多固體之前使染料塊分散。將干燥管與燒瓶連接,將混合物在油浴中加熱,并在50℃下保持24小時。
將反應燒瓶從油浴中移出,在冰中冷卻。在無冷卻條件下小心地將水(75ml)分成小部分加入,在攪拌條件下將混合物在80℃的油浴中加熱20小時。冷卻之后,將混合物倒入在1升的燒杯中的冰中,并進行攪拌。
將混合物在室溫下在2000xg下離心分離30分鐘。沉積物懸浮在水中(約250ml),再次對其進行離心分離。重復該洗滌過程,收集沉積物,并將其懸浮在300ml 1M的K2CO3中。將混合物在用表面皿覆蓋的燒杯中在攪拌條件下加熱。10分鐘內(nèi)溫度達到90℃,在約93℃繼續(xù)加熱50分鐘。在仍舊熱的情況下將混合物用濃HCl酸化,使其冷卻并在室溫下保持2天。
然后將固體收集在11cm的瓷漏斗(使用Whatman#42濾紙)上進行過濾,過濾大約需要1小時。將固體在漏斗上用3×100ml的水分次洗滌,然后在通風櫥中風干。然后將固體打碎,在真空下用P2O5和KOH干燥。收率13.3g(87%)。
實施例4用二氧化硅色譜吸附作用提純雙-羥基(2,3-二羧基酞菁)硅IV(二羧基染料)將在實施例3中制得的3.0g粗二羧基染料裝入250ml的瓶中,向其中加入100ml含2%(體積)乙基二異丙基胺(DIEA)的MeOH,將混合物攪拌30分鐘。之后,加入43g二氧化硅(EM Science),用手對混合物進行振蕩以形成黑色糊狀物。20分鐘后,再加入100ml含2%DIEA的MeOH,將瓶子倒置幾分鐘,并將內(nèi)容物攪拌20分鐘。除MeOH和DIEA外通過加入EtOH以調(diào)整溶劑的性質(zhì),這種調(diào)整改變了經(jīng)過萃取的染料的組成,使單組分的萃取成為可能。然后將固體在減壓下在燒結(jié)玻璃板漏斗(微孔性,直徑6.5cm)上過濾。為了防止MeOH過大的損失,通過連接到部分真空罐(partially evacuatadtank)來維持減壓狀態(tài)。經(jīng)一整夜過濾后,將殘余物用2×50ml的MeOH+DIEA分次洗滌約30小時。將濾液(230ml)在旋轉(zhuǎn)式汽化器中濃縮至接近干燥。將殘余物溶解在14ml MeOH+DIEA中,將溶液分成等分并裝入兩個40ml的錐形離心管中。
將各個管所含的物質(zhì)用200μl濃HCl酸化,然后加入水使離心管接近充滿。通過倒置和振蕩幾次來混合管中物質(zhì),在約650xg下離心分離30分鐘。然后棄去褐色的上層液體,沉積物用0.01 MHCl洗滌3次。將沉積物轉(zhuǎn)移到100ml圓底燒瓶中,通過旋轉(zhuǎn)汽化將混合物干燥,然后在真空下用H2SO4和KOH干燥。干重為304mg(純的二羧基染料)。
實施例5用氯磺酸磺化純的二羧基染料稱量161mg純的二羧基染料(實施例4)并裝入帶有磁性混合器的50ml長頸圓底燒瓶中。在室溫下在N2下加入3.4ml的ClSO3H。裝上帶有N2球形瓶的小的空氣冷凝器,將燒瓶和內(nèi)容物在110℃的油浴中加熱約3.7小時。此時,取出50ml試樣用于測試。在110℃再繼續(xù)加熱3.3小時,隨之停止加熱取出第二個試樣。向兩個試樣中加入冰,將每個試樣都用水稀釋至重量為390mg。然后向各個試樣中加入2ml 1M的NaHCO3,通過用2ml的中性緩沖液稀釋10μl的稀釋試樣進行測量,測出每個試樣的吸光率。兩個樣品的Amax都出現(xiàn)在690nm,在3.7小時的試樣讀數(shù)為0.650,在7小時的試樣讀數(shù)為0.490,這表明在最后3.3小時的加熱期間,染料約有25%被破壞。
將主要的反應混合物分成小部分加入在燒杯中的冰中,然后將冷的混合物在約700xg下離心分離30分鐘。棄去極輕微著色的上層液體。將沉積物懸浮在30ml的冰冷的水中,將其與水一起轉(zhuǎn)移到250ml的錐形瓶中,用約40ml 1M的KHCO3使其成為堿性,并在室溫下攪拌一整夜。將反應混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中,用濃HCl酸化,在室溫下攪拌6小時,并在室溫下保存48小時。
