專利名稱：植物組學(xué);應(yīng)用于草藥組合物的以基因組為依據(jù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草藥組合物。更具體點(diǎn)，本發(fā)明提供改進(jìn)篩選、檢測、質(zhì)控和生產(chǎn)草藥組合物的工具和方法，以幫助引導(dǎo)新草藥組合物的開發(fā)并鑒定已存在的草藥組合物的全新用途。
背景技術(shù)：
此處所有出版物和專利申請由文獻(xiàn)同等程度被引入作為參考文獻(xiàn)，就象每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍惶囟ǖ貑为?dú)地指明被引入作為參考文獻(xiàn)一樣。
亞洲和歐洲人已經(jīng)使用了草藥好幾個(gè)世紀(jì)。在美國(US)，草藥已在膳食補(bǔ)充劑工業(yè)和整體醫(yī)學(xué)中變得具有商業(yè)價(jià)值。大約美國人群的1/3已試過某種形式的可替代的醫(yī)療至少一次。(Eisenberg等，1993，N.Eng.J.Med.328246-252)。
植物，包括草藥，也成為鑒定用于治療疾病的新型活性劑的焦點(diǎn)。植物提取物來源的活性化合物，一直是藥物工業(yè)所感興趣的。例如，紅豆杉醇是從西部紫杉醇樹樹皮獲得的抗腫瘤藥物。預(yù)計(jì)當(dāng)今普遍使用和須開處方的成千上萬的藥品的約百分之五十來源于植物或包含植物化合物的化學(xué)模擬物。(Mindell，E.R.，1992，EarlMindell’s Herb Bible，A Fireside book)。
當(dāng)前，許多藥物劑型、食品添加劑、膳食補(bǔ)充劑及其類似物中包含草藥成分或草藥提取物。在許多不同的國家，草藥用于治療人類和動(dòng)物的各種疾病已有很長時(shí)間(見，如，I.A.Ross，1999，MedicinalPlants of the World，Chemical Constituents，Traditional andModern medicinal Uses，Humana Press；D.Molony，1998，TheAmerican Association of Oriental Medicine’s Complete Guide toChinese Herbal Medicine，Berkley Books；Kessler etal，1996，The Doctor’s Complere Guide to Healing Medicines，Betkley Health/Reference Books)；Mindell，Supra)。
草藥醫(yī)學(xué) 世界上有許多草藥醫(yī)學(xué)的分支，比如印度草藥醫(yī)學(xué)，Unani，Sida和傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)(TCM)?，F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)通常包含服用一種能干擾特定生化途徑的單一化學(xué)實(shí)體，而TCM的每種處方通常包含來自幾種草藥的成千上百種化學(xué)實(shí)體，它們被設(shè)計(jì)為以一種協(xié)同的方式同體內(nèi)多個(gè)靶點(diǎn)作用。盡管經(jīng)驗(yàn)實(shí)踐給這些古老的草藥醫(yī)學(xué)的草藥組合物和處方做出了重要貢獻(xiàn)，一套完全不同于現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)關(guān)于解剖學(xué)、藥理學(xué)、病理學(xué)、診斷治療等等方面的理論在不同程度上支持這些古老的草藥醫(yī)學(xué)。在各種草藥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，TCM已在好幾個(gè)世紀(jì)中發(fā)展了一套較完整的理論，并且在大中國及包括韓國和日本在內(nèi)的東亞地區(qū)由當(dāng)?shù)蒯t(yī)生詳細(xì)記錄，并在大量人群中進(jìn)行實(shí)踐。(＞13億人)。
西方醫(yī)學(xué)一般使用純化的化合物，或天然的或合成的，主要直接針對一個(gè)單獨(dú)的生理靶點(diǎn)。而TCM所用的組合物通常由多種草藥和化合物組成，是根據(jù)獨(dú)特的整體觀念針對體內(nèi)多個(gè)靶點(diǎn)。TCM主要運(yùn)用炮制過的天然產(chǎn)物粗品，以不同組合和劑型，來處理引起較少副作用的各種疾病。世界上絕大多數(shù)人都已認(rèn)識(shí)到TCM的巨大潛力。
經(jīng)典TCM處方中的草藥分為主藥和次藥，次藥包括輔藥、佐藥及引藥。主藥在治療一種疾病的病因或主要癥狀時(shí)起主導(dǎo)作用。輔藥幫助加強(qiáng)主藥的作用并在治療伴隨癥狀時(shí)起主導(dǎo)作用。有三種佐藥1)用于提高主藥和輔藥的療效或治療三級(jí)癥狀的草藥2)用于減小或消除主藥和輔藥的毒性和其他副作用的草藥及3)作用于不受主藥特定作用的補(bǔ)充性靶組織的草藥。引藥在處方或劑型中引導(dǎo)其他草藥對靶點(diǎn)的作用和/或協(xié)調(diào)和介導(dǎo)其他草藥的作用。與大部分由一種植物的一個(gè)或多個(gè)部分組成的草藥或添加劑相反，TCM的預(yù)期作用是針對多個(gè)組織。
例如，著名的TCM處方，用于治療哮喘的“麻黃湯”由麻黃、桂枝、苦杏仁和甘草組成。麻黃是主藥，祛塞發(fā)汗、宣暢肺氣以緩解最主要的癥狀哮喘。桂枝，作為輔藥，促進(jìn)麻黃的祛寒發(fā)汗的作用。溫通經(jīng)脈、助陽化氣，以減輕頭痛和身痛?？嘈尤剩鳛樽羲?，降肺氣，并增強(qiáng)麻黃的平喘之功。甘草作為引藥緩和麻黃和桂枝的作用以保證真氣的平衡。盡管這四種草藥的每一種都清楚地表現(xiàn)了其各自的作用，當(dāng)他們合用時(shí)，互相完善并且補(bǔ)充。事實(shí)上，可根據(jù)病人表現(xiàn)的癥狀主藥可與一種或多種次藥配方。(傳統(tǒng)中醫(yī)處方，第一章，pp10-16，E.Zhang主編，上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，1998)。
指導(dǎo)中藥和其他方式如針灸治療疾病的TCM主要理論是1)陰陽理論，2)五行理論，3)臟腑理論，4)氣、血津液理論以及5)經(jīng)絡(luò)理論。
在TCM中，作正確診斷的首要方面是確定疾病屬陰還是屬陽。例如，發(fā)燒、口渴、便秘或脈數(shù)的那些病人具有陽的特征。惡寒、不渴、腹瀉以及脈遲的那些病人具有陰的特征。也可根據(jù)陰陽理論劃分草藥的性、味和功能。例如，寒性和涼性的草藥屬于陰，而溫性和熱性的草藥屬于陽。酸、苦及咸味的草藥屬于陰，而辛、甘和淡味的草藥屬于陽。具有收斂和沉降作用的草藥屬于陰，而具有發(fā)散、升浮作用的草藥屬于陽。在TCM中，根據(jù)陰陽的強(qiáng)或弱確定治療原則，根據(jù)草藥的陰陽性質(zhì)及其恢復(fù)陰陽失調(diào)的作用開處方。這樣，可達(dá)到治療的效果。
根據(jù)五行理論，組成物質(zhì)世界的有五種基本物質(zhì)(即，木、火、土、金和水)。在TCM中，該理論用于解釋人體的生理學(xué)和病理學(xué)并指導(dǎo)臨床診斷和治療。
中醫(yī)運(yùn)用五行的相生、相乘、相克、相侮規(guī)則制定出許多有效獨(dú)特的治療處方，如土生金(脾氣散精于肺)，水生木(腎精可以化生肝血)，水克火(腎水上濟(jì)于心，抑制心火上亢)。特別要提的是，為了指導(dǎo)開TCM處方，將一些草藥的性質(zhì)分類至五行中的一種。
在TCM中，人體內(nèi)臟分成三組五臟(心、肝、脾、肺、腎)，六腑(膽、胃、大腸、小腸、膀胱、三焦)，奇恒之腑(腦、髓、骨、脈、膽和女子胞)。在TCM中，臟和腑不僅僅是解剖學(xué)單元，而且是生理學(xué)和病理學(xué)關(guān)于各種器官之間相互作用關(guān)系的概念。例如，心也指大腦功能，并影響血液、毛發(fā)、舌和皮膚的功能。陰陽和五行影響這些五臟、六腑、奇恒之腑的相互作用。如下面討論的，運(yùn)用這些學(xué)說相互作用的復(fù)雜性來解釋草藥處方所針對的疾病的病理。
TCM中草藥的處方是從診斷開始的，診斷有四個(gè)主要部分問診、望診、聞診、切診。在問診階段，收集許多信息，包括主要癥狀的特征。例如，如果主要癥狀特征為腹部鈍痛，得溫?zé)岷桶磯嚎删徑?，表明脾陽不足。腰膝酸軟，惡寒發(fā)冷，說明腎陽虛。望診時(shí)，望神，望面色以及舌質(zhì)和舌苔。例如，色淡白與秋肺相關(guān)，其氣干燥。這可能在陽氣不足和氣血運(yùn)行受阻時(shí)發(fā)生，或寒在經(jīng)絡(luò)時(shí)得病。
在TCM中，臟腑、經(jīng)絡(luò)以及行使生理功能的組織和其他器官所需能量是來自氣、血、津液，并依賴氣、血、津液的形成和化生。TCM的處方考慮草藥對氣血的作用來治療。
TCM認(rèn)為全身遍布了經(jīng)絡(luò)及其分支。草藥就是通過它們對病理靶標(biāo)發(fā)生作用，并達(dá)到改善病癥的效果。例如，麻黃作用于肺經(jīng)和膀胱經(jīng)以發(fā)汗來緩解哮喘并利尿。如上所述，針灸的臨床應(yīng)用也是根據(jù)經(jīng)絡(luò)學(xué)說。
總的來說，在TCM中當(dāng)將每種草藥的性質(zhì)分類成陰或陽，并劃分為五行中一種時(shí)，它們通過經(jīng)絡(luò)作用，并通過氣、血、津液對靶標(biāo)如臟腑產(chǎn)生治療作用。病理因素通過同樣的經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)被偽裝成誘餌從負(fù)面影響臟腑功能導(dǎo)致疾病。
從前述討論清楚地知道TCM的專業(yè)術(shù)語既是解剖學(xué)概念也是哲學(xué)概念。例如心在TCM中代表身體的組織、器官或系統(tǒng)的主宰者。所以，心的概念需要一個(gè)多位數(shù)據(jù)集來描述TCM每個(gè)概念。
美國規(guī)范程序 在美國，根據(jù)1994年膳食補(bǔ)充劑健康教育條例(DSHE條例)規(guī)范膳食補(bǔ)充劑(如植物產(chǎn)品、維生素和礦物質(zhì)，氨基酸和組織提取物)。根據(jù)聯(lián)邦食品、藥物及化妝品條例，從中去除了膳食補(bǔ)充物的成分如食品添加劑。另外，DSHE條例要求食品和藥品管理局(FDA)承擔(dān)責(zé)任證明商品化膳食補(bǔ)充劑在根據(jù)標(biāo)簽使用或作一般使用時(shí)顯出嚴(yán)重的或超平常情的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如今還沒有聯(lián)邦管理規(guī)范為膳食補(bǔ)充劑制定的純化、鑒定和生產(chǎn)程序的特定標(biāo)準(zhǔn)。另外，從1992年議會(huì)建立可替代醫(yī)學(xué)辦公室以來，有關(guān)草藥質(zhì)量方面的文章出版很少。(Angell等，1998，N.Engl.J.Med.339839-841)。
現(xiàn)在，F(xiàn)DA必須批準(zhǔn)藥物組合物或雞尾酒中每一種化合物，然后進(jìn)行臨床試驗(yàn)為商品化該藥物獲取單獨(dú)的FDA批準(zhǔn)。該程序極為冗長昂貴。分子整體醫(yī)療可能需要較少的艱巨的評估，因?yàn)樽鳛橹参锼幍奶囟ú菟幗M合物以前的用途允許在開始時(shí)進(jìn)行多種化合物的臨床實(shí)驗(yàn)(即，使用草藥組合物或該草藥組合物的特定成分的臨床實(shí)驗(yàn))。最近，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了在臨床試驗(yàn)中將一些草藥作為植物藥品來檢測。(FDA植物藥品指南，4月，1997)。這些例子總體上代表了保健方面的積極的發(fā)展，同時(shí)在草藥和膳食補(bǔ)充劑，包括傳統(tǒng)中藥的劑型、生產(chǎn)和質(zhì)控方面也引起了重要的問題。
由草藥中多種化合物引起的眾多有關(guān)的生物反應(yīng)，目前尚未清楚，而這對于支持FDA批準(zhǔn)其市場化越來越重要。
在為改進(jìn)其現(xiàn)行業(yè)務(wù)而不斷增加的壓力下，以草藥為基礎(chǔ)的工業(yè)正在形成(見如，Angell等，supra)。近期由于攝取草藥配方引起的幾起毒性報(bào)告更突出了需要對草藥和食品補(bǔ)充劑的制備和服用方法采取科學(xué)的試驗(yàn)。例如，服用以草藥為基礎(chǔ)的膳食補(bǔ)充劑的一名病人遭受了洋地黃毒性(Slifman等，1998，N.Engl.J.Med.339806-811)。后來證明在補(bǔ)充劑中標(biāo)作車前草的草藥成分確實(shí)被毛洋地黃污染了，已知毛洋地黃是一種包含至少60種強(qiáng)心甙的草藥。另一例子，發(fā)現(xiàn)一種草藥制劑引起一例病人慢性鉛中毒。(Beigel等，1998，N.Engl.J.Med.339827-830)。這不是一起完全出乎意料的偶發(fā)事件因?yàn)閬喼薏菟幍你U污染和其他重金屬污染有完整的紀(jì)錄。)Woolf等，1994，Ann.Intern.Med.121729-735)。
植物藥材的性質(zhì) 已清楚地知道基因特性(如屬、種、品系、品種、克隆)、草藥生長年齡、時(shí)間、使用的特定的植物部位、加工方法、產(chǎn)地、土壤種類、氣候類型、施肥的類型和頻率、以及其他生長因素對于從任何特殊區(qū)域采集的任何特殊草藥的特殊化學(xué)組合物有重要影響。
為確保用于醫(yī)學(xué)和作為膳食補(bǔ)充劑的草藥的持續(xù)質(zhì)量，已制定了越來越多的各種類型測試；包括宏觀和微觀水平的檢測和各種化學(xué)分析。最近，草藥提取物中標(biāo)記分子的高效液相色譜(HPLC)圖成為一種文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)。不過，這種方法也存在問題，包括一些生物活性分子不吸收以便HPLC檢測的紫外或可見光，而且化合物的量與其生物學(xué)效力未必成比例。鑒于這些原因，草藥生產(chǎn)廠家求諸于混合不同來源的生藥以使化合物的變化最小。
質(zhì)譜(MS)是一種分析手段，用以測定相對質(zhì)量和一束離子化分子成分的相對豐度或在高真空情況下由樣品產(chǎn)生的分子片段的相對豐度。MS，不象HPLC，不取決于光密度。實(shí)際情況下，將其與HPLC聯(lián)用或與毛細(xì)管電泳(CE)聯(lián)用HPLC分離化合物，MS接著對它們進(jìn)行鑒定。已經(jīng)有用于生物學(xué)用途的聯(lián)合MS和HPLC的商業(yè)系統(tǒng)。質(zhì)譜局限于氣態(tài)或低壓下易揮發(fā)的物質(zhì)，或衍生化后為氣態(tài)或低壓下易揮發(fā)的物質(zhì)。
這些措施已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。最近發(fā)表的文章報(bào)道了在特定供應(yīng)商供應(yīng)的草藥質(zhì)量方面有更大的變化以及提供生物學(xué)等價(jià)的草藥提取物的難度。而且，在大部分情況下并沒有清楚地限定安全性、有效性及草藥化學(xué)成分之間的相關(guān)性。最近，針對消費(fèi)人群和管理機(jī)構(gòu)，(聯(lián)邦注冊，2月6日，1997，62卷，No.25，記事表NO.96M-0417，關(guān)于生產(chǎn)，包裝或貯存膳食補(bǔ)充劑的cGMP，提議條例)一些草藥生產(chǎn)廠商已開始實(shí)施藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(GMP)，其要求在所有水平有嚴(yán)密的控制。
應(yīng)用化學(xué)方法和譜學(xué)方法描述草藥和食品補(bǔ)充劑的成分。例如，應(yīng)用這兩種方法從Gliricidia Sepium的果實(shí)里提取出三種全新的以常春藤甙為基礎(chǔ)的乙酰皂甙(Kojima等，1998，Phytochemistry 48(5)885-888)。通過比較由高效液相色譜(HPLC)或毛細(xì)管電泳(CE)分析的某些特征組成成分的含量來推斷許多商業(yè)樣品中中草藥的植物來源。(Shuenn-Jyi Sheu，1997，Journal of Food and DrugAnalysis 5(4)285-294)。例如用麻黃堿/偽麻黃堿的比例作為一種標(biāo)記把中麻黃和其他麻黃品種區(qū)分開。用總生物堿含量來區(qū)分黃檗種類；用人參皂甙含量區(qū)分人參的種類。不過，這些方法并不提供在用草藥治療病人后，各種草藥對分子、生理學(xué)的或形態(tài)學(xué)反應(yīng)作用的直接量度。
加州健康科學(xué)系，食品與藥品部，近來運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜和原于吸收法測試了購自草藥商店的亞洲藥品的污染雜質(zhì)。(R.J.KO，1998，N.Engl.J.Med.339847)在他們測試的260種產(chǎn)品中，至少83(32％)種含有未聲明的藥物或重金屬，23種有不止一種雜質(zhì)。運(yùn)用高效液相色譜、氣相色譜、及質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)一種商品化的8種草藥混合物(PC-SPES)含有雌激素的有機(jī)化合物(Dipaola等，1998，N.Engl.J.Med.339785-791)。研究者總結(jié)PC-SPES具有有效的雌激素活性，而服用PC-SPES的前列腺癌病人可能會(huì)破壞標(biāo)準(zhǔn)治療的結(jié)果并且會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的臨床副作用。為傳統(tǒng)中藥“Wei LingXian”的不同樣品收集氣相色譜數(shù)據(jù)，并對比其與樣品的抗炎活性的關(guān)系。(Wei等，應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥“Wei Ling Xian”的質(zhì)量評估的化學(xué)模擬研究，藥學(xué)學(xué)報(bào)26(10)772-772(1991))該研究既未提供相關(guān)的HBR陣列數(shù)據(jù)，如時(shí)程，量效關(guān)系，以證實(shí)生物標(biāo)記差異效力的對照樣品，也未應(yīng)用重復(fù)型數(shù)據(jù)構(gòu)建程序以建立一個(gè)全面的數(shù)據(jù)庫來鑒定草藥組合物的作用。
蛋白質(zhì)水平的改變也被用來描述草藥組合物或草藥的特定成分的作用。例如，由外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)隨著加入培養(yǎng)基的特定中草藥而變化。(Yamashiki等，1992，J.Clin.Lab.Immunol.37(2)83-90)。用在日本應(yīng)用最普遍的草藥小柴胡湯處理培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中白介素-1α受體的表達(dá)明顯上調(diào)。(Matsumoto等，1997，Jpn.J.Pharmacol.73(4)333-336)。用Toki-Shakuyakusan(TSS)處理會(huì)增加巨噬細(xì)胞的Fcγ11/111受體和補(bǔ)體3的表達(dá)。(J.C.Cyong，1997，Nippon YakurigakuZasshi 110(Suppl.1)87-92)。粉防己堿，一種由天然的中草藥提取而得的生物堿，抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中信號(hào)誘導(dǎo)的NF-κB的活化。(Chen等，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.231(1)99-102)。草藥Sairei-to，澤瀉(日文又名“Takusha”)和茯苓(日文又名“Bukuryou”)抑制患有抗腎小球基底膜腎炎大鼠的內(nèi)皮肽-1的合成和表達(dá)。(Hattori等，1997，Nippon Iinzo Gakkai Shi 39(2)121-128)。
mRNA水平的增加或減少也作為各種草藥和草藥成分作用的指標(biāo)。腹膜內(nèi)注射QingYang Shen(QYS)一種具有抗癲癇特性的傳統(tǒng)中藥和苯妥英鈉減少在海人草酸誘導(dǎo)的大鼠慢性癲癇發(fā)作期α-和β-微管蛋白mRNAs和海馬C-fos mRNA的誘導(dǎo)。(Guo等，1993，J.Tradit.Chin.Med.13(4)281-286Guo等，1995，J.Tradit.Chin.Med.15(4)292-296；Guo等，1996，J.Tradit.Chin.Med.16(1)48-51)。用從黃芪(Astragalusmembranaceus)純化而得的一種成分紫云英皂甙IV處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，減少了I型胞漿素原激活因子抑制劑特異mRNA的表達(dá)，并且增加了組織型胞漿素原激活因子(t-PA)特異性mRNA(Zhang等，1997，T.Vasc.Res.34(4)273-280)。發(fā)現(xiàn)從人參根中提取的一種成分能有效誘導(dǎo)人單核細(xì)胞和人單核細(xì)胞系THP-1產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8(IL-8)，并伴隨IL-8 mRNA表達(dá)的增加。(Sonoda等，1998，Immunopharmacology 38287-294)。
近期在cDNA微陣列技術(shù)方面的進(jìn)展能進(jìn)行有關(guān)基因表達(dá)信息的大量平行篩選。這一程序用于研究細(xì)胞周期、生化途徑、酵母genome-wide表達(dá)、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、對單一化合物的細(xì)胞反應(yīng)以及遺傳性疾病，包括這些疾病的發(fā)病和發(fā)展。(M.Schena等，1998，TIBTECH 16301)。到目前為止，還沒有研究者嘗試應(yīng)用這些新方法來研究整個(gè)草藥治療和補(bǔ)充劑的分子學(xué)水平的作用。
一些研究者已嘗試研究從所選草藥中提取的主要活性成分的作用。例如，用純化自三七(Panaxnaotginseng)的香豆人參皂甙R1(NR1)處理HUVECs，引起有劑量-時(shí)間相關(guān)性的TPA合成的增加。(Zhang等，1994，Arteriosclerosis and Thromobosis 14(7)1040-1046)。用NR1處理既不改變尿激素型胞漿素原激活因子和PAI-1抗原的合成，也不影響PAI-1在細(xì)胞間質(zhì)中的沉積。當(dāng)用NR1處理HUVECs時(shí)，TPA mRNA提高兩倍，相反NR1并不顯著影響PAI-1特異性mRNA的表達(dá)。因?yàn)榇蟛糠謱θ叩难芯可婕捌渑c其他草藥的混合物，研究者發(fā)現(xiàn)很難評價(jià)其結(jié)果與用于治療人類時(shí)的體內(nèi)情況的相關(guān)性。(Id.，at1045，第二專欄，第一章)。另外，因?yàn)檠芯空邇H研究草藥的一種主要成分，所以不可能從該研究中確定整個(gè)草藥的分子效應(yīng)或草藥各成分的相互作用。
Dobashi等(1995)，Neuroscience Letters.1997235-238)研究saiko試劑的兩種主要成分的作用，一種用于治療腎病綜合癥、支氣管哮喘和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中草藥。服用ss-d增加了血漿腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平，垂體前葉mRNA水平及大鼠下丘腦中CRFmRNA水平，并有量效關(guān)系。相反，用ss-a處理沒有影響這些分子標(biāo)記的水平。盡管該研究表明服用ss-d可能在Saiko試劑誘導(dǎo)大鼠下丘腦CRF釋放和CRF基因表達(dá)中起重要作用，但沒有闡明作為整體的草藥的分子作用。
Kojima等(1998，Biol.Pharm.bull.4426-428)描述了運(yùn)用各種mRNA分離和鑒定在小鼠肝中被小柴胡湯在翻譯水平調(diào)節(jié)的基因，小柴胡湯在日本是用于治療各種炎癥疾病的草藥。這些研究者將他們的研究局限在運(yùn)用mRNA差異顯示技術(shù)探索草藥的分子機(jī)理。它也沒有闡明對受試動(dòng)物的多種器官的作用，也沒有提供質(zhì)量控制，新用途及效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。另外，該研究沒有分析草藥的各個(gè)成分或?qū)φw用藥的結(jié)果與單獨(dú)用藥的各自的結(jié)果進(jìn)行比較。