將反應混合物在約700xg下進行離心分離,保留著色的上層液體,將沉積物溶解在1M的NaHCO3中并攪拌2小時。將深綠色的溶液通過Sep Pak(2g大小,Rainin),將經(jīng)酸化后的濾液與從離心中得到的上層液體合并??傮w積約400ml。將深藍色酸性溶液在Sep Pak上吸收,在柱上用3N HCl洗滌,用MeOH洗脫。并用MeOH和3NHCl洗滌后的Sep Pak可以反復使用。通過旋轉(zhuǎn)汽化和在真空下用H2SO4與KOH對含染料的MeOH洗脫物進行干燥。產(chǎn)率158mg。
實施例6非特定結(jié)合的測量和硅和鋁酞菁的溶液性質(zhì)的表征材料1)硼酸鹽緩沖的KCl(BBKCl)該緩沖液通過混合下述物質(zhì)制備33.1ml的0.70M硼酸、4.0ml的0.50M K2B4O7、75ml的4.0MKCl、H2O(使溶液達到1升),pH約8.1。
2)將磺化二羧基硅酞菁(實施例5)、二羧基硅酞菁(實施例4)和三磺酸鋁、鈉鹽(卟啉產(chǎn)物)溶解在BBKCl中。這些溶液的濃度如下確定在含5%(體積)的乙基二異丙基胺的甲醇中的每種試樣的稀釋液的NIR最大值(約680nm)下測量吸光率,并假定所有試樣的摩爾消光系數(shù)的值為2×105L/mol。然后在BBKCl中制備稀釋液,以得到濃度為5×10-8M的每種染料的溶液。
熒光測量。在過渡態(tài)極化熒光計(FAST1,Hyperion,Inc.Miami,F(xiàn)L)中對極化和強度進行測量,在每種情況下,都通過用1ml BBKCl、BBKCl+1%(體積)的混合正常人體血清(L3833,10/18/84)或甘油稀釋10微升的濃度為5×10-8M的染料(第2項的材料)溶液進行測量。
結(jié)果如圖1和圖2所示,如通過熒光強度和極化測量評估一樣,對三種染料的非特定結(jié)合和溶劑敏感性進行表征。關于強度,所需的性質(zhì)穩(wěn)定地取決于溶劑組成和高熒光輸出。另一方面,在低粘度的介質(zhì)中理想地極化應當仍舊較低,在粘性溶劑如甘油中應當盡可能地較高。
圖1表示來自鋁酞菁三磺酸鹽的熒光強度是對溶劑非常敏感的。對比之下,二羥基二羧基硅酞菁磺酸鹽表現(xiàn)出了顯著的改進的性能,在緩沖液、緩沖液加血清或單獨的甘油中具有幾乎相同的熒光輸出。與二羥基二羧基硅酞菁(無磺酸鹽基團)相比,可看出部分這種改進效果是由于對其進行的磺化,二羥基二羧基硅酞菁本身比鋁化合物對于血清和溶劑具有較小的敏感性。
圖2更有力地表明當與鋁作為中心原子進行對比時,僅中心硅原子的存在也會導致對環(huán)境的敏感度降低。這種差異最可能是由于以下事實Si具有兩個軸向配體,因此由于“保護基團”存在于分子平面的每一側(cè),從而可“保護”染料的平面結(jié)構(gòu)不受溶劑的作用。在鋁的情況下,僅存在一個軸向配體,因此分子平面的一側(cè)可以無拘束地受到溶劑作用。在圖2中,明顯可以看出這種相互作用的結(jié)果使Al染料的極化出現(xiàn)非常大的增長,接近通過將染料放入甘油(表明如果旋轉(zhuǎn)運動接近停止,極化的近似極限)可得到的最大值。
結(jié)論當然,以上關于本發(fā)明的實施例應用不應當被認為用來限定本發(fā)明的范圍。在本領域技術人員的范圍內(nèi),目前已知的或以后開發(fā)的本發(fā)明的這些變體都被認為是在下文所要求保護的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本說明書中提及的所有專利和出版物指示了本發(fā)明所屬領域技術人員的水平。就像每種單獨的出版物被特別和獨立指出結(jié)合入本文作為參考一樣,所有專利和出版物都在相同程度上結(jié)合入本文作為參考。
這里示例性描述的本發(fā)明可以在不存在任何一種或多種元素、本文中沒有特別公開的一種或多種限定的情況下進行適當?shù)貙嵤?。因此,例如,在本文的各個例子中,術語“包含”、“基本上由…組成”和“由…組成”中的任何一個可以被其他兩個術語中的任一個代替。文中使用的術語和表述是作為描述性的,而不是限定性的,并且在使用這種術語和表述時沒有任何傾向排除其顯示和描述的或其一部分的性質(zhì)的等價物,但認識到在本發(fā)明所要求保護的范圍內(nèi)各種修改都是可能的。因此,應當理解盡管本發(fā)明通過優(yōu)選實施方案和任選特性進行特別公開,但本領域技術人員可以對本文公開的概念進行修改和改變,并且認為這種修改和變形是在由附加的權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
其他實施方案在以下的權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種可檢測的已標記的標記組分,所述標記組分包含發(fā)光的基本上為平面的熒光團部分,所述熒光團部分偶聯(lián)到兩個或更多小的增溶軸向配體(axialligand)上,其中一個軸向配體位于所述熒光團部分的任一側(cè)。
2.權(quán)利要求1的標記組分,其中所述熒光團部分含配位到中心原子上的大環(huán)多齒配體,所述增溶軸向配體獨立選自羥基、氯、溴、氟、OCH3和O-CH2OH。
3.權(quán)利要求2的標記組分,其中所述標記包含兩個增溶羥基部分,一個增溶羥基部分在所述大環(huán)配體的任一側(cè)連接到所述中心原子上。
4.權(quán)利要求3的標記組分,其中所述兩個羥基部分包含配位到所述中心原子上的軸向配體。
5.權(quán)利要求4的標記組分,其中所述中心原子能夠形成八面體配位化合物。
6.權(quán)利要求5的標記組分,其中所述大環(huán)配體具有共扼π電子體系。
7.權(quán)利要求6的標記組分,其中所述大環(huán)配體包含含氮大環(huán)。
8.權(quán)利要求7的標記組分,其中所述大環(huán)配體選自卟啉衍生物、或具有一個或多個橋連碳原子被氮原子置換的卟啉衍生物、咕啉衍生物、sapphyrin衍生物或porphycene衍生物。
9.權(quán)利要求8的標記組分,其中所述中心原子選自硅、鍺、磷和錫。
10.權(quán)利要求9的標記組分,其中所述大環(huán)配體具有低的對稱性程度,因此增強了平行于吸收極化的發(fā)射極化。
11.權(quán)利要求10的標記組分,其中所述中心原子為硅或鍺。
12.權(quán)利要求11的標記組分,其中所述大環(huán)配體具有比D4h低對稱性的對稱性程度。
13.權(quán)利要求12的標記組分,其中所述大環(huán)配體具有至少一個稠合芳環(huán)。
14.權(quán)利要求9的標記組分,其中所述大環(huán)包含卟啉衍生物,其中所述卟啉衍生物中1-4的橋連碳原子被氮原子置換。
15.權(quán)利要求14的標記組分,其中所述大環(huán)包含四苯并三氮雜卟啉(tetrabenzotriazaporphyrin)衍生物。
16.權(quán)利要求15的標記組分,其中所述大環(huán)選自四苯并三氮雜卟啉、27-苯基四苯并三氮雜卟啉和27-(對-甲基苯基)四苯并三氮雜卟啉。
17.權(quán)利要求16的標記組分,其中所述中心原子為硅。
18.權(quán)利要求13的標記組分,其中所述大環(huán)配體包含酞菁衍生物。
19.權(quán)利要求1的標記組分,其中所述熒光團部分為naphthalocyanine或naphthalocyanine衍生物。
20.權(quán)利要求1的可檢測的已標記的標記組分,其中所述偶聯(lián)到兩個或更多小的增溶軸向配體上的熒光團部分的特征在于在水溶液中在血清組分存在時的過渡態(tài)(transient state)熒光發(fā)射具有與不存在血清時基本相同強度的平行和垂直組分。