MaJi等(1998)，Chinese Medical Joural 111(1)17-23)研究草藥黃芪對aortocava1-fistula引起的實(shí)驗(yàn)性充血性心衰大鼠的鈉水潴留的治療作用。對用或未用經(jīng)黃芪處理慢性心力衰竭大鼠在各種形態(tài)特征的變化(例如，體重、血清鈉濃度)；生理學(xué)特征變化(如，平均動(dòng)脈壓，心率，血球容積及血漿溶質(zhì)度)；mRNA表達(dá)水平的變化(例如下丘腦精氨酸增壓素(AVP)，AVPV1a受體，腎AVPV2受體，aquaporin-2(AXP2))以及蛋白質(zhì)分泌的變化(例如血漿心房單磷酸肽(ANP)和尿環(huán)鳥嘌呤單磷酸(cGMP))等方面進(jìn)行了比較。研究者發(fā)現(xiàn)用黃芪治療改善了心臟和腎臟功能，部分糾正了AVP系統(tǒng)和AQP2的非正常mRNA表達(dá)，并且改善了腎臟對ANP的反應(yīng)。該研究未闡明運(yùn)用收集的數(shù)據(jù)來指導(dǎo)新配方的開發(fā)或用來弄清一個(gè)處方中不同草藥之間協(xié)同作用或其他反應(yīng)，也未證實(shí)用于質(zhì)量控制的作用差異強(qiáng)度。
如上述相關(guān)科學(xué)文獻(xiàn)綜述所示，以分子為基礎(chǔ)的技術(shù)還未用于探索和證實(shí)同時(shí)由各種化合物如草藥TCM處理或考驗(yàn)的生物系統(tǒng)的細(xì)胞反應(yīng)和分子反應(yīng)。而且，最近的這些進(jìn)展也并未與其他技術(shù)和方法結(jié)合以產(chǎn)生一種系統(tǒng)探索草藥和TCM生物作用的程序。
發(fā)明概述該發(fā)明為創(chuàng)建、維持、改進(jìn)及使用草藥生物反應(yīng)陣列(HBRArrays)提供了工具和方法。其中HBR陣列由具有特定草藥組合物的數(shù)據(jù)集組成。本發(fā)明的HBR陣列可包括草藥組分的植物相關(guān)數(shù)據(jù)信息，施用草藥組合物于生物系統(tǒng)后收集的標(biāo)記信息和生物反應(yīng)信息。
本發(fā)明為建立特定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列提供了必要的工具和方法學(xué)，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列用作評價(jià)相近或不同批次草藥組合物的基準(zhǔn)。本發(fā)明還提供更新和維持標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列必要的工具和方法學(xué)。本發(fā)明的具體應(yīng)用包含重復(fù)程序，附加批次的草藥組合物數(shù)據(jù)、附加的植物相關(guān)數(shù)據(jù)、附加的標(biāo)記信息、和/或附加的生物反應(yīng)信息以此周期性加入標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。因此，本發(fā)明為在一個(gè)不斷進(jìn)步的基礎(chǔ)上創(chuàng)建、維持、更新和使用HBR陣列提供了工具和方法學(xué)。
本發(fā)明提供了必要的工具和方法學(xué)以指導(dǎo)草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化，確定與特定生物活性相應(yīng)的草藥組合物具體成分，預(yù)測草藥組合物的生物活性，開發(fā)改良的草藥治療，調(diào)整或修飾草藥組合物；在成批草藥組合物中鑒定具有預(yù)想生物活性的特定分子；確定當(dāng)保持或改進(jìn)已知草藥組合物的預(yù)想的生物活性時(shí)哪些草藥成分可從中除去；鑒定批草藥組合物的新用途和前所未知的生物活性；以及運(yùn)用預(yù)測的成批草藥組合物的生物活性來幫助設(shè)計(jì)包括草藥組合物和合成化學(xué)藥品的治療方案，包括應(yīng)用組合物化學(xué)方法設(shè)計(jì)治療方案。
更具體點(diǎn)，本發(fā)明為草藥組合物提供建立標(biāo)準(zhǔn)化草藥生物反應(yīng)陣列(HBR Arrays)的方法，其中方法包含1)選擇有至少一種已知生物反應(yīng)的草藥組合物2)施用成批草藥組合物于生物系統(tǒng)，并且收集兩種或更多種標(biāo)記物的數(shù)據(jù)。
3)貯存步驟2)的標(biāo)記物數(shù)據(jù)作為一個(gè)HBR陣列4)為一批或更多附加批次草藥組合物重復(fù)步驟2)和3)，應(yīng)用兩種或比步驟2)中更多種的相同或不同標(biāo)記物。
5)合并從步驟3)和4)中得到的HBR陣列；以及6)分析步驟5)中合并的HBR陣列以產(chǎn)生該草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列具有與草藥組合物的至少一種已知生物反應(yīng)相關(guān)的兩種標(biāo)記物或更多種標(biāo)記物的數(shù)據(jù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這樣的方法，其中包含施用一批或更多批草藥組合物于生物系統(tǒng)，收集一種或更多種標(biāo)記物反應(yīng)的數(shù)據(jù)并且向該草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中添加收集的生物反應(yīng)數(shù)據(jù)。
本發(fā)明提供了評價(jià)草藥組合物的方法，其中該方法包含施用一批草藥組合物于生物系統(tǒng)及收集兩種或更多種標(biāo)記物的數(shù)據(jù)；以及同與該批草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列比較收集的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
本發(fā)明提供了預(yù)測一種草藥組合物的生物活性的系統(tǒng)包含1)包含一種或多種不同類型的細(xì)胞、組織、器官或體外分析的生物系統(tǒng)。
2)一批草藥組合物3)兩種或多種分子標(biāo)記物4)一種施用該批草藥組合物于生物系統(tǒng)及測量分子標(biāo)記物的不同反應(yīng)的手段5)一個(gè)計(jì)算機(jī)處理器，包括存儲(chǔ)器，用于分析和貯存分子標(biāo)記物的各種反應(yīng)的量度來建立一個(gè)該批草藥組合物的草藥生物反應(yīng)陣列((HBR Arrays)數(shù)據(jù)集。
6)一個(gè)計(jì)算機(jī)處理器，包括存儲(chǔ)器，用于比較該批草藥組合物的HBR陣列和一種或多種以前貯存的HBR陣列，來預(yù)測該批草藥組合物的生物活性，其中用于建立這一個(gè)或多個(gè)以前貯存的HBR陣列的該草藥組合物的生物活性是已知的。
附圖簡述

圖1圖1提供了為任何所選草藥組合物構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化草藥生物反應(yīng)陣列(HBR Arrays)的基本方法步驟圖。該圖為理解方便以其最基本的形式表示。如此處討論的，圖的每條途徑均可重復(fù)。而且，每個(gè)盒子中包含的任何信息均可用作指導(dǎo)作有關(guān)收集任何其他盒子的信息的決定。這樣，許多反饋環(huán)也可能貫穿整個(gè)圖。
圖2圖2提供為每一批草藥組合物構(gòu)建一個(gè)草藥生物反應(yīng)陣列(HBR Arrays)和比較該批HBR陣列與選自標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的信息子集的基本方法步驟圖。該圖為理解方便以其最基本的形式表示。如此處討論的，該圖的每條途徑均可重復(fù)。而且，每個(gè)盒子中包含的任何信息均可用作指導(dǎo)作有關(guān)收集任何其他合子的信息的決定。這樣，許多反饋環(huán)也可能貫穿整個(gè)圖。
圖3圖3提供建立和使用主要數(shù)據(jù)集的基本方法的步驟圖。該圖為理解方便以其最基本的形式表示。如此處討論的，該圖的每條途徑均可重復(fù)。而且，每個(gè)盒子中包含的任何信息均可用作指導(dǎo)作有關(guān)收集任何其他合子的信息的決定。這樣，許多反饋環(huán)也可能貫穿整個(gè)圖。
圖4各種草藥組合物的蛋白質(zhì)印記。
A 無草藥組合物B 黃芩湯A(HQTA)(0.2mg/ml)C HQTA(4mg/ml)D HQTB(0.2mg/ml)E HQTB(4mg/ml)F 黃芩(0.2mg/ml)G 黃芩(4mg/ml)圖5芍藥(Paeonie lactiflora Pallus)的HPLC
圖6 Ziziphi fructus的HPLC發(fā)明詳述除了有不同的定義，所有用于此處的技術(shù)性和科學(xué)性定義均與該發(fā)明所屬的領(lǐng)域中每一個(gè)普通技術(shù)人員平常理解的意思一樣。盡管任何相似或等同此處描述的方法和材料均可用于實(shí)施或檢測本發(fā)明，但還是描述了優(yōu)選的方法和材料。
發(fā)明總論如上所述，本發(fā)明是針對用于預(yù)測草藥組合物生物反應(yīng)的工具和方法。更具體點(diǎn)，本發(fā)明提供創(chuàng)建草藥生物反應(yīng)陣列(HBR Arrays)數(shù)據(jù)庫的方法和應(yīng)用此數(shù)據(jù)庫來改善以草藥為基礎(chǔ)的有效治療的設(shè)計(jì)的方法。本發(fā)明的目的是全面設(shè)計(jì)、創(chuàng)建、改善和使用HBR陣列用于制備、測試和服用草藥組合物，并指導(dǎo)新的草藥組合物的開發(fā)和已有草藥組合物的全新用途。
植物組學(xué) 如此處所應(yīng)用的，根據(jù)其被應(yīng)用的上下文，“植物組學(xué)”(“phytomics”)指應(yīng)用生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段闡明草藥組合物成分的質(zhì)量和數(shù)量方面或開發(fā)用于闡明這些方面內(nèi)容的真實(shí)數(shù)據(jù)庫。
草藥生物反應(yīng)陣列 如此處所應(yīng)用的，一個(gè)HBR陣列是由與草藥組合物相關(guān)的兩個(gè)或多個(gè)觀察結(jié)果或量度的數(shù)據(jù)構(gòu)成的。HBR陣列可包括該組合物與植物相關(guān)的定性的和定量的數(shù)據(jù)(植物相關(guān)的數(shù)據(jù))，施用草藥組合物于生物系統(tǒng)后得到的標(biāo)記物信息包括劑量相關(guān)研究，以及將草藥組合物施用于生物系統(tǒng)后得到的生物反應(yīng)數(shù)據(jù)。任何特定HBR陣列中的數(shù)據(jù)均可按2維或3維空間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
HBR陣列被命名為批HBR陣列和標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。批HBR陣列是與特定批的一種草藥組合物相關(guān)的數(shù)據(jù)陣列。標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列是與一種標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物相關(guān)的數(shù)據(jù)陣列。
主要數(shù)據(jù)集 如此處所應(yīng)用的，術(shù)語“主要數(shù)據(jù)集”指用作與相同或不同草藥組合物的其他各種數(shù)據(jù)集比較或分析的基線數(shù)據(jù)集。一般地，主要數(shù)據(jù)集是應(yīng)用生物工程技術(shù)建立以確證草藥組合物的一些基因或蛋白質(zhì)。因此，主要數(shù)據(jù)集通常，但并不總是，建立在基因組或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集基礎(chǔ)之上。例如，DNA微陣列結(jié)果可以是用于比較其他隸屬或次級(jí)數(shù)據(jù)集的主要數(shù)據(jù)集。
次級(jí)或隸屬的數(shù)據(jù)集 如此處所應(yīng)用的，“次級(jí)數(shù)據(jù)集”或“隸屬數(shù)據(jù)集”指用于比較主要數(shù)據(jù)集的一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)集。一般情況下，但并不總是，次級(jí)數(shù)據(jù)集是由通過多種傳統(tǒng)方法收集的一種草藥組合物的信息組成。例如，次級(jí)或隸屬數(shù)據(jù)集可以由通過多種傳統(tǒng)手段收集的植物相關(guān)數(shù)據(jù)組成。植物相關(guān)的數(shù)據(jù)的例子包括，但不局限于，草藥組合物中草藥的屬/種，該組合物中草藥的具體植物部位，以及草藥所在的地理位置。次級(jí)數(shù)據(jù)集的另一個(gè)例子可以由在用一種或多種不同量的草藥組合物處理后細(xì)胞、組織、器官或生物體的一組生物反應(yīng)組成。這些生物學(xué)數(shù)據(jù)或整個(gè)生物體的例子包括，但不局限于，細(xì)胞毒性研究，酶處理研究，生長速率，增重或失重，運(yùn)動(dòng)能力的改變以及智力能力的改變。
草藥 技術(shù)上講草藥是一種小巧的非木質(zhì)的(即肉質(zhì)莖的)一年生或多年生產(chǎn)種的植物，其所有地上部分在每個(gè)生長季節(jié)的盡頭會(huì)枯萎。草藥因其藥用、調(diào)味或芳香的品質(zhì)而有價(jià)值。如該詞平常所用，也如該詞在此處所用，草藥指任何具有食品補(bǔ)充劑、藥用、治療或改善生活作用的植物或植物部位。因此，如此處所用，草藥不局限于草藥的植物學(xué)定義而是任何用于這些目的的植物性藥材、植物或植物部位，包括Metaphyta王國的任何植物種類或亞種的任何植物或植物部位，包括草、灌木、半灌木和樹木。用于草藥組合物的植物部位包括，但不局限于，種子、葉、莖、嫩枝、枝、芽、花、鱗莖、球莖、塊莖、地下莖、長葡莖、根、果實(shí)、球果、漿果、形成層和樹皮。
草藥組合物 如此處所用，“草藥組合物”指任何包括草藥、草藥植物或草藥植物部位的組合物。因此，如此處所用，草藥組合物是任何草藥制劑，包括草藥食品補(bǔ)充劑，草藥藥劑、草藥藥品和醫(yī)療食品。草藥組合物的例子包括，但不局限于，下列成分一種單一植物的整個(gè)植物或植物部位；多種植物的整個(gè)植物或植物部位；來自一種植物的多種成分；來自多種植物的多種成分；或這些不同成分的任何組合。至于各種草藥組合物的全面綜述，請見，例如，Kee ChangHuang，The Pharmacology of Chinese Herbs，CRC Press(1993)此處完整收錄。在以下段落提供各種草藥組合物的代表實(shí)例。
在英國自十八世紀(jì)中葉以來就使用含有楊柳樹樹皮的草藥組合物來治療發(fā)熱。楊柳樹樹皮中的活性成分是一種稱作水楊甙的苦味甙，其水解產(chǎn)生葡萄糖和水楊醇。阿斯匹林(乙酰水楊酸)和類阿斯匹林藥物(如，布洛芬)，常被稱作非甾體抗炎藥物(NSAIDS)，常用來治療疼痛、發(fā)熱和炎癥。繡線菊是另一種含有水楊酸鹽的草藥。用楊柳樹皮或繡線菊治療關(guān)節(jié)炎和類是關(guān)節(jié)炎的癥狀需要消耗大量制自這些植物的草藥浸劑。整個(gè)楊樹種類(即楊樹樹木和灌木)也含有水楊酸鹽前體，而楊樹芽已用于消炎解熱鎮(zhèn)痛藥。
美國專利局已公布了用于治療各種疾病和解決其他困擾人類和動(dòng)物的與健康有關(guān)的問題的草藥組合物。例如，美國專利號(hào)第5,417,979公布了一種含有草藥混合物的組合物，包括千金藤和甘草以及它們的提取物，用作味口刺激劑和治療疼痛。發(fā)現(xiàn)包含甘草的草藥組合物對治療濕疹、牛皮癬、瘙癢和皮炎有用。(美國專利號(hào)第5,466,452)。美國專利號(hào)第5,595,743公開了用于治療各種哺乳類動(dòng)物的疾病，包括炎癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的各種草藥組合物，包括甘草提取物(甘草)、豕希薟、苦豆子、百部以及漢防己草藥?？捎煤兄参锷飰A漢防己堿的藥物組合物來治療眼炎(美國專利號(hào)第5,627,195)。美國專利號(hào)第5,683,697揭示了一種具有抗炎、解熱、祛痰或止咳作用的藥物組合物，其中該組合物包括楝樹、Angepica、石斛、風(fēng)仙花、柑、桑寄生、青葙、鵝絨藤及北沙參的植物部位。已發(fā)現(xiàn)一種包含山姜、菝葜、青牛膽、蒺藜、Withania及姜的根、根莖和/或植被提取物的草藥組合物，可減少或緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，并且減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。(美國專利號(hào)第5,683,698)。
草藥組合物由許多種劑型，包括膠囊、片劑或糖衣片劑；丸劑；提取物或酊劑；粉劑；新鮮或干燥的植物或植物部位；制備浸劑；汁；乳劑或軟膏劑；香精油；或任何這些劑型的組合。可通過各種方法服用草藥，包括口服、直腸給藥，非經(jīng)腸胃道給藥，腸道給藥，透皮給藥，靜脈給藥，喂飼管給藥以及局部給藥。
本發(fā)明所涵蓋的草藥組合物包括也含非草藥成分的草藥組合物。這樣的非草藥成分實(shí)例包括，但不局限于，昆蟲個(gè)體或昆蟲部位，蠕蟲，動(dòng)物或昆蟲糞便，天然油或石油，胺的碳酸鹽，酒石酸鹽、酒、水、甘油、類固醇、成藥、維生素、營養(yǎng)提取物、乳清、鹽以及明膠。
對口服來說，公布的草藥組合物可采用例如片劑或膠囊的劑型，通過傳統(tǒng)手段混合制備，其中有普遍認(rèn)可的賦形劑如粘合劑(例如玉蜀黍淀粉明膠，聚乙烯吡咯酮，羥丙基甲基纖維素)，填充劑(如乳糖，微晶纖維素或磷酸鈣)；潤滑劑(如硬脂酸鎂，滑石粉或硅)；崩解劑(如，馬鈴薯淀粉或淀粉二乙醇酸鈉)；或潤濕劑(如月桂醇硫酸鈉)；助流劑；人造或天然調(diào)味劑以及甜味劑；人造或天然色素及染料；以及助溶劑。草藥組合物也可另行配方以本領(lǐng)域已知的并在美國專利號(hào)第4,690,825和第5,055,300所討論的按時(shí)釋放方式釋放活性劑。按本領(lǐng)域熟知的方法給片劑加糖衣。
對于口服的液體劑型可采用例如溶液、糖漿、懸浮液、或淤漿(例如Mulchandani等在1992美國專利號(hào)第5,108,767中描述的液體營養(yǎng)補(bǔ)充劑)，或以干品方式提供，在使用前用水或其它適當(dāng)?shù)妮d體恢復(fù)液態(tài)。葉酸及其它維生素礦物質(zhì)的液體制劑是專為ESRD病人設(shè)計(jì)的一種液體營養(yǎng)補(bǔ)充劑。這樣的液體制劑可通過傳統(tǒng)手段加藥物可接受的添加劑制備，如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、甲基纖維素或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(如，杏仁油，油性酯或乙醇)；防腐劑(如對羥基苯甲酸酯或?qū)αu基苯丙酸酯或山梨酸)；以及人造或天然色素和/或甜味劑。
對于局部給藥，草藥組合物可與至少一種組成可接受載體、稀釋劑或賦形劑的成分混合以提供一種適合局部給藥的組合物，如膏劑、凝膠、固體、糊劑、油膏劑、粉劑、洗劑、液體、氣霧劑以及類似物。單獨(dú)的滅菌蒸餾水及單純膏劑，軟膏劑及凝膠基質(zhì)可用作草藥成分的載體。也可加入防腐劑和緩沖液。該制劑可采用滅菌衣膜、生物可降解、可吸收膠布或衣膜以用于局部給藥，或采用緩釋植入系統(tǒng)，從大量的初始釋放衰減至緩釋。至于更完全的以草藥為基礎(chǔ)的組合物的綜述和討論請參見Earl Mindell，Earl Mindell’s HerbBible，Simo&Schuster(1992)；Culpper’s Complete Herbal，W.Foulsham&Co.Ltd.(17世紀(jì)中葉首次報(bào)道)；以及Rodale’sIllustrated Encvdopedia of Herbs，Rodale，Press(1987)。
標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物 如此處所用，“標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物”指為評價(jià)具有相同、相近或不同成分的批草藥組合物選作標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物的一種特定的草藥組合物。有時(shí)候此處也稱為“主草藥組合物”。標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物一般是已清楚鑒定并證實(shí)在特定生物系統(tǒng)中具有預(yù)想生物反應(yīng)的的草藥組合物。標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物通常應(yīng)用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的化學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化并且妥善貯存以備長期使用和參考。用標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物來建立以植物(如植物相關(guān)數(shù)據(jù))，標(biāo)記物和生物反應(yīng)的觀察結(jié)果和量度為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列以鑒定草藥組合物。
成批草藥組合物 如此處所用，“成批草藥組合物”指任何受試草藥組合物，用來建立以植物和標(biāo)記的觀察結(jié)果和量度為基礎(chǔ)的HBR陣列以鑒定草藥組合物。有時(shí)候此處也稱作“受試”或“成批”草藥組合物?？砂ㄒ部刹话ㄉ锓磻?yīng)的觀察結(jié)果和量度。用于建立標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物的草藥組合物也可稱為“成批草藥組合物”直至其被命名為“標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物”。
批 如此處所用，“批”指以某些特定屬性識(shí)別可以將其與其它任何特定量的同種草藥組合物區(qū)分開的一種特定量草藥組合物。例如，一批草藥組合物區(qū)別于另一批是因?yàn)槠渲幸慌窃谂c另一批不同時(shí)間或不同地理位置采集的。區(qū)分特定批的其它不同點(diǎn)可包括，但不局限于，以下幾方面1)所用的特定植物部位(例如，一批中用草藥的根而另一批中用同樣草藥的葉；2)各個(gè)草藥或草藥組合物收獲后處理(例如，一批可以用蒸餾水處理而另一批可以用鹽酸處理以模擬人胃的酸度)以及3)一種草藥組合物中各個(gè)草藥的相對比例(例如，一批中以重量或體積含有三份等量不同草藥而另一批則一種草藥的比例多于其他兩種)。
生物系統(tǒng) 如此處所用，“生物系統(tǒng)”指用于觀察或測量生物反應(yīng)的任何生物實(shí)體。因此，一個(gè)生物系統(tǒng)包括，但不局限于，任何細(xì)胞、組織、器官、整個(gè)生物體或體外分析。
生物活性 如此處所用，一種草藥的“生物活性”指一種草藥組合物對于一個(gè)給定的生物系統(tǒng)的獨(dú)有的特定生物效應(yīng)。
植物相關(guān)數(shù)據(jù) 如此處所用，“植物相關(guān)數(shù)據(jù)”指收集的關(guān)于該草藥組合物的數(shù)據(jù)，包括，但不局限于，關(guān)于植物的數(shù)據(jù)，其生長條件以及在植物采集時(shí)和采集后的處理。植物相關(guān)數(shù)據(jù)也包括一種草藥組合物中成分的相對比例，其中成分可以是不同植物部位，不同植物種類，其它非植物成分(例如，昆蟲部位，化學(xué)藥品)或這些變量的任何一種組合。
為一種草藥組合物收集的植物相關(guān)數(shù)據(jù)包括，但不局限于，以下幾方面1)植物種類(和，如可知，具體的植物品種，栽培品系，克隆，系等)和用于該組合物的具體的植物部位；2)草藥的地理來源，包括經(jīng)度/緯度和海拔；3)草藥的生長條件 包括肥料類型和數(shù)量，降雨和灌溉的數(shù)量和時(shí)間，每天接受的平均microEinsteins，農(nóng)藥用法，包括除草劑，殺蟲劑，殺螨劑及殺真菌劑，以及耕作方法。4)加工草藥的方法和條件，包括草藥的年齡/成熟度，浸泡時(shí)間，干燥時(shí)間，提取方法以及研磨方法；以及5)草藥成分和最終的草藥組合物的貯存方法和條件。
另外，標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物可用化學(xué)方法分析?；瘜W(xué)鑒定一般通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員通常知曉的任何化學(xué)分析方法來完成。可采用的化學(xué)分析的實(shí)例，包括，但不局限于，HPLC，TLC，化學(xué)指紋分析，質(zhì)譜分析以及氣相色譜。