21.權(quán)利要求1的可檢測的已標記的標記組分,其中所述發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)具有至少約500nm的激發(fā)波長,當與不偶聯(lián)到兩個或更多羥基部分的裸露的熒光團部分相比時,所述標記組分降低了對血清組分的非特定結(jié)合。
22.權(quán)利要求21的標記組分,其中所述熒光團部分的激發(fā)波長為約600-800nm。
23.權(quán)利要求22的標記組分,其中所述熒光團部分的激發(fā)波長至少為650nm。
24.權(quán)利要求21的標記組分,其中所述標記組分在存在和不存在血清時,具有基本上相同的極化組分的強度、衰變時間和相對數(shù)量。
25.權(quán)利要求21的標記組分,其中所述熒光團部分單獨具有至少比完全標記組分(complete marker component)的結(jié)合常數(shù)大60倍的結(jié)合常數(shù)。
26.權(quán)利要求21的標記組分,其中所述熒光團選自(1)末端為芳基的聚甲炔染料;(2)醌型染料;(3)陰丹士林染料;(4)1,4-二氨基蒽醌-2,3-二羧酰亞胺;(5)四氨基蒽醌;(6)吖嗪染料;(7)吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料和(8)萘醌甲基化物。
27.一種合成權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分的方法,包括使所述熒光團部分與所述增溶軸向配體的活化形式反應的步驟。
28.一種在推測含有目標分析物的試樣中檢測所述目標分析物的方法,該方法包括以下步驟(a)使權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分與目標分析物或其類似物連接;(b)使所述推測含有所述目標分析物的試樣與連接到目標分析物或其類似物的已知量的標記組分接觸;(c)使所述推測含有所述目標分析物的試樣與特定結(jié)合到所述目標分析物的受體接觸;(d)測定所述連接到結(jié)合于所述受體的目標分析物或其類似物的標記組分的量,或未結(jié)合的目標分析物或其類似物的量。
29.一種熒光探針,所述熒光探針包含權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分,連接到特定結(jié)合對的一個成員或目標分析物或類似物上。
30.權(quán)利要求29的探針,其中所述受體目標分析物或其類似物直接附著在所述熒光團部分上。
31.權(quán)利要求29的探針,其中所述受體目標分析物或其類似物經(jīng)連接臂共軛到所述熒光團部分上。
32.權(quán)利要求29的探針,其中所述受體目標分析物或其類似物選自地高辛、洋地黃毒苷、茶堿、苯巴比妥、乙?;蒸斂ㄒ虬贰⑵漳蚊讝|、苯妥英、風疹抗體和每種物質(zhì)的衍生物。
33.權(quán)利要求29的熒光探針,其中所述特定結(jié)合對的成員具有至少一個空間耐受(sterically tolerant)標記組分附著點,它可使所述探針形成特定結(jié)合對。
34.一種合成熒光探針的方法,包括使權(quán)利要求1-26的任一項的標記組分連接到兩個或更多增溶軸向配體上的步驟。
35.一種在推測含有目標分析物的試樣中檢測所述目標分析物的方法,該方法包括以下步驟(a)使推測含有所述目標分析物的試樣與能夠特定結(jié)合到所述目標分析物的第一受體接觸,以形成所述目標分析物與所述第一受體的絡合物,所述第一受體用含權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分的熒光探針標記;(b)使所述絡合物與能夠特定結(jié)合到所述目標分析物的第二受體接觸,所述第二受體被結(jié)合于固體載體上,以形成所述第一標記受體、所述目標分析物和結(jié)合于所述固體載體的所述第二受體的絡合物;和(c)測量結(jié)合到所述固體載體的標記第一受體的量或未結(jié)合的標記第一受體的量。