生物信息學(xué) 如此處所用，“生物信息學(xué)”指具有生物學(xué)意義的信息的使用和組織。在其他情況中，生物信息學(xué)包含以下幾個(gè)方面1)數(shù)據(jù)獲取和分析；2)數(shù)據(jù)庫開發(fā)；3)整合和聯(lián)接；以及4)終數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步分析。直至20世紀(jì)九十年代初期，幾乎所有生物信息學(xué)費(fèi)源才發(fā)展成功眾領(lǐng)域免費(fèi)軟件，并且許多可通過因特網(wǎng)免費(fèi)獲得。一些公司已開發(fā)了專利數(shù)據(jù)庫或分析軟件。
基因組或基因組學(xué) 如此處所用，屬于“基因組學(xué)”指對基因及其功能的研究?；蚪M學(xué)強(qiáng)調(diào)在比較基因圖譜、分子克隆、大規(guī)模限制圖以及DNA測序和計(jì)算機(jī)分析方面的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的統(tǒng)一。遺傳信息是應(yīng)用基本技術(shù)來獲取的，如DNA測序、蛋白質(zhì)測序和PCR。
基因功能通過以下幾點(diǎn)來確定1)分析正常發(fā)育健康的細(xì)胞、組織、器官或生物體基因中DNA突變的作用；2)分析DNA序列中編碼的各種信號(hào)；以及3)研究由一個(gè)基因或一個(gè)相關(guān)基因系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)組或蛋白質(zhì)組學(xué) 如此處所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)組學(xué)”，也稱作“蛋白質(zhì)組研究”或“非增殖部”，指在規(guī)定條件下基因組定量蛋白質(zhì)表達(dá)模式。如通常所用，蛋白質(zhì)組學(xué)指運(yùn)用蛋白質(zhì)生物化學(xué)高通量自動(dòng)分析的方法。
有很多原因說明除了基因組研究外進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究是必要的。首先，基因表達(dá)水平未必代表一個(gè)細(xì)胞中活性蛋白質(zhì)的量。其次，基因順序并不說明翻譯后修飾，而后者對于一個(gè)蛋白質(zhì)的功能和活性是必不可少的。再次，基因組本身并不說明上調(diào)或下調(diào)蛋白質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程。
蛋白質(zhì)組課題是為鑒定一個(gè)細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，起碼確定分離出的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。總的來說，蛋白質(zhì)先用2D凝膠或HPLC分離，然后用高通量質(zhì)譜給肽或蛋白質(zhì)測序。運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析質(zhì)譜結(jié)果來聯(lián)接一個(gè)基因與其編碼的特定蛋白質(zhì)。這整個(gè)過程有時(shí)稱作“功能性基因組學(xué)”。許多商業(yè)風(fēng)險(xiǎn)公司現(xiàn)在提供蛋白質(zhì)組學(xué)業(yè)務(wù)(例如，Pharmaceutical ProteomicsTM，The ProteinchipTMSystemfromCiphergen Biosystem；PerSeptive Biosystems)。
關(guān)于蛋白質(zhì)組研究的綜合信息，請參見，例如J.S.Fruton 1999，Proteins，Enzymes，Genes；The Interplay of Chemistry andBiology，Yale Univ.Pr.；Wilkins等1997，Proteome Research；New Frontier in Functional Genomics(Principles andPractice)，Springer Verlag；A.J.Link，2-D Proteome AnalysisProtocals(Methodin Molecular Biology.112，Humana Pr.；Kamp等，1999，Proteome and Protein Analysis，Springer Verlag。
信號(hào)傳導(dǎo) 如此處所用，“信號(hào)傳導(dǎo)”，也稱作“細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)”，指細(xì)胞接受外來信號(hào)，并在細(xì)胞內(nèi)傳遞放大及指導(dǎo)它們的途徑。信號(hào)途徑需要蛋白質(zhì)互通鏈以逐步的方式傳遞信號(hào)。蛋白激酶常參與這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因?yàn)樵S多信號(hào)傳遞涉及接收胞外化學(xué)信號(hào)，其引發(fā)胞漿蛋白質(zhì)磷酸化以放大該信號(hào)。
翻譯后修飾 如此處所用，“翻譯后修飾”是一個(gè)概括的術(shù)語用于涵蓋當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)作為初始多肽合成后所發(fā)生的改變。這些翻譯后修飾包括，但不局限于，糖基化、去除N端甲硫氨酸(或N-甲酰甲硫氨酸)，去除信號(hào)肽、乙?；?、甲?；?、氨基酸修飾、肽鏈內(nèi)切以釋放更小的蛋白質(zhì)或多肽、磷酸化、以及甲硫氨酸修飾。
陣列或微陣列 如此處所用，“陣列”或“微陣列”指一種網(wǎng)格系統(tǒng)，其每一個(gè)位置或探針細(xì)胞為一個(gè)規(guī)定的核酸片段所占據(jù)。陣列本身也有時(shí)被稱作“芯片”、“生物芯片”、“DNA芯片”或“基因芯片”。高密度DNA微陣列常在各種網(wǎng)格類型中含有成千上萬的探針細(xì)胞。
一旦裝配好的陣列，加入批(草藥組合物)，在批和陣列之間會(huì)發(fā)生某種形式化學(xué)過程，顯示出對該陣列和批所特有的識(shí)別模式。放射性同位素標(biāo)記批的放射自顯影是一種傳統(tǒng)的檢測手段，但也可有其它選擇，包括電子信號(hào)傳導(dǎo)。
標(biāo)記如 此處所用，術(shù)語“標(biāo)記”，指施用某一特定批草藥組合物于某一特定生物系統(tǒng)后，對該特定草藥組合物進(jìn)行的該特定生物系統(tǒng)所特有的任何以生物學(xué)為基礎(chǔ)的測量和觀察。術(shù)語“標(biāo)記”包含對生物系統(tǒng)定量和定性的測量和觀察。標(biāo)記數(shù)據(jù)庫由描述對草藥治療應(yīng)答的基因表達(dá)模式的數(shù)據(jù)集組成，其中模式顯示應(yīng)答特定草藥組合物時(shí)哪些基因開啟、關(guān)閉、上調(diào)或下調(diào)。因此，“標(biāo)記”指任何以生物學(xué)為基礎(chǔ)的測量或觀察，生物系統(tǒng)中上調(diào)、下調(diào)或臨時(shí)調(diào)控、或表達(dá)水平的定性或定量改變用于描述生物系統(tǒng)對一種草藥組合物的特異的生物反應(yīng)。
施用于該生物系統(tǒng)的特定批草藥組合物可以是未知的草藥組合物、已知草藥組合物或標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物。用于完成本發(fā)明的標(biāo)記的實(shí)例包括，但不局限于，分子標(biāo)記、細(xì)胞遺傳標(biāo)記、生化標(biāo)記或大分子標(biāo)記。大分子標(biāo)記包括，但不局限于，酶、多肽、肽類糖、抗體、DNA、RNA、蛋白質(zhì)(翻譯蛋白質(zhì)和翻譯后蛋白質(zhì))、核酸、多糖。
任何滿足此處“標(biāo)記”定義的標(biāo)記對實(shí)施本發(fā)明適用。術(shù)語“標(biāo)記”包括相關(guān)其它術(shù)語，例如“生物標(biāo)記”或“遺傳標(biāo)記”或“基因標(biāo)記”。為達(dá)到增加HBR陣列分辨力的目的，一個(gè)或多個(gè)一級(jí)標(biāo)記可帶有二級(jí)標(biāo)記或一系列等級(jí)的標(biāo)記。因此，所選分子標(biāo)記可與其它各種分子標(biāo)記、細(xì)胞遺傳標(biāo)記、生化標(biāo)記或大分子標(biāo)記結(jié)合以使HBR陣列更準(zhǔn)確擴(kuò)展。
一種分子標(biāo)記包括一種或多種分子化合物的一種或多種微觀分子，如DNA、RNA、cDNA、核酸片段、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、脂質(zhì)體、脂肪酸、糖類和糖蛋白。
合適的分子標(biāo)記的建立、形成及使用是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的。對分子標(biāo)記鑒定特別有用的技術(shù)包括特異顯示，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，表達(dá)的序列標(biāo)志的大規(guī)模測序(ESTs)，基因表達(dá)的連續(xù)分析(SAGE)，蛋白質(zhì)免疫印跡或蛋白質(zhì)的二維、三維結(jié)構(gòu)研究以及微陣列技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)熟悉這些技術(shù)的方法和用途(參見如，Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications ofRecombinant DNA，Second Edition，ASM Press(1998)；MathewR.Walker and Ralph Rapley，Route Maps in Gene Technology，Blackwell Science(1997)；Roe等，DNA Isolation andSequenceing，John Wiley&Sons(1996)；James D.Watson等，Recombinant DNA，Second Edition，Scientific Amerian Books(1992)。
DNA，RNA及蛋白質(zhì)分離和測序的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的。這些熟知的技術(shù)的實(shí)例可在以下書中找到Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd Edition，Sambrood等，Cold SpringHarbor，N.J(1989)；Hanspeter Saluz and J.P.Jost，ALaboratoryGuide to Genomic Sequencing；The Direct Sequencing of NativeUncloned DNA(Biomethods Vol.1)，Birkhauser(1998)；and B.Roe等，DNA Isolation and Seauencing，Wiley(1996)。經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)的實(shí)例包括，但不局限于，體外連接，限制性核酸內(nèi)切酶消化，聚合酶鏈反應(yīng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，雜交，電泳，DNA測序，細(xì)胞培養(yǎng)等等?？少徺I的用于本發(fā)明的具體試劑盒和工具包括，但不局限于，用于RNA分離，PCR cDNA文庫構(gòu)建，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫，載體，基因表達(dá)分析，蛋白質(zhì)抗體純化，細(xì)胞毒性測定，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，高通量質(zhì)粒純化的試劑盒和工具。(參見，例如，CLONTECHniquesProduct catalog，XIII(3)，1-32(1998)or www.clontech.com；AtlasTMcDNA Expression Assays Product catalog(1998)；SIGMAProduct catalog(1997)。
至于核苷酸陣列、微陣列、DNA芯片或生物芯片的討論，方法學(xué)及應(yīng)用，請參見，例如，英國專利號(hào)5,445,934，5,605,662，5,631,134，5,736,257，5,741,644，5,744,305，5,795,714；Schena等，平行人基因組分析以微陣列為基礎(chǔ)的1000個(gè)基因的表達(dá)監(jiān)控，Proc.Natl.Acad.SCI.USA 93，10614-10619(1996)；Derisi等，探索基因組規(guī)模的基因表達(dá)的代謝和遺傳控制，Science 278，680-686(1997)；Wodicka，等，Genome-wide在啤酒酵母中的表達(dá)監(jiān)控Nature Biotechnology 15，1359-1367(1997)；Pardee，全面的基因組表達(dá)監(jiān)控人類，NatureBiotechnology 15，1343-1344(1997)；Schafer等，DNA變化及人類遺傳學(xué)的未來，Nature Biotechnology 16，33-39(1998)；DeRisi等，運(yùn)用cDNA微陣列分析人類癌癥的基因表達(dá)模式，NatureGenetics 14，457-460(1996)；Heller等，用cDNA微陣列發(fā)現(xiàn)和分析炎癥疾病相關(guān)的基因，Proc.Natl.Acad.SCI.USA 94，2150-2155(1997)；Marshall等，DNA芯片可能性的陣列，NatureBiotechnology 16，27-31(1998)；Schena等，微陣列功能基因組學(xué)的生物工程發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，Tibtech 16，301-306(1998)；Ramsay，DNA芯片本領(lǐng)域現(xiàn)狀，Nature Biotechnology 16，40-44(1998)；用高密度DNA陣列獲取基因組信息Chee等，Science 274，610-614(1996)；Chen等，應(yīng)用帶比色儀檢測的cDNA微陣列系統(tǒng)描繪表達(dá)模式并分離特異表達(dá)基因，Genomics 50，1-12(1998)；P.AndrewOutinen等，同型半胱氨酸應(yīng)激誘導(dǎo)作用的鑒定，Biochem.J.332，213-221(1998)；以及Gelbert等，遺傳學(xué)真的將使藥物發(fā)現(xiàn)過程發(fā)生革命性變化嗎，Curr 0pin Biotechmol 8(6)，669-674(1997)。
另外，運(yùn)用于本發(fā)明的更具體的文獻(xiàn)包括，但不局限于，那些闡明表達(dá)技術(shù)如ESTs的文獻(xiàn)(參見，如，Mechael R.Fannon，在正常和疾病狀態(tài)下的基因表達(dá)-治療目標(biāo)的鑒定，TIBTECH 14，294-298(1996)；蛋白質(zhì)形成圖(見，如，Robinson等，前列腺癌酪氨酸激酶圖譜，Proc.Natl.Acad.SCI.USA 93，5958-5962(1996)；鑒定草藥組合物成分的化學(xué)方法和光譜方法(Kojima等，來自Gliricidia Sepium的皂甙，Phytochemistry 48(5)，885-888(1998))；功能性抗原的確定(見，如抗原學(xué)，Nature Biotechnology16，305-307)1998)；HPLCs(見，如，Milton T.W.Hearn(Editor)，蛋白質(zhì)，肽和聚核苷酸的HPLC當(dāng)代主題和應(yīng)用(臨床化學(xué)和試驗(yàn)手冊中的分析技術(shù))，VCH Pub.(1991)；電泳(見，如，Westermeier等，實(shí)踐中的電泳DNA和蛋白質(zhì)分離方法及應(yīng)用指南，John Wiley&Sons(1997)；以及交叉反應(yīng)標(biāo)記測試(見，如，Irving Millman等，土撥鼠肝炎病毒試驗(yàn)性感染和自然發(fā)生，Hepatology 4(5)817-823(1984)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)駕駛座上的生物信息學(xué)，NatureBiotechnology 16，625-627 Terry Gaasterland中討論了應(yīng)用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)解決完整的基因組編碼的所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中方法學(xué)包括高通量直接結(jié)構(gòu)確定和計(jì)算機(jī)方法。至于生物信息學(xué)方法學(xué)，請參見，例如，Andreas Baxevanis(Editor)，生物信息學(xué)基因和蛋白質(zhì)分析實(shí)用指南，John Wiley&Sons(1998)和Luke Alphey，DNA測序從實(shí)驗(yàn)方法到生物信息學(xué)(生物工程系列引言)，SpringerVerlag(1997)。
細(xì)胞遺傳參數(shù)包括，但不局限于，核型分析(例如，染色體相對長度，著絲粒位置，存在或不存在次級(jí)壓縮)，象征圖(即，生物體核型的圖解表示)，有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)染色體行為，染色體的著色和帶型，DNA-蛋白質(zhì)相互作用(也稱為核酸酶保護(hù)測試)，中子散射研究，滾環(huán)(A.M.Diegelman and E.T.Kool，Nucleic Acids Res26(13)3235-3241(1998)；Backert等，Mol.Cell.Biol.16(11)6285-6294(1996)；Skaliter等，J.Viol.70(2)1132-1136(1996)；A.Fire and S.Q.Xu.Proc.Natl.Acad.SCI.USA 92(10)4641-4645(1995)，以及用放射性同位素標(biāo)記核糖核苷酸培養(yǎng)后的整個(gè)細(xì)胞核的放射自顯影。
生物化學(xué)的參數(shù)包括，但不局限于，具體途徑分析，例如信號(hào)傳導(dǎo)，蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸，RNA轉(zhuǎn)錄，膽固醇合成和降解，糖生成以及糖酵解。
指紋分析 如此處所用，這里使用的術(shù)語“指紋分析”指制作一種物質(zhì)的，尤其是草藥的特征分布圖用以鑒定它的一種手段。這里使用的“指紋圖譜”指用于指紋分析的特定方法的結(jié)果的顯示。
多種類型的指紋分析方法的例子包括，但不只限于，DNA指紋分析、蛋白質(zhì)指紋分析、化學(xué)制劑指紋分析和足跡法。
DNA指紋分析，或特征分布圖描繪，指制作來自特定生物學(xué)來源的(例如，特定的植物、植物的種、植物的屬、植物部位或植物組織)DNA的獨(dú)特模式的途徑。DNA指紋圖譜，或特征分布圖，可用于區(qū)分特定生物學(xué)來源和不同生物學(xué)來源。通過使用微陣列、寡聚核苷酸陣列、DNA芯片或生物芯片分析批所獲得的模式也稱作“指紋圖譜”。
蛋白質(zhì)指紋分析指產(chǎn)生細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體，例如植物中的蛋白質(zhì)的一種模式，這種模式在那時(shí)提供那種細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體的完全特征性指紋圖譜。
化學(xué)制劑指紋分析指在細(xì)胞中的低分子量化學(xué)制品的分析和用于鑒定細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體，例如植物的結(jié)果模式。通常使用氣相色譜(GC)、HPLC或質(zhì)譜來進(jìn)行分析。
足跡法指發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分子如何粘在一起的方法。就DNA來說，蛋白質(zhì)結(jié)合在被標(biāo)記的DNA片段上，接著DNA通過酶或化學(xué)藥品攻擊而降解。這一過程產(chǎn)生了各種大小的“梯形分布”的片斷。DNA在被結(jié)合蛋白質(zhì)保護(hù)的部位降解較少，因此“梯形分布”看起來較模糊。足跡法是用于定位調(diào)控基因活性的蛋白質(zhì)實(shí)際結(jié)合在DNA上的部位的一種普通技術(shù)。
用于完成每項(xiàng)指紋分析的手段或方法在這里的別的地方詳細(xì)描述。
生物反應(yīng) 如此處所用，“生物反應(yīng)”指在施用草藥組合物之后對生物系統(tǒng)的生物學(xué)反應(yīng)的任何觀察或測量。有時(shí)這里也稱作“生物學(xué)效應(yīng)”。生物反應(yīng)是指特定草藥組合物的生物學(xué)活性的定性或定量數(shù)據(jù)。生物反應(yīng)數(shù)據(jù)包括劑量和時(shí)間信息，其中這樣的信息為生物系統(tǒng)之于多種處理的測量反應(yīng)的領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。因此，生物反應(yīng)數(shù)據(jù)包括關(guān)于在特定時(shí)期以特殊的方式施用草藥組合物的特定劑量于特定生物系統(tǒng)的特定的生物學(xué)反應(yīng)的信息。
生物反應(yīng)包括，但不只限于，生理學(xué)反應(yīng)、形態(tài)學(xué)反應(yīng)、認(rèn)知反應(yīng)、動(dòng)機(jī)反應(yīng)、自主反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄后修飾，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的測定。許多草藥組合物顯示了多于一種的生物反應(yīng)(例如，見，Kee Chang Huang，中藥藥理學(xué)，CRC出版社(1993)。一些特殊的生物反應(yīng)可以包含在多于一種的被描繪的組中或具有包括多于一個(gè)組的反應(yīng)的方面或成分。適用于本發(fā)明的生物反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。下面的參考文獻(xiàn)是本領(lǐng)域技術(shù)狀況的代表Kee Chang Huang，中藥藥理學(xué)，CRC出版社(1993)；Earl Mindell.Earl mindell’s Herb Bile，Simon&Schuster(1992)；Goodman&Gilman’s治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)，第九版，Joel G.Hardman，等(eds)，McGraw Hill，Health ProfessionsDivision(1996)；P.J.Bentley，藥物作用的藥理學(xué)入門要素，劍橋大學(xué)出版社(1981)；P.T.Marshall and G.M.Hughes，哺乳動(dòng)物和其它脊椎動(dòng)物生理學(xué)，第二版，劍橋大學(xué)出版社(1980)；傳染性疾病委員會(huì)報(bào)告，American Academy of Pediatrics(1991)；Knut Schmidt-Nielsen，動(dòng)物生理學(xué)適應(yīng)和環(huán)境，第五版，劍橋大學(xué)出版社(1997)；ElainN.Marieb，人體解剖學(xué)和生理學(xué)，Addisib-WessleyPub.Co.(1997)；William F.Ganong，醫(yī)學(xué)生理學(xué)綜述(第18版)，Appleton & Lange(1997)；Arthur C.Guyton and John E.Hall，醫(yī)學(xué)生理學(xué)教科書，W.B.Saunders Co.(1995)。
“生理學(xué)反應(yīng)”指與生物系統(tǒng)的生理學(xué)，或功能相關(guān)的任何特性。細(xì)胞、組織或器官水平的生理學(xué)反應(yīng)包括，但不只限于，溫度，血液流速、脈率、氧濃度、生物電位、pH值、膽固醇水平、感染狀況(例如，病毒的、細(xì)菌的)和離子流。整個(gè)有機(jī)體基礎(chǔ)的生理學(xué)反應(yīng)包括腸胃功能(例如，潰瘍、胃疼、消化不良、胃灼熱)，生殖道功能(例如，基于生理學(xué)的陽痿、子宮痙攣、痛經(jīng))，排泄功能(例如，泌尿道問題、腎疾病、腹瀉、便秘)，血液循環(huán)(例如，高血壓、心臟紊亂)，耗氧，骨骼健康(例如，骨質(zhì)疏松)，軟骨和結(jié)締組織情況(例如，關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)炎)，運(yùn)動(dòng)，視力(例如，近視、視覺缺失)，肌肉緊張(例如，消瘦綜合癥、肌肉勞損)，疼痛的存在和消失，表皮和真皮的健康(例如，皮膚刺激、瘙癢、皮膚創(chuàng)傷)，內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，心臟功能，神經(jīng)協(xié)調(diào)，頭部相關(guān)的健康(例如，頭疼、頭暈)，年齡(例如，壽命、長壽)，呼吸(例如，充血、呼吸疾病)。
“形態(tài)學(xué)反應(yīng)”指在施用草藥組合物之后生物系統(tǒng)的任何關(guān)于形態(tài)學(xué)或形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特性。形態(tài)學(xué)反應(yīng)，無論生物系統(tǒng)的類型，包括，但不只限于，規(guī)模、重量、高度、寬度、顏色、發(fā)炎程度、一般外觀(例如，不透明性，透明性，蒼白)、干濕程度、有無癌性生長的存在和有無寄生蟲和害蟲(如，老鼠、虱、跳蚤)的存在。以整個(gè)有機(jī)體為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)反應(yīng)包括，但不只限于，毛發(fā)生長的量和部位(例如，多毛癥，脫發(fā))，是否有皺紋存在，指甲和皮膚生長的類型和程度，污潰凝固程度，是否有潰瘍和傷口存在和是否有痔瘡存在。
認(rèn)知反應(yīng)指在施用草藥組合物之后生物系統(tǒng)的任何關(guān)于認(rèn)知的，或意識(shí)狀態(tài)的特性。認(rèn)知反應(yīng)包括，但不只限于，感覺、識(shí)別、構(gòu)思、判斷、記憶、推理和想象。
“動(dòng)機(jī)反應(yīng)”指在施用草藥組合物之后生物系統(tǒng)的任何關(guān)于促動(dòng)，或誘導(dǎo)作用的特性。動(dòng)機(jī)反應(yīng)包括，但不只限于，情緒、(例如，高興)，欲望，學(xué)習(xí)動(dòng)力，特殊的生理需求(例如，食欲、性欲)或相似的作為刺激去行動(dòng)的沖動(dòng)(例如，精力，性欲)。
“自主反應(yīng)”指在施用草藥組合物之后生物系統(tǒng)的任何關(guān)于自主反應(yīng)的特性。自主反應(yīng)涉及生物系統(tǒng)的自主神經(jīng)系統(tǒng)。自主神經(jīng)反應(yīng)的例子包括，但不只限于，無意識(shí)的功能，(例如，神經(jīng)過敏，恐慌發(fā)作)，或生理需求(例如，呼吸、心律，激素釋放，免疫反應(yīng)，失眠，發(fā)作性催眠)。
用多種草藥組合物或草藥成分處理的細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)有機(jī)體的生物反應(yīng)為草藥領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，草藥組合物Sairei-to(TJ-114)，alismatis根莖(日本名字為‘Takusha’)和hoelen((日本名字為‘Bukuryou’)每一個(gè)都已發(fā)現(xiàn)具有抑制大鼠的內(nèi)皮素-1的合成和表達(dá)(Hattori等，Sairei-to可以抑制內(nèi)皮素-1在腎小球中的的合成，Nippon Jinzo Gakkai Shi 39(2)，121-128(1997))。用草藥藥物小柴胡湯處理培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)細(xì)胞顯著地促進(jìn)了白細(xì)胞介素(IL)-1α產(chǎn)生(Matsumoto等，用小柴胡湯培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞的白細(xì)胞介素-1調(diào)節(jié)的自分泌生長增強(qiáng)，JpnJ.Pharmacol 73(4)，333-336(1997)。小柴胡湯加入到從健康自愿者獲得的外周血的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中導(dǎo)致了劑量依賴的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)產(chǎn)生的增加(Yamashiki等，草藥藥物“小柴胡湯”在體外誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞的粒細(xì)胞集落刺激因子的產(chǎn)生，J ClinLab Immunol37(2)，83-90(1992))。這些研究者推斷小柴胡湯對治療與G-CSF有關(guān)的慢性肝病、惡性疾病和急性感染疾病可能有用。在用從中草藥黃芪中純化的皂甙astragaloside IV(AS-IV)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)之后I型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)-特有mRNA表達(dá)降低，而組織型纖溶酶原激活劑(t-PA-1)特有mRNA表達(dá)升高(Zhang等，培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)纖維蛋白分解潛力astragaloside IV下調(diào)I型纖溶酶原激活物抑制劑和上調(diào)組織型纖溶酶原激活劑的表達(dá)，J Vasc Res 34(4)，273-280(1997))。發(fā)現(xiàn)一種從人參的根中分離出的四種成分之一的成分是人單核細(xì)胞和THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-8的有效的誘導(dǎo)物，這一誘導(dǎo)伴隨著IL-8mRNA表達(dá)的增加(Sonoda等，來自人參根的酸性多糖對白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的刺激，Immunopharmacology 38(3)，287-294(1998))。通過流式細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)用Kampo-草藥藥物-Toki-shakuyakusan(TSS)處理增加了巨噬細(xì)胞Fcγ11/111受體和補(bǔ)體受體3(CR3)的表達(dá)(Cyong，來自Kampo-草藥藥物的BRM，NipponYakurigaku Zasshi110 Suppl 1，87P-92P(1997))。使用計(jì)算機(jī)圖像分析，Chen等，(在MRI/1pr鼠中細(xì)胞粘連分子-1表達(dá)的圖像分析中草藥的作用，Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 75(4)，204-206(1995))發(fā)現(xiàn)在用中草藥stragalin處理后，在MRI/1pr鼠中細(xì)胞粘連分子-1(ICAM-1)、免疫球蛋白和C3的分布強(qiáng)度顯著降低。Western印跡分析表明從自然中草藥藥物中分離的漢防己堿抑制在鼠的肺泡巨噬細(xì)胞中信號(hào)誘導(dǎo)的NF-κB的活化(Chen等，漢防己堿抑制在大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞中信號(hào)誘導(dǎo)的NF-κB的活化，Biochem Biophys Res Commun 231(1)，99-102(1997))。
算法 如此處所用，“算法”指逐步地問題解決程序，尤其是具有有限步數(shù)的確定的、遞歸計(jì)算的程序。用于植物相關(guān)的、標(biāo)記和生物反應(yīng)的數(shù)據(jù)的二維和三維分析的適當(dāng)?shù)乃惴樵谟?jì)算領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。這樣的算法對于構(gòu)建本發(fā)明的草藥生物反應(yīng)陣列是有用的。對于一般的關(guān)于算法的信息，見，例如，Jerrod H.Zar，生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，第二版，Prentice Hall(1984)；Robert A。Schowengerdt，Techniques for image processing and classification in remotesensing，Academic Press(1983)；Steven Gold等，用于2-維和3-維點(diǎn)匹配的新算法姿態(tài)估定和相符，Pattern Recognition，31(8)1019-1031(1998)；Berc Rustem，Algorithms for NonlinearProgramming and Multiple-Objective Decisions，Wiley-Interscience Series in Systems and Optimization，JohnWiley&Sons(1998)；Jeffrey H.Kingston，Algorithms and dataStructuresDesign.Correctness.Analvsis.InternationalComputer Science Series，Addison-Wesley Pub.Co.(1997)；StevenS.Skiena，The Algorithm Design Manual，SpringerVerlag(1997)；and Marcel F.Neuts，Algorithm ProbabilityACollection of Problems(Stochastic Modeling)，Chapman&Hall(1995)。對于應(yīng)用于以遺傳為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)的算法的更具體的信息，見，例如，Dan Gusfield，Algorithms on Strings，Trees，andSequencesComputer Science and Computational Biology，Cambridge University Press(1997)；Melanie Mitchell，AnIntroduction to Genetic Algorithms(Complex AdaptireSystems)，MIT Press(1996)；David E.Goldberg，GeneticAlgorithms in Search，Optimization and Machine Learning，Addison-Wessley Pub. Co.(1989)；Zbigniew Michalewicz，Genetic Algorithms＋Data Structures＝Evolution Programs，Springer Verlag(1996)；Andre g. Uitterlinden and Jan Vijg，Two-Dimensiomal DNA TypingA Parallel Approach to GenomeAnalysis，Ellis Horwood Seres in Molecular Biology，EllisHorwood Ltd.(1994)；and Pierre Baldi and Soren Brunak，BioinformaticsThe Machine Learning Approach(AdaptiveComputation and Machine Learning)，MIT Press(1998)。
組合化學(xué)。如此處所用，“組合化學(xué)”指用于創(chuàng)造成百上千個(gè)化合物的數(shù)目眾多的技術(shù)，其中，每個(gè)化合物具有一個(gè)或多個(gè)不同的特征，例如，它們的形狀、電荷、和/或疏水特性。組合化學(xué)可用來產(chǎn)生草藥或草藥組合物的化學(xué)變異體的化合物。這樣的化合物可用本發(fā)明的方法評價(jià)。
基本的組合化學(xué)的概念為化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知并且也可在Nicholas K.Terrett，Combinatorial Chemistrv(OxfordChemistry，Masters)，Oxford Univ.Press(1998)；AnthonyW.Czarnic and Sheila Hobbs Dewitt(Editors)，APractical Guideto Combinatorial Chemistry，Amer.Chemical Society(1997)；Stephen R.Wilson(Editor)and Anthony W.Czarnik(Contributor)，Combinatorial ChemistrySynthesis andApplication，John Wiley&Sons(1997)；Eric M.Gordon and JamesF.Kerwin(Editors)，Combinatorial Chemistry and MolecularDiversity in Drug Discovery，Wiley-Liss(1998)；Shmuel Cabilly(editor)，Combinatorial Peptide Library Protocols)Methodsin Molecular Biology)，Human Press(1997)；John P.Devlin，High Throughput Screening，Marcel Dekker(1998)；Larry Goldand Joseph Alper，通過組合化學(xué)跟上基因組學(xué)的步伐，NatureBiotechnology 15，297(1997)；Aris Persidis，組合化學(xué)，NatureBiotechnology 16.691-693(1998)中找到。
實(shí)施例實(shí)施例1.建立一個(gè)選定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
圖1提供了建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的HBR陣列的基本方案。圖解的每個(gè)成分的定義由上述文字提供。
在選擇了目的草藥組合物之后，收集與草藥組合物多種特性相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括但不只限于植物相關(guān)特性、標(biāo)記和生物反應(yīng)信息。
植物相關(guān)數(shù)據(jù)包括，但不只限于，植物的種，特定的植物部位，草藥組合物中植物的地理產(chǎn)地，植物的生長條件，用于制備草藥組合物的加工方法，貯藏方法和條件，草藥組合物的各種化學(xué)分析。標(biāo)記信息包括施用草藥堆肥于一個(gè)生物系統(tǒng)之后收集的標(biāo)記的定性和定量數(shù)據(jù)。適用的標(biāo)記包括，但不只限于分子標(biāo)記，細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記，生物化學(xué)標(biāo)記和大分子標(biāo)記。生物反應(yīng)信息包括施用草藥組合物于一個(gè)生物系統(tǒng)之后收集的生物反應(yīng)的定性和定量數(shù)據(jù)。
每種類型的數(shù)據(jù)(例如，化學(xué)，標(biāo)記，生物反應(yīng))都可以使用一種或多種對相同的，相似的，基本上相似的，或不同批的感興趣的草藥組合物的分析來獲得。這樣不同的分析可以在相同的或不同的時(shí)間進(jìn)行。另外，可以在相同的或不同的時(shí)間收集相同或不同的標(biāo)記的數(shù)據(jù)。類似地，可以在相同的或不同的時(shí)間收集相同或不同的生物反應(yīng)的生物反應(yīng)數(shù)據(jù)。這樣HBR陣列數(shù)據(jù)的收集或者是在一個(gè)時(shí)間收集或者是在連續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)上收集。給生物系統(tǒng)施用草藥組合物以便于收集數(shù)據(jù)，根據(jù)草藥組合物的施用劑量和處理時(shí)間記錄信息。生物反應(yīng)數(shù)據(jù)也可以包括轉(zhuǎn)錄后修飾，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的測量。
在收集了一種或多種類型的數(shù)據(jù)之后(例如二種或多種的標(biāo)記的和生物反應(yīng)的數(shù)據(jù)；植物相關(guān)特性的數(shù)據(jù)和生物反應(yīng)數(shù)據(jù))，使用算法分析數(shù)據(jù)以便產(chǎn)生2-和/或3-維草藥生物反應(yīng)陣列。
各種統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)可以被計(jì)算用于HBR陣列并且可以成為HBR陣列數(shù)據(jù)集的一部分。這些統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)可以包括，但不只限于，平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，相關(guān)或相配(或不相配)矩陣，比率，回歸系數(shù)，和變換值(即原始數(shù)據(jù)的反正弦百分率變換)。這樣，HBR陣列可以包括原始數(shù)據(jù)和某些計(jì)算出來的結(jié)果，分布，圖解描述和與原始數(shù)據(jù)相關(guān)的其他數(shù)據(jù)的操作。這種信息的特定的例子包括，但不只限于，數(shù)字圖像，散射圖，集束分析和標(biāo)記數(shù)據(jù)的大規(guī)?；虮磉_(dá)圖。
全部積累的數(shù)據(jù)和組合分析構(gòu)成了用于建立HBR陣列數(shù)據(jù)集的特定的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。由于用于建立和維持草藥組合物HBR陣列過程的可重復(fù)性，因此這種分析即可被看作在一段時(shí)間內(nèi)的任一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上時(shí)靜態(tài)的也可被看作在經(jīng)過的一段時(shí)間中是動(dòng)態(tài)的。
結(jié)果分析能鑒定與任何特定草藥組合物的一種或多種特定的生物學(xué)活性相關(guān)的(正的或負(fù)的)或有聯(lián)系的(即，顯示總的趨勢)標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列的子集。
實(shí)施例2.建立批草藥組合物的批HBR陣列圖2提供了建立批草藥組合物的HBR陣列的基本方案。圖解的每個(gè)成分的定義由上文提供。建立這樣一個(gè)陣列的過程與緊接著的上文對標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列的闡述相同。
通常，批HBR陣列需收集的數(shù)據(jù)量將少于建立標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列需收集的數(shù)據(jù)量。但是，收集的批草藥組合物的數(shù)據(jù)可以被添加到已建立的HBR陣列中或用于建立一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)化的陣列。
通常，已經(jīng)收集到的與被測試的草藥組合物所期望的生物學(xué)活性高度相關(guān)或相聯(lián)系的數(shù)據(jù)是收集的批草藥組合物最好的數(shù)據(jù)。例如，如果已確定植物相關(guān)的特定的子集和標(biāo)記數(shù)據(jù)與特定的草藥組合物(基于標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列數(shù)據(jù)和上述討論的分析)所期望的生物學(xué)活性高度相關(guān)，那么為了確定這批是否具有期望的生物學(xué)活性，只需要測試那種特性子集的批草藥組合物。通過比較從批中獲得的那種特性的子集的數(shù)據(jù)(即，批HBR陣列)和那個(gè)特定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定特定的批是否具有期望的生物學(xué)活性。
實(shí)施例3.建立和使用主要數(shù)據(jù)集。
圖3提供了建立和使用草藥組合物主要數(shù)據(jù)集的基本方案。圖解的每個(gè)成分的定義由上文提供。
第一步是建立選定的草藥組合物或批草藥組合物的主要數(shù)據(jù)集。這可通過施用草藥組合物于生物系統(tǒng)并收集將構(gòu)成主要數(shù)據(jù)集的相應(yīng)的標(biāo)記信息來完成。通常，但不是偶然，主要數(shù)據(jù)集將包括陣列形式的基因組學(xué)和/或蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，例如用DNA芯片獲得的陣列。
下一步，分析主要數(shù)據(jù)集來看一看是否已經(jīng)獲得了被測草藥組合物的特異表達(dá)/結(jié)果。特異表達(dá)/結(jié)果對于在下一步產(chǎn)生有意義的算法是必須的。這種特異表達(dá)/結(jié)果的例子包括，但不只限于，在對施用的草藥組合物做出反應(yīng)時(shí)某種基因是上調(diào)還是下調(diào)或在對施用做出反應(yīng)時(shí)某種蛋白質(zhì)的水平是已經(jīng)得到升高或是已經(jīng)得到降低的指標(biāo)。
如果沒有獲得有意義的或有用的特異表達(dá)/結(jié)果，那么重復(fù)施用和標(biāo)記收集步驟是必須的。如果確信實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致了第一次缺乏足夠的結(jié)果，就用與第一次相同的所有變量(例如，相同的生物系統(tǒng)，相同的標(biāo)記集，相同的實(shí)驗(yàn)方法等)來重復(fù)施用/數(shù)據(jù)收集步驟。但是，為了獲得特異的表達(dá)/結(jié)果必須改變生物系統(tǒng)取樣(例如，使用的細(xì)胞類型，細(xì)胞生長的階段)，使用不同的標(biāo)記集和/或改變實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)施例4.使用HBR陣列信息這里討論的HBR陣列信息能用于包括，但不只限于，下面內(nèi)容的許多不同的目的1)評價(jià)草藥組合物的成分；2)預(yù)測草藥組合物的生物反應(yīng)；3)確定哪種標(biāo)記信息與草藥組合物的特定生物反應(yīng)的相關(guān)性最強(qiáng)；3)確定什么樣的信息數(shù)據(jù)集(即，植物相關(guān)數(shù)據(jù)，標(biāo)記數(shù)據(jù)，和生物反應(yīng)數(shù)據(jù))與草藥組合物的特定的生物反應(yīng)最相關(guān)；4)確定那種生物系統(tǒng)最適于評價(jià)草藥組合物的生物學(xué)活性；5)調(diào)整或改變草藥組合物的成分使得那種草藥組合物的HBR陣列符合相同的或基本上相同的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列；6)調(diào)整或改變草藥組合物的成分使得草藥組合物具有期望的生物學(xué)活性；7)產(chǎn)生和更新標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列；8)鑒定具有草藥組合物期望的生物學(xué)活性的特定的成分(例如，植物部位，蛋白質(zhì)，分子)；9)當(dāng)維持或改善草藥組合物期望的生物學(xué)活性的時(shí)候，確定那種草藥組合物的成分可以被去除；10)鑒定草藥組合物的一種或多種以前未知的生物學(xué)活性；11)幫助設(shè)計(jì)包括草藥和非草藥成分的治療，例如化學(xué)合成藥物或制劑并且12)利用HBR陣列信息來補(bǔ)充設(shè)計(jì)治療的組合化學(xué)方法。本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這里提供的方法和工具來完成。
實(shí)施例5.質(zhì)量控制。
本發(fā)明的HBR陣列技術(shù)可用于使草藥組合物(單一草藥或配方中的多種草藥)的特定批與標(biāo)準(zhǔn)化的、或主要的、相同或基本相似的草藥組合物的批相互關(guān)聯(lián)或確定其基本上相等。在此過程中使用的HBR陣列包括每個(gè)生物效應(yīng)(即，生物反應(yīng))量變可接受的范圍，和包括由分配給每個(gè)生物效應(yīng)的加權(quán)值組成的可能的綜合比數(shù)，其可以包括來自生物系統(tǒng)的多種生物化學(xué)途徑的標(biāo)記。