36.權(quán)利要求35的方法,進一步包括下述步驟將在所述推測含有所述目標分析物的試樣中測得的用熒光探針標記的所述第一受體的量與在不含目標分析物的對照試樣中測得的用熒光探針標記的所述第一受體的量進行關聯(lián),或與在含已知量的所述目標分析物的試樣中測得的用熒光探針標記的第一受體的量進行關聯(lián)。
37.權(quán)利要求35的方法,進一步包括從所述未結(jié)合的標記第一受體中分離出所述固體載體的步驟。
38.一種測定在推測含有目標分析物的試樣中目標分析物的存在或存在量的方法,包括以下步驟(a)同時使所述推測含有目標分析物的試樣與能夠特定識別所述目標分析物的第一和第二受體接觸,以形成所述第一受體、所述目標分析物和所述第二受體的絡合物,所述第一受體用包含權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分的熒光探針標記,所述第二受體被結(jié)合于固體載體上;和(b)測量與所述固體載體結(jié)合的所述標記第一受體的量或未反應的標記第一受體的量。
39.權(quán)利要求38的方法,進一步包括下述步驟將在推測含有目標分析物的試樣中測得的標記第一受體的量與在不含目標分析物的對照試樣中測得的標記第一受體的量進行關聯(lián),或與在含已知量的所述目標分析物的試樣中測得的標記第一受體的量進行關聯(lián)。
40.一種在推測含有目標分析物的試樣中測量所述能夠結(jié)合到兩種不同受體的目標分析物的方法,包括以下步驟(a)使所述推測含有所述目標分析物的試樣與能夠特定結(jié)合到所述目標分析物的第一受體接觸,以形成所述目標分析物與所述第一受體的絡合物,所述第一受體用含權(quán)利要求1-26的任一項的標記組分的熒光探針標記;和(b)使所述絡合物與能夠特定結(jié)合到所述目標分析物的第二受體接觸,所述第二受體的吸收和發(fā)射的最大值與所述第一受體的值不同。
41.一套用于在推測含有目標分析物的試樣中檢測所述目標分析物的工具(kit),所述工具包括權(quán)利要求1-26中任一項的標記組分。
42.一套用于在推測含有所述目標分析物的試樣中檢測所述目標分析物的工具,所述工具包括權(quán)利要求27-31中任一項的熒光探針。
43.一種含寡核苷酸的組合物,所述寡核苷酸連接到權(quán)利要求1-26中任一項的可檢測的已標記的標記組分上。
44.權(quán)利要求43的組合物,其中所述可檢測的已標記的標記組分的衰變時間范圍為約1納秒-約50納秒。
45.權(quán)利要求44的組合物,其中所述衰變時間在約5納秒-約20納秒的范圍內(nèi)。
46.權(quán)利要求43的組合物,其中所述寡核苷酸具有5-50個堿基的長度。
47.權(quán)利要求43的組合物,其中所述鍵包含(CH2)6O。
48.權(quán)利要求43的組合物,其中所述鍵包含(CH2)2NH。
49.一種制備標記組分共扼寡核苷酸的方法,包括以下步驟(a)使末端為氨基的附著連接體的寡核苷酸與N-羥基-丁二酰亞胺酯反應,或與標記組分的imidazolide反應以形成共扼體,所述標記組分為含連接到可檢測的已標記的標記組分上的寡核苷酸的組合物,所述已標記的標記組分含熒光團部分,所述熒光團部分含偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);和(b)從未反應的寡核苷酸和從未反應的標記組分中分離出步驟(a)中形成的共扼體。
50.權(quán)利要求49的方法,進一步包括在步驟(a)之前進行下述步驟將末端為氨基的連接體附著在寡核苷酸上。