“數(shù)據(jù)甄選”指用于確定或選擇哪個(gè)生物效應(yīng)的子集是在任一特定HBR陣列中所需要的生物效應(yīng)的最小量的過程。數(shù)據(jù)甄選的信息得自于以劑量依賴的方式施用標(biāo)準(zhǔn)化的草藥組合物于生物系統(tǒng)(例如，一種細(xì)胞系)以建立標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。接著這一標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列可與為測試草藥組合物而建立的多種HBR陣列相比較。這些被測試的草藥組合物包括，但不只限于，在不同時(shí)期制備的不同的批；從在不同時(shí)間收集的未經(jīng)加工的草藥中制備的不同的批；和從在不同地點(diǎn)收集的生藥中制備的不同的批。
實(shí)施例6.改善草藥組合物或鑒定草藥組合物的新用途。
HBR陣列是通過將一個(gè)配方的單個(gè)草藥的提取物或者整個(gè)配方的提取物施用于生物系統(tǒng)，并且檢測提取物的生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生的。觀察到的生物學(xué)效應(yīng)可以來自生物系統(tǒng)的多個(gè)生物化學(xué)途徑和/或來自一個(gè)動(dòng)物的多個(gè)組織，其中評價(jià)了多種標(biāo)記的相應(yīng)的質(zhì)和/或量的改變。得到的HBR陣列可與新的HBR陣列或與來自不同草藥組合物或來自由不同的加工方法制備的草藥組合物的相似的HBR陣列相比較。這一過程對于選擇生物學(xué)效應(yīng)給定的集和預(yù)測給定的批草藥組合物具有生物學(xué)效應(yīng)的給定的集所需要的最小量的標(biāo)記是有用的。
為了構(gòu)建HBR陣列，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用包括，但不只限于，統(tǒng)計(jì)分析、人工智能、和關(guān)于神經(jīng)行為數(shù)據(jù)庫研究的多種數(shù)據(jù)甄選工具。所選的統(tǒng)計(jì)方法包括，但不只限于，基本探索性數(shù)據(jù)分析(EDA)，圖解的EDA(例如bushing)和多元探索性技術(shù)(例如，簇分析、差別因素分析、依據(jù)非線性回歸的逐步線性、分類樹)(見，例如，STATISTICATM，來自StatSoft的軟件包，Tulsa，OK 74104；Tel918-749-1119；Fax918-749-2217；www.statsoft.com)。
使用數(shù)據(jù)甄選工具來探索大量的HBR陣列數(shù)據(jù)在多種HBR陣列之內(nèi)、之間或之中尋求構(gòu)建HBR陣列和尋找一致的模式。此過程包括探索、HBR陣列構(gòu)建，和證實(shí)。這一程序一般是迭代重復(fù)直到鑒定了一個(gè)有說服力的HBR陣列、或標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。
因?yàn)樾揎棇Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，因而先前已給出的詳述只是為了理解清楚，并且其中沒有應(yīng)該被理解的非必須的限制。
雖然我們在描述此發(fā)明時(shí)總是與具體的實(shí)施方案聯(lián)系在一起，但是并不是說我們不能對它有進(jìn)一步的改進(jìn)。一般來說，只要遵守此發(fā)明的原理，考慮到此發(fā)明與當(dāng)前已知和慣常的使用間的區(qū)別，我們就可以使之有多種用途，適用于不同變化。同時(shí)，此發(fā)明除了具有先前提及的各種功用，亦可在接下來附加權(quán)利要求書的范圍內(nèi)使用。
實(shí)施例7.建立人參配方的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列為了這一實(shí)施例的目的，選擇的標(biāo)準(zhǔn)人參是人參G115(PanaxGinseng C.A.Meyer G115)生長在滿洲或者是在朝鮮。生長的氣候是在-10至+10℃之間，具有50-100cm的年降雨量(見Huangd的中草藥藥理學(xué)(The pharmacology of Chinese Herbs)，(1993)pp21-45，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，全文完全引用作為參考)。首先通過地理產(chǎn)地、種、植物部位(例如，根莖、根、葉皮、種子、芽和花)；生長條件、加工方法和在加工前和加工后的貯藏條件來描繪人參批的特性。將通過定性HPLC分析進(jìn)行這些批的化學(xué)成分的核實(shí)以確定人參皂甙(例如，Ro、Ra1、Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rg1、Rg2、Rd、Re、Rf、Rh1、Rh2、NG-R2和Z-R1)，包括親脂性成分的TLC定性分析(見，Elkin等，Chumg Kuo Yao Li Hsueh Pao(1993)1497-100和Yoshikawa等，Yakugaku Zasshi(1993)113460-467)。不同草藥的皂甙含量依據(jù)種應(yīng)在2.1和20.6％(依據(jù)重量)之間(見表1)。接著將這些數(shù)據(jù)貯存在優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器中，以備進(jìn)一步操作。
表1.不同人參草藥的皂甙含量*。
*選自Huang的中草藥藥理學(xué)，(1993)pp21-45，CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)L標(biāo)準(zhǔn)人參(即，G115)的表達(dá)的生物標(biāo)記包括下面內(nèi)容IL-8、IL-2、GM-CSF、NfiB、ICAM-1、γ-干擾素、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶、trk A、神經(jīng)生長因子(Kim等，植物藥(Planta Med)(1998)64110-115；Sonoda等，免疫藥理學(xué)(Immunopharmacology)(1998)38287-294；Baum等，歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志(Eur J Appl Physiol)(1997)76165-169；Iwangawa等，自由基生物藥物(FreeRadic Biol Med)(1998)241256-1268；Rhind等，歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志(1996)74348-360)?？晒┻x擇地，對于更大的批規(guī)模，可使用Affimatrix的400,000個(gè)寡聚核苷酸組/cm2的芯片(U.S.Pat.NO.5,556,752)。通過使用或者光刻法、機(jī)械顯微加點(diǎn)法或者墨汁噴射法的cDNA微陣列技術(shù)來制備標(biāo)準(zhǔn)人參的表達(dá)生物標(biāo)記(見，Schena等，TIBTECH(1998)16301-306)。在不同的時(shí)期不同的條件下施用標(biāo)準(zhǔn)人參于被選定的細(xì)胞的集以產(chǎn)生多個(gè)微陣列集。接著運(yùn)用以雜交為基礎(chǔ)的，通過從在微陣列上的每個(gè)位置上的熒光強(qiáng)度中扣除定態(tài)的mRNA水平的生化提取物的表達(dá)監(jiān)控來分析微陣列集(Schena等，科學(xué)(Science)(1995)270467-470；Schena等Proc Natl Acad SciUSA(1996)9310614-10619；Lockhart等，Nat Biotechnol(1996)141675-1680；DeRisi等，Nat Genet(1996)14475-460；Heller等，Proc Natl Acad Sci USA(1997)942150-2155)。然后將陣列數(shù)據(jù)輸入到算法中以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)人參的統(tǒng)計(jì)學(xué)的表達(dá)生物標(biāo)記值。標(biāo)準(zhǔn)人參的生物化學(xué)的生物標(biāo)記包括定量分析放線菌酮敏感的[3H]-亮氨酸按比例摻入到蛋白質(zhì)合成的增加和有絲分裂反映的[3H]-胸腺嘧啶摻入的增加。(見Yamamoto等，Arzneimittelforschumg(1997)271169-1173)。對于生物化學(xué)的生物標(biāo)記，在[3H]-胸腺嘧啶存在時(shí)(對于DNA合成)或在放線菌酮存在和[3H]-亮氨酸不存在時(shí)(對于蛋白質(zhì)合成)在不同時(shí)期不同條件下施用標(biāo)準(zhǔn)人參于骨髓細(xì)胞來進(jìn)行生物化學(xué)的生物標(biāo)記的多種定量分析(即，BBM集)。然后把BBM集輸入到算法中以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)人參的統(tǒng)計(jì)學(xué)的生物化學(xué)的生物標(biāo)記值。接著將統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)貯藏在優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器，以備進(jìn)一步操作。
使用細(xì)胞或整體動(dòng)物來確定生物系統(tǒng)的生物化學(xué)反應(yīng)(即，生物反應(yīng))。對于細(xì)胞而言，將以0.5mg/ml-100mg/ml的濃度施用人參批于特定的細(xì)胞型，包括，但不只限于，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、PMNL、LAK細(xì)胞、B16-F10黑素瘤細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和海馬神經(jīng)元。對于動(dòng)物治療，以0.5-100mg/kg的濃度經(jīng)口服、腹腔注射或皮下注射施用人參提取物。
為確定生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)化的人參的生物化學(xué)反應(yīng)，將人卵巢癌細(xì)胞接種到裸鼠中，其導(dǎo)致可觸知腫瘤的形成。在腫瘤形成后一起施用順鉑和標(biāo)準(zhǔn)人參來治療小鼠。根據(jù)血細(xì)胞比容值和體重檢查鼠的腫瘤生長抑制、存活時(shí)間的延長和降低的副作用(Nakata等，日本癌癥研究雜志(Jpn J Cancer Res)(1998)89733-740)。使用多種濃度的標(biāo)準(zhǔn)人參來重復(fù)分析以產(chǎn)生每個(gè)變量的集中趨勢、分散作用和變異性的方法。
然后將所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行多維分析以產(chǎn)生多元正態(tài)分布集作為確定生物活性和標(biāo)準(zhǔn)人參之間基線相關(guān)性的方法。(見Zar，J.H.，的生物統(tǒng)計(jì)分析(Biostatistical Analysis)，第二版(1984)，pp328-360，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ)。生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)人參生物反應(yīng)的第二個(gè)獨(dú)立的測定是在運(yùn)動(dòng)鍛煉期間標(biāo)準(zhǔn)人參對體育行為的作用。用標(biāo)準(zhǔn)人參以不同的濃度(0.5-100mg/kg/天)治療大鼠4天，并且檢測動(dòng)物增加的血漿自由脂肪酸水平和在大約以70％V02max的鍛煉期間葡萄糖水平的維持(見Wang等，植物藥(1998)64130-133)。收集產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，接著進(jìn)行多維分析來產(chǎn)生多元正態(tài)分布集作為確定生物活性和標(biāo)準(zhǔn)人參之間基線相關(guān)性的方法(見Zar，J.H.，的生物統(tǒng)計(jì)分析(Biostatistical Analysis)，第二版(1984)，pp328-360，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ，這里，全文完全引用作為參考)。然后將每個(gè)生物反應(yīng)的分布集輸入到算法來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)人參的統(tǒng)計(jì)學(xué)值。接著貯存統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器，以備進(jìn)一步操作。
反復(fù)重作這些步驟中的每一步(即，化學(xué)分析、生物標(biāo)記信息的產(chǎn)生和生物系統(tǒng)生物反應(yīng)的測定)以產(chǎn)生大規(guī)模的統(tǒng)計(jì)學(xué)值的數(shù)據(jù)庫。編輯這些數(shù)值并輸入到算法中以產(chǎn)生2-和3-維標(biāo)準(zhǔn)化的人參的草藥反應(yīng)陣列(HBR陣列)。通過反復(fù)重做，獲得的陣列(即，標(biāo)準(zhǔn)化的陣列)顯示了在組合物(包括生長條件)、生物標(biāo)記信息和標(biāo)準(zhǔn)化的人參的生物反應(yīng)之間的最高相關(guān)性。通過在用于測試的批HBR陣列中的顯示數(shù)據(jù)，運(yùn)用確定組合物二個(gè)或多個(gè)已知相關(guān)的變量和生物標(biāo)記信息值，通過比較相對于標(biāo)準(zhǔn)化人參的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列值的測試值可預(yù)測測試的批生物學(xué)反應(yīng)的變量值。獲得的預(yù)測可用于評價(jià)給定的人參批的質(zhì)量而不必使用觀察到的生物系統(tǒng)的生物學(xué)反應(yīng)(見實(shí)施例2)。
實(shí)施例8.使用與特定生物學(xué)反應(yīng)相關(guān)的變量的子集來評價(jià)被選定的人參草藥組合物為了評價(jià)測試的批草藥組合物的質(zhì)量，首先收集在選定的草藥組合物中關(guān)于草藥的植物相關(guān)參數(shù)的數(shù)據(jù)(例如，植物的種，植物的部位，地理產(chǎn)地，生長條件，加工方法，貯藏條件)。然后處理被選定的草藥組合物以便能進(jìn)行化學(xué)分析來測定草藥的化學(xué)含量(見Elkin等，中國藥理學(xué)報(bào)(Chumg Kuo Yao Li Hsueh Bao)(1993)1497-100和Yoshikawa等，Yakugaku Zasshi(1993)113460-467)。先前獲得的人參的數(shù)據(jù)已顯示了在需氧運(yùn)動(dòng)行為期間的耗氧和皂甙組合物，尤其是Rg1和Rb1的子集之間存在的強(qiáng)相關(guān)性(Wang等，植物藥(1998)64130-133)。
接著以0.5mg/ml至100mg/ml的濃度將測試批施用于測試的細(xì)胞，其包括，但不只限于，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、PMNL、LAK細(xì)胞、B16-F10黑素瘤細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和海馬神經(jīng)元以確定表達(dá)生物標(biāo)記值。mRNA從被施用后的細(xì)胞中分離，隨后其被操作作為基于雜交的生物化學(xué)提取物表達(dá)監(jiān)控的底物，其使用包括IL-8、IL-2和γ-干擾素cDNA的微陣列。(Schena等，科學(xué)(1995)270467-470；Schena等，Proc Natl Acad Sci USA(1996)9310614-10619；Lockhart等，Nat Biotechnol(1996)141675-1680；DeRisi等Nat Genet(1996)14457-460；Heller等，Proc Natl Acad SciUSA(1997)942150-2155)。先前獲得的人參數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示了在有氧運(yùn)動(dòng)行為期間的耗氧和在測試的細(xì)胞中表達(dá)生物標(biāo)記IL-8、IL-2和γ-干擾素的誘導(dǎo)之間的強(qiáng)相關(guān)性(Venkatraman等，Med Sci SportsExerc(1997)29333-344和Wang等，植物藥(1998)64130-133)。對于生物化學(xué)的生物標(biāo)記，接著施用測試的批于大鼠骨髓細(xì)胞并且分析反映有絲分裂的[3H]胸腺嘧啶的摻入。先前獲得的人參的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明Rb1和Rg1與在大鼠骨髓細(xì)胞中的DNA的合成顯示了強(qiáng)相關(guān)性(Yamamoto等，Arzneimittelforschung(1978)282238-2241)。
在反復(fù)重做分析之后，將來自每個(gè)分析的數(shù)據(jù)輸入到算法中，在列舉的包括化學(xué)分析、和涉及生物標(biāo)記子集的數(shù)據(jù)的植物相關(guān)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上以產(chǎn)生被選定的草藥組合物的測試HBR陣列。通過比較測試的HBR和指導(dǎo)上述觀察資料和子集分析的標(biāo)準(zhǔn)人參的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的變量來確定測試批的質(zhì)量。其中在體外IL-2、IL-8和γ-INF的mRNA誘導(dǎo)的證明和摻入到鼠骨髓細(xì)胞中的[3H]-胸腺嘧啶增加(包括收集的關(guān)于生長條件、產(chǎn)地，和皂甙Rg1和Rb1的證實(shí)的數(shù)據(jù))預(yù)示了象標(biāo)準(zhǔn)人參顯示的那樣的關(guān)于耗氧的測試批的等價(jià)生物反應(yīng)效應(yīng)?；谶@一過程可確定測試的批與給定的生物學(xué)反應(yīng)或目的生物學(xué)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)相比是否具有相似的或不同的特性。
實(shí)施例9.建立Huang Ling(HL)配方的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。
為了這一實(shí)施例的目的，被選擇的標(biāo)準(zhǔn)huang ling(HL)是產(chǎn)自西南亞的黃連，其中生長條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見Huang的中草藥藥理學(xué)，(1993)pp69和287-288，CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)L)。通過定量化學(xué)分析確定黃連干根莖的化學(xué)含量如砷、小檗堿、蛙皮素酸、非洲防己堿、copsine、黃連次堿、coptiside-I、coptiside-II、黃連堿、考雷明、表小檗堿、阿魏酸、greenlandicine、異黃連堿、光暗酸、木蘭花堿、oxybererine、thalifendine、傘花堿、urbenine、worenine、巴馬亭、藥根堿和colubamine(又見ZhuM.，中藥通報(bào)(Chung Yao Tung Pao)(1984)963-64)。不同草藥的生物堿berberine應(yīng)在7-9％之間(依據(jù)重量)。將這些數(shù)據(jù)貯存，優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器，以備進(jìn)一步操作。
標(biāo)準(zhǔn)HL的表達(dá)標(biāo)記包括如下內(nèi)容NfκB；bc1-2類似物、A1；鋅指蛋白、A20；IL-2受體；細(xì)胞周期探針；c-Ki-ras2；生長調(diào)節(jié)子探針和依賴凋亡探針的糖皮質(zhì)激素受體(見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107；Yang等Naunyn Schmiedebergs ArchPharmacol(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(xué)(BiochemPharmacol)(1997)53；Chang K.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。可供選擇地，對于更大的批規(guī)模，可使用Affimatrix的400,000個(gè)寡聚核苷酸組/1.6cm2的芯片(U.S.Pat.No.5,556,752)。通過如實(shí)施例1所描述的微陣列技術(shù)來制備標(biāo)準(zhǔn)HL的表達(dá)標(biāo)記，包括分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)的產(chǎn)生。
標(biāo)準(zhǔn)的HL的生物化學(xué)的生物標(biāo)記包括糖皮質(zhì)激素的增加和在施用了HL的HepG2細(xì)胞中α-feto蛋白質(zhì)分泌的抑制(見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107)。按實(shí)施例1中所述的那樣產(chǎn)生和分析BBM集。接著貯存統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器，以備進(jìn)一步的操作。使用細(xì)胞和整體動(dòng)物來確定生物系統(tǒng)的生物學(xué)反應(yīng)。將被選定的草藥組合物的批以0.1-100mg/ml的濃度施用于特定的細(xì)胞型，包括，但不只限于，人HepG2肝癌細(xì)胞、人胚胎性癌細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。經(jīng)口、腹膜內(nèi)注射或皮下注射施用0.1mg-2g/kg的科普特人的草藥組合物(即，HL)用于動(dòng)物治療。為了確定生物系統(tǒng)對于標(biāo)準(zhǔn)化HL的生物學(xué)反應(yīng)，施用各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)HL給人胚胎性癌克隆、NT2/D1并且檢查分化成具有神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞(ChangK.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。重復(fù)分析以產(chǎn)生度量標(biāo)準(zhǔn)并且按實(shí)施例1中所描述的人參那樣進(jìn)行分析。生物系統(tǒng)對于標(biāo)準(zhǔn)HL的生物學(xué)反應(yīng)的第二個(gè)獨(dú)立的測定將是標(biāo)準(zhǔn)HL的對于由有腸毒素的大腸桿菌(ETEC)引起的腹瀉的效應(yīng)。用各種濃度的HL(例如，2g/kg)治療患有由于ETEC的活性腹瀉的患者并且測定糞便的體積(見，例如，Rabbani G.H.，Dan Med Bull(1996)43173-185)。重復(fù)分析以產(chǎn)生度量標(biāo)準(zhǔn)并且按實(shí)施例1中所描述的人參那樣進(jìn)行分析。然后將每個(gè)生物學(xué)系統(tǒng)的分布集輸入到算法中以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)HL的統(tǒng)計(jì)學(xué)值。接著貯存統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，優(yōu)選計(jì)算機(jī)處理器的存儲(chǔ)器，以備進(jìn)一步的操作。
最后，按實(shí)施例1中所述，反復(fù)重做這些步驟以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的HL的HBR陣列。其中獲得的HBR陣列接著將被用于預(yù)測生物學(xué)活性和評價(jià)批特性。使用這一方法，可產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列并定期更新。
實(shí)施例10.使用與特定生物學(xué)反應(yīng)相關(guān)的變量的子集評價(jià)被選定的Huang Ling草藥組合物為了評價(jià)被選定的Huang Ling草藥組合物測試批特性，首先收集關(guān)于植物相關(guān)特征(例如，植物的種、植物部位、地理產(chǎn)地、生長條件、加工方法和貯藏條件)的數(shù)據(jù)。接著處理草藥組合物以便能進(jìn)行化學(xué)分析來確定組合物的化學(xué)含量(也見Zhu M.，中藥通報(bào)(1984)963-63)。
先前獲得的HL數(shù)據(jù)已經(jīng)表明人胚胎性癌克隆末端分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞與小檗堿的存在具有強(qiáng)相關(guān)性(見Chang K.S.，JFormos MedAssoc(1991)9010-14)。然后將測試的批以非毒性濃度(其可由普通技術(shù)人員來確定)的起始濃度施用于包括人胚胎性癌克隆、NT2/D1的測試細(xì)胞。mRNA從被施用的細(xì)胞中分離，其隨后經(jīng)過操作來作為使用包括IL-2受體和NfκB的微陣列的生物化學(xué)提取物的基于雜交的表達(dá)監(jiān)控底物(見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107；Yang等Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(xué)(Biochem Pharmacol)(1997)53；Chang K.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14；U.S.Pat.No.5，556，752)，并且其可用于確定上述細(xì)胞的c-Ki-ras2基因表達(dá)的下調(diào)。先前獲得的HL的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明了人胚胎性癌克隆末端分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞與促細(xì)胞分裂劑探針的誘導(dǎo)和c-Ki-ras2基因表達(dá)下調(diào)高度相關(guān)(見Chang K.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。
對于生物化學(xué)標(biāo)記，給HepG2細(xì)胞施用測試組合物并且分析細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體的增加和α-feto蛋白質(zhì)分泌的抑制(見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107)。先前獲得的HL數(shù)據(jù)已經(jīng)表明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)凋亡的抑制與小檗堿型生物堿高度相關(guān)(Miura等，生化藥理學(xué)(Biochem Pharmacol)(1997)531315-1322)。在反復(fù)重做分析后，將來自每個(gè)陣列的數(shù)據(jù)輸入算法來產(chǎn)生建立在列舉的觀察數(shù)據(jù)、化學(xué)數(shù)據(jù)和關(guān)于生物標(biāo)記子集的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的測試HBR陣列。
通過比較測試HBR陣列和指導(dǎo)上述觀察和子集的分析的標(biāo)準(zhǔn)HLHBR陣列的變量將能確定測試批特性，其中IL-2受體和NfκB的誘導(dǎo)、c-Ki-ras2基因表達(dá)的下調(diào)、糖皮質(zhì)激素受體的增加和HepG2細(xì)胞的α-feto蛋白質(zhì)分泌的抑制的證明(包括收集的關(guān)于生長條件、產(chǎn)地、和berberine生物堿的驗(yàn)證的數(shù)據(jù))預(yù)示了測試批的等價(jià)生物反應(yīng)的效應(yīng)，其是關(guān)于如標(biāo)準(zhǔn)HL顯示的那樣的人胚胎性癌克隆末端分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞和地塞米松誘導(dǎo)的凋亡的抑制?；谶@一過程可以確定測試批是否具有相似的或不同于標(biāo)準(zhǔn)的特性。
實(shí)施例11.使用兩種生物分析評價(jià)小柴胡湯。
為了評價(jià)三種來源的小柴胡湯的質(zhì)量，使用了兩種生物分析1)細(xì)胞生長抑制和2)從感染的細(xì)胞中乙型肝炎病毒的分泌作用。小柴胡湯組合物從6-7種草藥植物(柴胡、半夏，干姜，黃芩，大棗，黨參、人參和甘草，相對量見表2，依據(jù)重量)的混合物中制備。
表2.小柴胡湯組合物
三種“配方”產(chǎn)于新加坡、朝鮮或者是產(chǎn)于臺(tái)灣。如通過DNA定量或檢查乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)進(jìn)行檢查的那樣來評價(jià)批的毒性和抑制B型肝炎病毒的能力(見Dong等，Proc Natl Acad SciUSA(1991)888495-8499)。
扼要地，將1克制品加到10ml水中。煮沸混合物30分鐘。離心后收集上清液并通過0.22μM的濾器過濾。使用兩種細(xì)胞型a)分泌乙型肝炎病毒的2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)和b)HepG2細(xì)胞(ATCCCat#HB-8065)。每個(gè)分析使用1比50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行72小時(shí)。所有其它過程都按Dong等，Proc Natl AcadSci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。使用三個(gè)批的分析結(jié)果列于表3中?；谶@些數(shù)據(jù)，由于臺(tái)灣產(chǎn)地的低毒性再加上它的減少超過一半的HbsAG的分泌(其與病毒釋放成比例)，所以將選定臺(tái)灣產(chǎn)地的作為標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物。
表3.小柴胡湯
表2和表3中給出的臺(tái)灣草藥組合物的數(shù)據(jù)組成了這一草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化NBR陣列的原始數(shù)據(jù)。因此，最初這一數(shù)據(jù)集將包括草藥組合物的來源、植物的種和每種草藥組合物的相對量、和兩種生物反應(yīng)(即，細(xì)胞生長抑制和從感染細(xì)胞中分泌乙型肝炎病毒)。
使用在圖1的圖解中和在實(shí)施例1和3中闡明的過程，收集標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物的關(guān)于植物相關(guān)的數(shù)據(jù)、標(biāo)記和生物反應(yīng)的附加的數(shù)據(jù)。將這一額外數(shù)據(jù)加入原始的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列中以產(chǎn)生可擴(kuò)充的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。為了確定與目的生物反應(yīng)高度相關(guān)或相聯(lián)系的變量的子集，可按在詳述和實(shí)施例中所闡明的那樣對獲得的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治觥？梢允褂迷趫D2中和在實(shí)施例2和4的步驟中所描述的方法來確定批HBR陣列。
獲得的批HBR陣列可以與標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列比較來預(yù)測批草藥組合物的生物反應(yīng)。
實(shí)施例12.草藥制備。
標(biāo)準(zhǔn)化的草藥提取物制備的方案如下將具有適當(dāng)比例的草藥原料的成分放入有夾套的反應(yīng)器中并且使用攪拌在提高的恒定溫度下用水提取。用120目的篩子將固體從液體中分離。收集獲得的濾液，然后通過減壓蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。濃縮的溶液在提高的溫度下噴霧干燥以產(chǎn)生顆粒狀粉末。然后將這一體積的物質(zhì)配制成想要的劑型。
實(shí)施例13.評價(jià)黃芩湯黃芩湯(HQT)是一種古代中國植物性藥材配方，其包括四種不同的草藥Scutellariae(黃芩)，Glycyrrhizae(甘草)，Paeonielactiflora pallus(白芍)，和Fructus zizipho(大棗)。(表4)。自公元300年以來這一草藥處方在亞洲已經(jīng)使用了很長時(shí)間用來治療各種胃腸疾病。
表4.TCM處方HQT的草藥成分
生物和酶分析表5.批屬性(HQT)
扼要地，取每一批黃芩湯(HQT)1克加入到10ml水中(1mg/ml)。象在表5中扼要地描述的那樣處理混合物。離心后收集上清液并且通過0.22μm的濾器過濾。使用了兩種類型的細(xì)胞來測試每一批HQT的生物學(xué)效應(yīng)a)Jurkat T細(xì)胞(ATCC cat#TIB-152)和b)HepG2細(xì)胞(ATCC cat#HB-8065)。每個(gè)分析都是用1∶50的稀釋度。在37℃的水浴中迅速融化冷凍的細(xì)胞(107個(gè)/ml)。接著細(xì)胞用10ml的預(yù)暖的介質(zhì)稀釋(見生命技術(shù)公司(Life Technologies Inc)，目錄和索引指南，1998-1999，細(xì)胞培養(yǎng)部分)緊接著1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。然后舍棄上清液并將細(xì)胞培養(yǎng)在100ml的37℃、5％CO2的介質(zhì)中。兩天后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(大約8×105個(gè)細(xì)胞/ml。總共100ml)。
按照通過DNA進(jìn)行定量檢測同樣地也評價(jià)了批的抑制乙型肝炎病毒的能力(見Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499)。扼要地，將1克制品加入到10ml水中。煮沸混合物30分鐘。在離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。在這一分析中使用了分泌B型肝炎病毒顆粒的2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行了72小時(shí)。所有其它過程都如Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。
由于HQT已知具有抗腹瀉的特性因而進(jìn)行了β-葡萄糖醛酸酶的分析。將不同的HQT提取物加入到三層壁的96孔板中，其含有終體積為80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸鹽、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析過的β-葡萄糖醛酸酶(產(chǎn)自大腸桿菌，購于SigmaTM)。37℃孵育2小時(shí)后，反應(yīng)用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的終止液終止，并且用活動(dòng)的微板閱讀器在540nm下監(jiān)控OD值。
三個(gè)批的分析結(jié)果列于表6中?；谶@些數(shù)據(jù)，HQT來源的A和B具有相對低的毒性和相對于批HQTC的較高的抑制活性(即，對HepG2細(xì)胞的大約5倍大的毒性和比HQTA或者B少3.3倍的抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，見表6)。
表6.三種HQT制品的生物學(xué)分析*大腸桿菌HepG2 JurkatHBVβ-葡萄糖醛酸酶 DNAHQT A0.6 1.500.76 NoneHQT B0.7 1.6 0.81 NDHQT C2.2 0.32ND ND*值代表IC50值 對照的％ND，沒有檢測評價(jià)HQT對蛋白質(zhì)表達(dá)的作用在加藥前24小時(shí)將HepG2細(xì)胞(1×106)接種于含有3.0ml的RPMI-1640培養(yǎng)基的25cm2的瓶中(見生命技術(shù)公司(LifeTechnologies Inc)，目錄和索引指南，1998-1999，細(xì)胞培養(yǎng)部分)。細(xì)胞用或者不用草藥藥物處理，其中前者分別以0.2mg/ml或者4mg/ml的兩種終濃度加入，并且37℃孵育24小時(shí)。移去培養(yǎng)基并且用冷PBS洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞收集到1ml的PBS中并且在10,000轉(zhuǎn)離心2分鐘，在三次凍融循環(huán)后用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩沖液在冰上提取。在離心前將氯化鉀以0.15M的終濃度加入到細(xì)胞裂解液中。確定蛋白質(zhì)的濃度并且按照Laemmli的方法(自然(Nature)(1970)227680-685)將細(xì)胞提取物進(jìn)行電泳。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Western印跡，例如見Sambrook，等(1989)。使用的抗體對應(yīng)于下列蛋白質(zhì)Topo I；Stat(20707)；Cyclin B1；MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
圖4表明較高濃度的HQTA或HQT B有差別地影響Cycl in B1多肽的表達(dá)。
HPLC分析用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)的HPLC來分析草藥的批并且用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)來檢測。紫外檢測監(jiān)控的波長是280nm和340nm。用泵以1ml/min輸送流動(dòng)相并且流動(dòng)相含有溶劑A水和溶劑B20％甲醇的如下梯度1)最初的5分鐘溶劑為100％的溶劑A；2)在接下來的10分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)在下個(gè)40分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B。之后加100％的溶劑A 5分鐘。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)品是黃芩甙和黃芩甙元。
質(zhì)譜使用購自PE生物系統(tǒng)公司的MarinerTMESI-TOF質(zhì)譜(MS)分析草藥提取物。使用兩種已知的的HQT中的活性成分黃芩甙元和黃芩甙來產(chǎn)生對照示蹤。
通過HPLC和質(zhì)譜分析了用水和用酸處理過的批HQT樣品。水處理的HQT批A和B具有明顯不同的HPLC和MS示蹤，而酸處理的批具有幾乎完全相同的模式(數(shù)據(jù)沒有給出)。
算法被收集的數(shù)據(jù)形成了用于產(chǎn)生多元正態(tài)分布集的多維分析的一部分，其作為確定在生物學(xué)活性和標(biāo)準(zhǔn)HQT化學(xué)制劑(HPLC和質(zhì)譜)，和產(chǎn)地/生長之間基線相關(guān)性的手段。
實(shí)施例14.單個(gè)成分A.甘草。
評價(jià)Glycyrrhizae Radix(甘草)甘草用于潤肺和鎮(zhèn)咳，幫助緩解痙攣和疼痛。在這一實(shí)施例中所使用的甘草批的特性由表7給出。
表7.批性質(zhì)(甘草)
生物學(xué)和酶分析為了分析草藥來源的質(zhì)量，分析了每一種草藥提取物的上清液并且將分析重復(fù)了三次。對于一個(gè)給定的要被分析的樣品，將1克草藥粉末溶于10ml的80℃的在聚丙烯管中的去離子水中(自然pH)。然后將管如表7中扼要描述的那樣孵育，接著離心以獲得上清液。用或者是HepG2細(xì)胞(ATCCcat#HB-8065)或者是Jurkat T細(xì)胞(ATCCcat #TIB-152)或者是兩者都用來測試甘草的批。細(xì)胞如上所述培養(yǎng)24小時(shí)。
同樣地按照通過DNA定量來檢測的那樣評價(jià)了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(見Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499)。扼要地，將1克制品加入到10ml水中。煮沸混合物30分鐘。在離心后收集上清液并通過0.22μM的濾器過濾。在這一分析中使用了分泌乙型肝炎病毒顆粒的2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行了72小時(shí)。所有其它過程都如Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。
再一次分析了β-葡萄糖醛酸酶。將不同的甘草提取物加入到三層壁的96孔板中，其含有終體積為80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸鹽、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析過的β-葡萄糖醛酸酶(產(chǎn)自大腸桿菌，購于Sigma)，如上所述進(jìn)行分析。
使用兩個(gè)批的分析結(jié)果列于表8中。以這些數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，甘草批A比批B對于Jurkat細(xì)胞具有更大的毒性(大約9倍)并且是β-葡萄糖醛酸酶更有效的抑制劑(見表8)表8.四種甘草制劑的生物學(xué)分析*大腸桿菌 HepG2Jurkat HBVβ-葡萄糖醛酸酶DNA甘草A1.1 1.07 0.41None甘草BNDND 3.6 ND甘草C2.1 ND ND ND甘草DNDND ＞2.0 53.8*值代表IC50值 ，對照的％。ND，沒有檢測表達(dá)分析為了分析基因表達(dá)，用草藥提取物處理了Jurkat T細(xì)胞如下在37℃的水浴中迅速融化JurkatT細(xì)胞(107個(gè)/ml)。接著細(xì)胞用10ml的預(yù)暖的介質(zhì)稀釋(見生命技術(shù)公司(Life TechnologiesInc)，目錄和索引指南，1998-1999，細(xì)胞培養(yǎng)部分)，緊接著1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。然后舍棄上清液并將細(xì)胞培養(yǎng)在100ml的37℃、5％CO2的介質(zhì)中。兩天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞(大約8×105個(gè)細(xì)胞/ml?？偣?00ml)。
如上面扼要描述的那樣(例如，2g草藥粉末獲得20ml的無菌溶液(0.1g/ml))制備草藥提取物溶液。將細(xì)胞以2.5×105個(gè)/ml的密度分成三瓶，100ml每瓶。將對照(沒有提取物)，和10mg/ml的10ml的提取物，和1mg/ml的10ml提取物進(jìn)行分析。再一次地，使用毒性結(jié)果來確定任一給定的提取物的“高”和“低”濃度。加入提取物之后，在上述條件下孵育細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)。將細(xì)胞計(jì)數(shù)并隨后收集于50ml的離心管中。獲得的細(xì)胞沉淀用RNA分離方法處理來提取mRNA(例如，見，Sambrook等，1989在7.3-7.39頁)。
微陣列微陣列印跡按如下內(nèi)容進(jìn)行通過研究遺傳學(xué)(Huntsville，從)從IMAGE聯(lián)合文庫獲得基因克隆并且包括來自多種組織的基因。大部分克隆已經(jīng)被部分地測序，并且作為形成GeneBank的dbEst數(shù)據(jù)庫的可表達(dá)序列標(biāo)志是通用的。分別培養(yǎng)包括pBluescript質(zhì)粒的克隆并且在施用到尼龍膜上之前使用可購買得到的引物擴(kuò)增(Chen等，基因組學(xué)(Genomics)(1998)51313-324)。使用PC(個(gè)人電腦)控制的陣列系統(tǒng)施用大約10ng的每一種擴(kuò)增的目的物到帶正電荷的尼龍膜上。使用24-pin的陣列工具可在35mm×55mm大小的尼龍膜上粗略地安放85,000個(gè)點(diǎn)。
cDNA探針和膜雜交使用隨機(jī)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄用生物素和/或地高辛標(biāo)記1μg的每一種mRNA樣品(mRNA如上所述被分離)。被標(biāo)記的樣品用堿處理并且在獲得的標(biāo)記核酸用于雜交前將其沉淀。如Chen等(1998)所發(fā)表的那樣使用標(biāo)記的探針進(jìn)行膜雜交并漂洗。為了用雙色模式(即，既有生物素又有地高辛)來檢測膜上的點(diǎn)，應(yīng)用了β-半乳糖苷酶偶合的抗生蛋白鏈菌素(strept-Gal)和堿性磷酸酶偶合的地高辛抗體(anti-Dig-AP)。在顯色后，使用成像工具進(jìn)行圖像的數(shù)字轉(zhuǎn)換(例如，扁平床掃描儀或數(shù)碼相機(jī))。使用可測量每個(gè)點(diǎn)的原色成分的綜合密度，進(jìn)行綜合密度數(shù)據(jù)回歸分析和定位作為有差別地表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)異常值的一種程序，由計(jì)算機(jī)分析確定定量的測量結(jié)果。
樣品1、2和甘草(ST117)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)通過下列方法將分別對應(yīng)于冬蟲夏草、茯苓(ST027)和甘草提取物的提取物1、2和6進(jìn)行分析使用Jurkat T細(xì)胞評價(jià)批的毒性。
按在實(shí)施例6中所述制備提取物。通過加1ml密度為5×105個(gè)/ml的Jurkat細(xì)胞把細(xì)胞分到24孔培養(yǎng)板上。用對照(沒有提取物)，和上述的5種濃度的提取物(見表9)來進(jìn)行分析。用于細(xì)胞培養(yǎng)分析的高和低濃度依據(jù)提取物對細(xì)胞的毒性在10mg/ml和0.05mg/ml之間變化(即，每毫升草藥提取物的毫克干重)。對于某種樣品在10mg/ml的毒性較高那么就將“高”和“低”濃度下調(diào)。然而，在最大和最小值之間至少要維持一個(gè)階數(shù)的數(shù)量。例如，對于甘草(ST117)“高”是0.5mg/ml和“低”是0.05mg/ml(見表9)。在加入提取物之后，細(xì)胞培養(yǎng)物在如實(shí)施例中所述的條件下孵育24小時(shí)。將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并且將獲得的數(shù)據(jù)列表以表明提取物的毒性。獲得的數(shù)據(jù)列于表9中。
表9.在不同濃度的草藥提取物溶液下存活的細(xì)胞數(shù)
注意起始細(xì)胞數(shù)是5×105個(gè)/ml并且在24小時(shí)孵育后數(shù)目達(dá)到10×105個(gè)/ml?！?”描述所有死細(xì)胞。方法1.加入1ml 5×105個(gè)/ml的Jurkat細(xì)胞到24孔培養(yǎng)板上。2.制備12種草藥提取物溶液并滅菌。3.每個(gè)樣品測試5種濃度。10mg/ml、5mg/ml、2 mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml4.在37℃下具有5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。
在每一個(gè)分析中，分析了144×96個(gè)基因(即，13，824個(gè)基因)(數(shù)據(jù)沒有給出)并且約有100個(gè)基因與對照的基因相比顯示了明顯的不同(表10)。這些基因中的一部分被上調(diào)了而其他的被下調(diào)了。與對照差別的大小有時(shí)依賴于施用到特定細(xì)胞上的草藥組合物的相對量。在C1(對照處理)和H或L(草藥)下的數(shù)字代表減去背景之后的mRNA表達(dá)的強(qiáng)度(表10)。在陣列AD中基因名稱被編碼，其可以追溯到特定的GeneBank的克隆。通過由C劃分的H或L來確定表達(dá)水平。在每一種草藥處理的樣品中，13，828個(gè)基因中只有一部分顯示了明顯的改變，即，上調(diào)、下調(diào)或未改變(見表10)。