51.一種制備標記組分共扼的寡核苷酸的方法,包含以下步驟(a)使標記組分在hydrobenzotriole和寡核苷酸的存在下與碳化二亞胺反應形成共扼體,所述標記組分為含連接到可檢測的已標記的標記組分上的寡核苷酸的組合物,所述已標記的標記組分含熒光團部分,所述熒光團部分含偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè);和(b)從所述反應混合物的其他組分中分離出在步驟(a)中形成的共扼體。
52.一種測定試樣中目標核酸序列的存在和數(shù)量的方法,包括以下步驟(a)使試樣核酸與權(quán)利要求43的組合物接觸,其中所述組合物能夠在均相溶液中與所述目標核酸序列雜交;和(b)通過過渡態(tài)極化熒光檢測這種雜交的存在和數(shù)量。
53.一種檢測試樣中目標核酸序列的方法,包括以下步驟(a)使推測含有目標核酸序列的試樣與能夠與所述目標序列雜交的互補寡核苷酸接觸;(b)使所述試樣與權(quán)利要求1的組合物接觸,其中所述組合物能雜交為所述互補寡核苷酸或多核苷酸;和(c)檢測所述共扼體與所述互補寡核苷酸或多核苷酸的雜交的存在或測量雜交的數(shù)量。
54.權(quán)利要求51-53中任一項的方法,其中所述目標核酸序列選自核酸擴增的產(chǎn)物、DNA和RNA。
55.權(quán)利要求54的方法,其中所述核酸擴增通過選自下述的方法進行聚合酶鏈反應(PCR)、配體鏈反應(LCR)、自動維持序列擴增(3SR)和基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)。
56.在一種核酸擴增方法中,所述改進包括使用熒光探針作為標記,該探針含可檢測的已標記的標記組分,所述標記組分含熒光團部分,所述熒光團部分含偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
57.在一種核酸擴增雜交方法中,所述改進包括使用熒光探針作為標記,該探針含可檢測的標記標記組分,所述標記組分含熒光團部分,所述熒光團部分含偶聯(lián)到兩個小的增溶軸向配體上的發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu),其中一個軸向配體位于所述平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)。
58.權(quán)利要求43的組合物,其中所述組合物具有熱穩(wěn)定性。
59.權(quán)利要求58的組合物,其中所述組合物在90℃下暴露1小時后是穩(wěn)定的。
60.權(quán)利要求59的組合物,其中所述組合物在100℃下暴露10分鐘后是穩(wěn)定的。
61.一套工具,所述工具包括權(quán)利要求43的組合物和標記、包裝或用法說明。
62.一種使用權(quán)利要求62的工具的方法,包括按照所述標記、包裝或用法說明使用所述組合物。
63.一種制造權(quán)利要求61的工具的方法,包括使所述組合物與所述標記、包裝或用法說明結(jié)合的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及標記組分、熒光探針、寡核苷酸、雜交試樣和使用這些產(chǎn)品的免疫測定以及制備這些產(chǎn)品的方法。本發(fā)明提供了一種可檢測的已標記的標記組分,該組分含偶聯(lián)到兩個或更多小的增溶軸向配體上的熒光團部分,[定義]優(yōu)選這種組分可減少或消除溶劑敏感性和非特定結(jié)合的問題。
文檔編號G01N33/533GK1344293SQ99815809
公開日2002年4月10日 申請日期1999年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月25日
發(fā)明者W·B·丹德里克, M·L·許 申請人:海珀里昂有限公司
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