表10標(biāo)記 相對于未處理的細(xì)胞(CI)K，L，M，N，O，P欄表示1，2，6號(hào)草藥處理的mRNA表達(dá)水平的比例(H，L指高濃度和低濃度)標(biāo)題 Cl 1H 1L 2h 2L 6H 6L 1H1L 2h 2L6H6LAmayAD 類轉(zhuǎn)導(dǎo)素增強(qiáng)子蛋白I Sg-Bk Sg-Bk Sg-BkSg-BkSg-BkSg-BkSg-Bk COMPARE TOCONTROL CloneID<94，030>腺苔酸琥珀酸裂合酶55.29 8.557.15 46.7438.0729.2130.82 0.154639 0.129318 0.845361 0.688551 0.528305 0.557424 504540<91，097>神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶，受體，I型89.55 98.29 70.2684.8393.8336.0289.63 1.097599 0.78459 0.947292 1.047795 0.402233 1.000893 1013392<89，083>主要組織相容性復(fù)合體I類蛋白質(zhì)HLA-A(HLA28，-B40，Cw3) 80.68 61.91 46.1359.8629.6446.1632.35 0.767353 0.571765 0.741943 0.367377 0.572137 0.400967 510048<87，83> 85.33 50.96 37.7553.2525.5437.5 49.82 0.597211 0.44240.624048 0.299309 0.43947 0.583851 1188706<86，131>高度類似于螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì) 99.48 109.46 105.62 56.6867.5435.6575.78 1.100322 1.061721 0.569763 0.67893 0.358363 0.761761 72215<85，129>整合膜蛋白E1690.64 72.12 92.7537.9770.0848.4759.36 0.795675 1.023279 0.41891 0.773169 0.534753 0.654898 118588<85，112> 35.23 60.82 48.8744.0429.7128.2559.33 1.72637 1.38717 1.250071 0.843315 0.801873 1.684076 115134<84，075> 89.56 77.54 77.9 66.1 59.4443.3742.97 0.865788 0.869808 0.738053 0.663689 0.484256 0.47979 172767<83，129> 118.83 108.15 118.05 75.8464.0955.8 66.27 0.910124 0.993436 0.638223 0.539342 0.469578 0.557687 1184183<82，082>人雄性激素受體相關(guān)蛋白 60.23 47.87 34.9637.419.84 44.8 46.5 0.794787 0.580442 0.621119 0.163374 0.743815 0.772041 118235<82，027> 65.11 90.01 66.7466.3 64.4439.3 78.37 1.38243 1.025035 1.018277 0.98971 0.603594 1.203655 171864<80，129> 96.27 99.96 109.381.8887.6648.3253.87 1.03833 1.135348 0.850525 0.910564 0.501922 0.559572 1172135<80，035>人小GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab7mRNA，完全的cds 44.91 46.23 23.1978.2140.7537.4842.49 1.029392 0.56091.741483 0.90737 0.834558 0.946114 1172266<74，108> 65.277.25 64.0960.2 66.2151.5270.19 1.184816 1.044325 0.923313 1.015691 0.790184 1.076534 37502<74，012> 34.68 60.92 57.7324.6148.9342.3465.02 1.756632 1.664648 0.709631 1.41091.220877 1.874856 45672<73，132>KIAA0078基因的人mRNA，完全的cds 109.86 103.38 82.3585.9769.1561.9132.44 0.941016 0.74959 0.782541 0.629437 0.563535 0.295285 79342<72，101>人高爾基體外測p230mRNA，完整的cds46.96 25.76 18.3510.5417.871.27 17.51 0.548552 0.390758 0.224446 0.380537 0.027044 0.372871 563992<72，014>Chlordecone reductase4.3715.08 13.3142.8722.7620.6430.11 3.450801 3.045767 9.0810069 5.208238 4.723112 6.89016 21759<70，101> 60.86 13.55 35.2333.3940.6516.3618.7 0.222642 0.57887 0.548636 0.667926 0.268814 0.307263 564469<69，107> 37.92 31.41 26.1282.8228.6436.9550.55 0.828323 0.688819 2.184072 0.755274 0.97442 1.33307 29009<68，064>KIAA0034基因的人mRNA，完全的cds 2.241.275.31 0.21 2.5 4.2 41.64 0.566964 2.370536 0.09375 1.116071 1.875 18.58929 51927<62，117> 106.71 94.67 83.9881.3961.4577 41.8 0.887171 0.786993 0.762721 0.57586 0.721582 0.391716 241351<62，084>NA 1.130 013.550.58 32.8117.71 0 0 11.99115 0.513274 29.0354 15.67257 28012<62，001>不均一核核糖體蛋白A1 97.11 71.92 73.1642.0178.9483.9496.87 0.740603 0.753372 0.432602 0.812893 0.864381 0.997529 236388<61，118>NA 89.52 59.97 54.1166.8643.0565.6534.92 0.669906 0.604446 0.746872 0.480898 0.733356 0.39008 240018<59，142>ATP酶，Na＋/K＋轉(zhuǎn)運(yùn)，αI多肽 13.03 15.48 47.7527.7127.8623.2216.58 1.188028 3.66462 2.126631 2.138143 1.782041 1.272448 121270<59，135> 60.85 90.23 39.8393.0138.1786.3931.2 1.482827 0.65456 1.528513 0.62728 1.419721 0.512736 510863<58，087>EsTs，很少與KIAA0063類似[人] 77.72 46.86 76.3364.4322.5256.7863.4 0.602934 0.982115 0.8229002 0.289758 0.730571 0.815749 645239<57，016>成纖維細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同系物 71.71 16.47 44.6139.5166.8950.4335.52 0.229675 0.622089 0.550969 0.932785 0.703249 0.495328 47526<56，088>3-羥基-3-甲基戊二酰基-輔酶A 56.77 52.66 59.5359.6 16.8972.8760.28 0.927603 1.048617 1.04985 0.297516 1.28361.061828 509520<56，060>翻譯延伸因子1-α-1 81.26 92.28 92.0836.8679.0971.7470.47 1.135614 1.133153 0.453606 0.973296 0.882845 0.867216 31027<55，040> 0 43.58 39.4753.6746.4240 65.93 328351<54，134>碳酸酐酶III 0 0 4.38 43.478.23 32.619.74 287006<53，048>人干擾素調(diào)節(jié)因子3mRNA0.250 033.47000.53 0 0 133.880 0 2.12 116915<53，023>人蛋白酶前體亞單位HsC7-1mRNA 67.76 14.98 42.3338.4866.5227.2437.24 0.221074 0.624705 0.567887 0.98170.402007 0.549587 221285<52，135> 49.26 46.81 44.4 72.9555.5 63.2130.35 0.950264 0.90134 1.480918 1.126675 1.283191 0.616119 286222<51，131>ATP檸檬酸裂合酶 2.020 52.0639.336.03 22.365.60 25.77228 19.4703 2.985149 11.06931 2.772277 624420<51，101>多聚腺苷酸結(jié)合蛋白 8.650.170.45 38.9914.3138.2511.64 0.019653 0.052023 4.507514 1.654335 4.421965 1.345665 529138
表10(續(xù))<50，035>血清白蛋白前體 0.88 0 10.21 44.140 0.79 0.010 11.60227 50.15909 0 0.897727 0.011364510245<47，055>ESTs 38.53 31.69 19.45 43.8 56.159.36 53.20.832476 0.504801 1.136777 1.456008 1.540618 1.380742 26801<46，099> 34.26 35.69 32.49 39.8163.19 30.86 51.76 1.049329 0.948336 1.161996 1.844425 0.900759 1.5108 511591<45，100>核糖體蛋白L5 26.15 33.6 26.355.8648.59 31.26 43.29 1.284895 1.005736 2.136138 1.858126 1.195411 1.655449511410<44，103>NA 72.01 54.36 70.27 75.4391.53 70.5 80.86 0.754895 0.975837 1.047493 1.271073 0.979031 1.1229 26099<43，039> 55.86 18.02 20.83 11.6817.811.82 41.06 0.322592 0.372897 0.209084 0.318654 0.2116 0.735052592919<43，035>14-3-3PROTEIN TAU86.86 23.18 36.23 18.1412.76 12.99 42.28 0.266866 0.417108 0.208842 0.146903 0.149551 0.48676 120011<43，019> 72.48 10.4 23.38 27.5912.83 3.47 15.99 0.143588 0.322572 0.380657 0.177014 0.047875 0.220613488154<42，099> 30.25 33.73 36.83 61 51.56 40.36 48.43 1.115041 1.217521 2.016529 1.704463 1.334515 1.60099286102<40，100>ESTs 0 0 0.2 38.3712.78 2.59 7.47 84335<39，118>硫氧還蛋白 4.26 0.34 2.8337.288.032.25 9.670.079812 0.664319 8.751174 1.884977 05281669 2.269953123764<39，007>前-α(球蛋白)抑制劑H3多肽 9.46 24.06 15.82 26.0825.48 22.8 44.36 2.543341.672304 2.756871 2.693446 2.410148 4.68921823643<38，097>NA 11.81 6.94 23.82 80.1416.65 6.13 18.51 0.587638 2.016935 6.785775 1.409822 0.519052 1.56731681665<38，081>人GP36b糖蛋白mRNA101.51 82.61 89.86 22.8871.489.93 79.82 0.813811 0.885233 0.225397 0.703379 0.885923 0.7863261185901<35，096> 47.35 24.52 0 23.2 32.88 37.19 35.29 0.517846 0 0.489968 0.694403 0.785428 0.745301723779<34，143> 61.23 2.99 25.05 30.6116.93 27.03 40.40.048832 0.409113 0.499918 0.276498 0.441450.659807712549<32，118>ESTs，較弱地相似于酪蛋白激酶同系物 21.98 8.91 14.11 53.5424.01 17.46 22.99 0.405369 0.641947 2.435851 1.092357 0.794359 1.045951265480<32，034>Pyruvate kinase，musele 78.41 54.15 79.36 29.5640.528.52 61.59 0.690601 1.012116 0.376993 0.516516 0.363729 0.7854871170289<30，102>丙酮酸激酶，肌肉 27.3 23.1 16.06 62.3534.39 16.52 47.49 0.846154 0.588278 2.283883 1.259707 0.605128 1.73956 612365<30，033> 70.49 30.32 65.13 17.1833.65 49.07 36.52 0.430132 0.923961 0.243723 0.477373 0.696127 0.51808882236<29，058>NA 25.77 16.66 0 59.8533.24 27.05 18.54 0.646488 0 2.322468 1.289872 1.049670.71944138798<29，035> 60.19 57.12 86.66 46.4756.59 61.01 58.47 0.948995 1.439774 0.772055 0.940189 1.013624 0.97142481491<28，104>核糖體蛋白S13 0 0 0 37.191.370 5.97 595769<28，035> 71.46 35.93 51.86 11.2730.75 40.12 36.54 0.502799 0.725721 0.157711 0.430311 0.561433 0.511335994662<27，119> 0 0 0 48.271.660 1.1114662<27，097>EsTs,與Etr-3[人]中等相似 16.06 24.53 9.2676.0124.34 24.16 30.01 1.527397 0.576588 4.732877 1.515567 1.504359 1.86861868744<25，126>ESTs 42.93 22.03 29.88 67.7640.39 24.86 30.53 0.513161 0.696017 1.578383 0.940834 0.579082 0.711158427843<25，106> 61.9 48.38 43.41 91.2658.89 39.88 51.83 0.781583 0.701292 1.474313 0.951373 0.644265 0.83731842714<24，098>人剪接體蛋白(SAP 61)mRNA，完整的c 24.26 25.43 21.856.1837.28 30.59 46.77 1.048228 0.898599 2.315746 1.536686 1.260923 1.927865274769<24，071>熱體克70KD蛋白I 63.92 58.19 61.150.8666.27 80.57 68.86 0.910357 0.955882 0.795682 1.036765 1.260482 1.077284255134<23，126>5.18 1.110.08 54.7112.11 2.9 10.53 0.212355 1.945946 10.56178 2.337838 0.559846 2.032819416946<23，099>核糖體蛋白S3A 5.13 1.93 1.2538.9914.35 4.51 18.73 0.376218 0.243665 7.600392.797271 0.879142 3.651072298187<22，013>真核啟動(dòng)因子4B 61.8 49.95 41.52 22.9949.11 42.7 20.04 0.808252 0.671845 0.372006 0.794660.690939 0.32427251894<22，006>3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A 83.17 57.84 39.840.0444.33 46.33 35.49 0.695443 0.478538 0.481424 0.533005 0.557052 0.426716563866<20，126>線粒體應(yīng)激-70蛋白質(zhì)前體 27.02 22.19 33.86 56.8732.97 27.24 33.86 0.821244 1.253146 2.104737 1.220207 1.008142 1.253146382766<20，104>人真核翻譯起始因子(eIF3)mR 22.09 15.17 15.17 74.9819.17 8.3 35.84 0.686736 0.783518 3.394296 0.867813 0.375736 1.622454562992<20，103>層粘連蛋白受體(2H5抗原決定基) 1.45 1.26 0 39.668.7 0.73 9.030.868966 0 27.35172 5.979310.503448 6.227586562928<19，098>人精球蛋白(CD100)mRNA，完整的cds 17.79 14.38 10.79 52.9428.97 12.5 31.25 0.808319 0.606521 2.975829 1.628443 0.702642 1.756605248687<18，103>核糖體蛋白L5 31.47 21.13 30.07 78.6 27.18 27.47 43.29 06714330.955513 2.497617 0.863680.872895 1.375596549382<18，084>ESTs 54.61 75.17 46.16 79.5 60.01 74.37 56.43 1.376488 0.845266 1.455777 1.098883 1.361838 1.033327512336<17，103>NA 0 0 0 33.962.873.64 9.87 549224
表10(續(xù))<17，097>NA 1.52 2.1 1.21 37.7711.593.4314.35 1.381579 0.79605324.84868 7.625 2.2565799.440789 327474<17，062> 92.7273.27103.64 69.7969.3568.85 83.14 0.790229 1.1177740.752696 0.747951 0.7425580.896678 50753<16，103>整合蛋白β-(纖連蛋白受體, β多肽 00.92 041.3 1.84 6.6711.18 547624<16，100>人E1B19k/Bc1-2-結(jié)合蛋白Nip3 mRNA0.79 00.7 38.068.28 0.8916.63 0 0.88607648.17722 10.48101 1.12658221.05063 308754<15，112> 16.4711.6511.8746.5222.9828.22 22.43 0.707347 0.7207042.824529 1.395264 1.7134181.3618749967<14，103>NA 27.6134.2630.1855.6738.4535.52 50.43 1.240855 1.0930822.016298 1.392611 1.28649 1.826512 546545<14，011>NA 47.4234.8768.2838.7153.6 50.03 52.24 0.735344 1.4398990.816322 1.130325 1.05504 1.101645 32672<13，114>人克隆24689mRNA序列 20.6413.8719.2 51.2632.3420.27 27.70.671996 0.9302332.483527 1.56686 0.9820741.342054 144001<12，144>人NADH輔酶Q氧化還原酶 76.7867.2 76.1164.5 50.0453.76.920.875228 0.9912740.840063 0.651732 0.6994010.090128 325580<12，111> 40.0455.0446.3477.7846.0769.51 55.69 1.374625 1.1573431.942557 1.150599 1.7360141.390859 49373<11，135> 90.34114.29 87.8880.4987.2260.79 87.28 1.265110.97277 0.890967 0.965464 0.6729020.966128 510620<11，105>核糖體蛋白L3 8.27 14.4115.5936.8225.8731.97 47.11.742443 1.8851274.452237 3.128174 3.86578 5.695284 31866<11，053>[雷]鈣蛋白酶，大多肽L2 10.4823.5814.8 15.698.87 47.63 28.91 2.25 1.4122141.497137 0.846374 4.5448472.758588 544957<10，136>蘋果酸酶2，線粒體 74.3481.6390.9483.1874.8554.35 65.41 1.098063 1.2232981.118913 1.00686 0.311 0.879876 510323<10，101>ESTs 13.6516.3413.9747.5726.6836.05 40.14 1.197071.0234433.484982 1.954579 2.6410262.940659 613442<09，136>NA 59.8295 87.1677.3423.5169.24 71.68 1.588098 1.4570381.292879 1.396021 1.1574721.198261 509836<09，110>ERLUMEN PROTEIN RETAINTNG RECEPTOR I 17.3 41.7348.9255.3235.5645.73 60.03 2.412139 2.8277463.197688 2.055491 2.6433533.469942 47800<09，085>人磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA，完全的cd 80.1488.8396.2280.4 77.4476.05 82.81 1.108435 1.2006491.003244 0.966309 0.9489641.033317 613511<08，138> 41.5760.4 69.5373.2781.2659.49 66.73 1.452971 1.6726 1.762569 1.954775 1.43108 1.605244 632480<08，132> 67.22102.84 103.65 90.5688.4376.85 81.15 1.529902 1.5419521.347218 1.315531 1.1432611.2072366427<08，122>人DRAK1，mRNA，完全的cds 32.0123.2147.7463.0235.6432.48 46.85 0.725086 1.4914091.968761.113402 1.0146831.463605 308580<08，105> 69.5858.7 84.4990.5 68.9189.98 94.96 0.843633 1.2142861.300661 0.990371 1.2931881.3647630607<08，055> 19.5 20.0122.8327.8734.6648.86 50.43 1.026154 1.1707691.429231 1.777436 2.5056412.586154 611114<07，111> 30.8 44.6748.7573.8451.3159.76 68.29 1.450325 1.5827922.397403 1.665909 1.94026 2.217208 46880<07，107>ESTs 4.57 3.23 9.01 41.328.83 22.923.56 0.706783 1.9715549.041575 1.932166 5.0109415.155361 29970<06，135> 71.42112. 68 128.81 102.8101.48 93.72 94.21.577709 1.8035561.439373 1.420891 1.3122371.318958 286790<06，102>ESTs 39.8236.0332.5767.7446.0459.07 57.13 0.904822 0.8179311.701155 1.156203 1.4834251.434706 530700<06，101>細(xì)胞間粘附分子24.43 2.95 4.21 38.9516.6 15.85 3.590.665914 0.9503398.792325 3.747178 3.5778787.356659 530665<06，034>核糖體蛋白L5 000033.930 0 666094<06，006>人脆性X精神發(fā)育遲緩綜合癥相關(guān)蛋白 031.710000 0 530672<04，134> 39.0354.6246.6171.8 58.8264.83 64.43 1.399436 1.19421 1.839611 1.507046 1.66103 1.650781 285979<04，134>鐵蛋白，輕的多肽 15.7423.8121.9446.7421.9456.63 55.12 1.512706 1.3939012.969504 1.393901 3.59784 3.501906 31309<03，140> 56.0888.3361.2993.1 74.0474.42 81.16 1.575071 1.0929031.660128 1.320257 1.3270331.447218 624595<03，099>ESTs 22.9718.5712.1 52.8323.4853.26 41.55 0.808446 0.5267742.299956 1.022203 2.3186771.808881 42281<02，111>ESTs，與64.5KD蛋白質(zhì)高度相似 34.8923.6325 77.4128.8456.660.36 0.677271 0.7165382.218687 0.826598 1.6222411.730009 45327<01，136>用于5-aminoimidazole-4-carboxami的人mRNA 21.3634.8423.9553.1445.6640.67 51.53 1.631086 1.1212552.487828 2.13764 1.9040262.412453 567287<01，058>乙酰輔酶A脫氫酶，C4-C12直鏈 60.6853.3573.2662.5656.5872.81 91.71 0.879202 1.2073171.030982 0.932432 1.1999011.511371 30921總共116
以這種方式，我們能夠把特定的基因表達(dá)和給細(xì)胞施用的無、低(L)或高(H)量的草藥組合物聯(lián)系起來。在這一方法中鑒定的許多基因編碼在已知的新陳代謝和生物化學(xué)途徑中的重要的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中的許多對于某種生理學(xué)的、形態(tài)學(xué)的和心理學(xué)的參數(shù)具有直接的和間接的作用。因此，這一方法使草藥組合物的特定遺傳的指紋與它的陣列生物學(xué)效應(yīng)相聯(lián)系成為可能。這樣的聯(lián)系能被用于描繪草藥組合物的輪廓和特性以便達(dá)到質(zhì)量控制、質(zhì)量保證和評價(jià)藥理學(xué)或毒理學(xué)性質(zhì)的目的。在草藥配方中主要的和輔助的草藥的作用也同樣可以用這一方法評定。
HPLC分析用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)的HPLC來分析草藥的批并且用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)來檢測。紫外檢測監(jiān)控的波長是280nm和340nm。用泵以1ml/min輸送流動(dòng)相并且流動(dòng)相含有溶劑A水和溶劑B20％甲醇的如下梯度1)最初的5分鐘溶劑為100％的溶劑A；2)在接下來的10分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)在下個(gè)40分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B。之后加100％的溶劑A 5分鐘。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)品是甘草酸。
算法被收集的數(shù)據(jù)形成了用于產(chǎn)生多元正態(tài)分布集的多維分析的一部分，其作為確定在生物學(xué)活性和標(biāo)準(zhǔn)甘草分子、化學(xué)制劑(HPLC和質(zhì)譜)，和產(chǎn)地/生長之間基線相關(guān)性的手段。
B.黃芩對Radix Scutellariae(黃芩)的評價(jià)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃芩可用于具有減輕毛細(xì)血管滲透性和炎癥，也可以用治療腸炎和痢疾，增加膽汁的分泌來治療黃疸；緩解肌肉痙攣；治療咳嗽和驅(qū)蟲。在這一實(shí)施例中使用的黃芩的批的性質(zhì)列于表11中。
表11.批性質(zhì)(黃芩)
生物學(xué)和酶分析扼要地，將1克的黃芩提取物的每一種制劑加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表11所述處理混合物。離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。用HepG2細(xì)胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T細(xì)胞(ATCC cat#TIB-152)或者是兩者都用來測試黃芩的批。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞如上所述培養(yǎng)24小時(shí)。
同樣地象通過DNA定量來檢測的那樣評價(jià)了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(見Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499)。扼要地，將1克制品加入到10ml水中?；旌衔锶绫?1所述處理。在離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。在這一分析中使用了分泌乙型肝炎病毒顆粒的2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行了72小時(shí)。所有其它過程都如Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。
對于β-葡萄糖醛酸酶，將不同的黃芩提取物加入到三層壁的96孔板中，其含有終體積為80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸鹽、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析過的β-葡萄糖醛酸酶(產(chǎn)自大腸桿菌，購于Sigma)。37℃孵育2小時(shí)后，反應(yīng)用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的終止液終止，并且用活動(dòng)的微板閱讀器在540nm下監(jiān)控OD值。
使用三個(gè)批的分析結(jié)果列于表12中。
表12.四種黃芩制劑的生物學(xué)分析*大腸桿菌 HepG2Jurkat HBVβ-葡萄糖醛酸酶 DNA黃芩A 1.50.33 0.45 None黃芩B 1.8NDND ND黃芩C 0.3NDND ND黃芩D ND 0.65 ND 27.5*值代表IC50值 ，對照的％。ND，沒有檢測評價(jià)黃芩對蛋白質(zhì)表達(dá)的作用在提取物加入前24小時(shí)將HepG2細(xì)胞(1×106)接種于含有3.0ml的RPMI-1640培養(yǎng)基的25cm2的瓶中(見生命技術(shù)公司(LifeTechnologies Inc)，目錄和索引指南，1998-1999，細(xì)胞培養(yǎng)部分)。細(xì)胞用或者不用草藥藥物處理，其中前者分別以0.2mg/ml或者4mg/ml的兩種終濃度加入，并且37℃孵育24小時(shí)。移去培養(yǎng)基并且用冷PBS洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞收集到1ml的PBS中并且在10,000轉(zhuǎn)離心2分鐘，在三次凍融循環(huán)后用含有50mM Tris-Cl(pH 7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩沖液在冰上提取。在離心前將氯化鉀以0.15M的終濃度加入到細(xì)胞裂解液中。確定蛋白質(zhì)的濃度并且按照Laemmli的方法(自然(Nature)(1970)227680-685)將細(xì)胞提取物進(jìn)行電泳。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行了Western印跡，例如見Sambrook，等(1989)。使用的抗體對下列蛋白質(zhì)是特異的TopoI；Stat(20707)；Cyclin B1；MAPK(Ab2)和Nm 23H1。
圖4表明黃芩批A或批B無差別地影響Western印跡解析的多肽的表達(dá)。HPLC分析用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)的HPLC來分析草藥的批并且用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)來檢測。紫外檢測監(jiān)控的波長是280nm和340nm。用泵以1ml/min輸送流動(dòng)相并且流動(dòng)相含有溶劑A水和溶劑B20％甲醇的如下梯度1)最初的5分鐘溶劑為100％的溶劑A；2)在接下來的10分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)在下個(gè)40分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B。之后加100％的溶劑A5分鐘。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)品是黃芩甙和黃芩甙元。
通過HPLC分析了在水中的黃芩的批和酸處理的樣品。水和酸處理的批基本上無差別。算法被收集的數(shù)據(jù)形成了用于產(chǎn)生多元正態(tài)分布集的多維分析的一部分，其作為確定在生物學(xué)活性和標(biāo)準(zhǔn)黃芩化學(xué)制劑(HPLC)，和產(chǎn)地/生長之間基線相關(guān)性的手段。
C.白芍對Paeonie lactiflora pallus radix(芍藥)的評價(jià)芍藥用于抑制和緩解疼痛。其也已知用于松弛韌帶和凈化血液。在這一實(shí)施例中使用的芍藥批的性質(zhì)列于表13中。
表13.批性質(zhì)(芍藥)
生物學(xué)和酶分析扼要地，將1克的芍藥提取物的每一種制劑加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表13所述處理混合物。離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。用HepG2細(xì)胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T細(xì)胞(ATCC cat#TIB-152)或者是兩者都用來測試芍藥的批。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞如上所述培養(yǎng)24小時(shí)。
同樣地象通過DNA定量來檢測的那樣評價(jià)了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(見Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499)。
扼要地，將1克制品加入到10ml水中。混合物如表13所述進(jìn)行處理。在離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。在這一分析中使用了分泌B型肝炎病毒顆粒的2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行了72小時(shí)。所有其它過程都如Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。
將不同的芍藥提取物加入到三層壁的96孔板中，其含有終體積為80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸鹽、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析過的β-葡萄糖醛酸酶(產(chǎn)自大腸桿菌，購于Sigma)。37℃孵育2小時(shí)后，反應(yīng)用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的終止液終止，并且用活動(dòng)的微板閱讀器在540nm下監(jiān)控0D值。結(jié)果列于表14中表14.兩種芍藥制劑的生物學(xué)分析*大腸桿菌HepG2JurkatHBVβ-葡萄糖醛酸酶芍藥A 2.8 ＞1.51.1 None芍藥B ＞2.5 ND NDND*值代表IC50值 ，對照的％。ND，沒有檢測HPLC分析用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)的HPLC來分析草藥的批并且用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)來檢測。紫外檢測監(jiān)控的波長是280nm和340nm。用泵以1ml/min輸送流動(dòng)相并且流動(dòng)相含有溶劑A水和溶劑B20％甲醇的如下梯度1)最初的5分鐘溶劑為100％的溶劑A；2)在接下來的10分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)在下個(gè)40分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B。之后加100％的溶劑A5分鐘。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)品是paeoniflorin。
通過HPLC對芍藥批進(jìn)行的分析如圖5中所示。算法被收集的數(shù)據(jù)形成了用于產(chǎn)生多元正態(tài)分布集的多維分析的一部分，其作為確定在生物學(xué)活性和標(biāo)準(zhǔn)芍藥化學(xué)制劑(HPLC)，和產(chǎn)地/生長之間基線相關(guān)性的手段。
D.大棗對Radix Ziziphi Fructus(大棗)的評價(jià)大棗因其利尿性質(zhì)和扶正作用而已得到使用。在這一實(shí)施例中使用的大棗批的性質(zhì)列于表15中。
表15.批性質(zhì)(大棗)
生物學(xué)和酶分析扼要地，將1克的每一批的大棗提取物加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表15所述處理混合物。離心后收集上清液并通過0.22μM的濾器過濾。用HepG2細(xì)胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T細(xì)胞(ATCC cat#TIB-152)或者是兩者都用來測試大棗的批。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞如上所述培養(yǎng)24小時(shí)。
同樣地象通過DNA定量來檢測的那樣評價(jià)了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(見Dong等，Proc Natl Acad Sci USA(1991)888495-8499)。扼要地，將1克制品加入到10ml水中?；旌衔锶绫?5所述進(jìn)行處理。在離心后收集上清液并通過0.22μm的濾器過濾。在這一分析中使用了分泌B型肝炎病毒顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞(由G.Ace教授友情提供；見Ace等，Proc Natl Acad Sci USA(1987)841005-1009)。每一個(gè)分析都使用了1∶50的稀釋度。細(xì)胞生長抑制分析進(jìn)行了72小時(shí)。所有其它過程都如Dong等，Proc Natl AcadSci USA(1991)888495-8499描述的那樣進(jìn)行。
將不同的芍藥提取物加入到三層壁的96孔板中，其含有終體積為80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸鹽、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析過的β-葡萄糖醛酸酶(產(chǎn)自大腸桿菌，購于Sigma)。37℃孵育2小時(shí)后，反應(yīng)用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的終止液終止，并且用活動(dòng)的微板閱讀器在540nm下監(jiān)控OD值。結(jié)果列于表16中。
表16.三種大棗制劑的生物學(xué)分析*大腸桿菌 HepG2JurkatHBVDNAβ-葡萄糖醛酸酶大棗A 1.2 1.5 5.1 None大棗B ND ＞2.0 ND 52.3大棗C 2.5 NDND ND*值代表IC50值 ，對照的％。ND，沒有檢測HPLC分析用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)的HPLC來分析草藥的批并且用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)來檢測。紫外檢測監(jiān)控的波長是280nm和340nm。用泵以1ml/min輸送流動(dòng)相并且流動(dòng)相含有溶劑A水和溶劑B20％甲醇的如下梯度1)最初的5分鐘溶劑為100％的溶劑A；2)在接下來的10分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)在下個(gè)40分鐘改變?nèi)軇┙M成為10％溶劑A/90％溶劑B。之后加100％的溶劑A5分鐘。HPLC的標(biāo)準(zhǔn)品是白屈菜酸和cAMP。
如圖6所示通過HPLC分析了大棗批樣品。
算法被收集的數(shù)據(jù)形成了用于產(chǎn)生多元正態(tài)分布集的多維分析的一部分，其作為確定在生物學(xué)活性和標(biāo)準(zhǔn)芍藥化學(xué)制劑(HPLC)，和產(chǎn)地/生長特性之間基線相關(guān)性的手段。
因?yàn)樾揎棇Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，因而先前已給出的詳述只是為了理解清楚的目的，并且其中沒有應(yīng)該被理解的非必須的限制。
雖然我們在描述此發(fā)明時(shí)總是與具體的實(shí)施方案聯(lián)系在一起，但是并不是說我們不能對它有進(jìn)一步的改進(jìn)。一般來說，只要遵守此發(fā)明的原理，考慮到此發(fā)明與當(dāng)前已知和慣常的使用間的區(qū)別，我們就可以使之有多種用途，適用于不同變化。同時(shí)，此發(fā)明除了具有先前提及的各種功用，亦可在接下來附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)使用。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)測草藥組合物生物學(xué)活性的方法，包括a)將生物系統(tǒng)暴露于成批的草藥組合物并且測量兩種或多種分子標(biāo)記的差異反應(yīng)，其中差異反應(yīng)測量的集合組成了草藥生物反應(yīng)陣列(HBR陣列)的數(shù)據(jù)集；b)將該批草藥組合物HBR陣列與至少一個(gè)先前獲得的具有至少一種已知生物學(xué)活性的、已知的草藥組合物的HBR陣列進(jìn)行比較；和，c)基于在步驟b)中所作的HBR陣列的比較來預(yù)測該批草藥組合物的生物學(xué)活性。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步地包括對于草藥組合物的另外的一個(gè)或更多個(gè)批次重復(fù)步驟a)直至c)，并且選擇具有期望的生物學(xué)活性的成批的草藥組合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中使用其它的先前獲得的HBR陣列來與步驟b)的HBR陣列進(jìn)行比較。
4.權(quán)利要求1或3的方法，其中標(biāo)記選自分子標(biāo)記、細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記和大分子標(biāo)記。
5.權(quán)利要求1或3的方法，其中先前貯存的HBR陣列是與該批草藥組合物的HBR陣列相同的或基本相似的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。
6.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步地包括調(diào)整或修飾批草藥組合物以產(chǎn)生與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列基本相似的HBR陣列。
7.權(quán)利要求1或3的方法，進(jìn)一步地包括使用HBR陣列的比較結(jié)果來鑒定在批草藥組合物中的保留了已知草藥組合物的期望的生物學(xué)活性特定分子。
8.權(quán)利要求1或3的方法，進(jìn)一步地包括使用HBR陣列的比較結(jié)果來確定哪種已知草藥組合物的草藥成分可以從已知的草藥組合物中排除仍能維持或改善已知草藥組合物的期望的生物學(xué)活性。
9.權(quán)利要求1或3的方法，其中HBR陣列比較的結(jié)果鑒定了一種或多種批草藥組合物先前已知的生物學(xué)活性。
10.權(quán)利要求1或3的方法，進(jìn)一步地包括使用批草藥組合物預(yù)測的生物學(xué)活性來幫助設(shè)計(jì)包括草藥組合物和合成的化學(xué)藥物的治療方法。
11.建立草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的草藥生物反應(yīng)陣列(HBR陣列)的方法，其中該方法包括a)選擇至少具有一種已知生物反應(yīng)的草藥組合物；b)將生物系統(tǒng)暴露于草藥組合物并且選擇兩種或多種標(biāo)記的數(shù)據(jù)；c)貯存步驟(b)的標(biāo)記數(shù)據(jù)作為一個(gè)HBR陣列；d)對使用兩種或多種與在步驟b)中使用的標(biāo)記相同或不同的標(biāo)記的草藥組合物的批重復(fù)步驟b)和c)；e)組合在步驟c)和d)中獲得的HBR陣列；和，f)分析步驟e)組合的HBR陣列以產(chǎn)生草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列，其中標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列具有兩種或多種至少與草藥組合物的一種已知的生物反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)記的數(shù)據(jù)。
12.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步地包括將生物系統(tǒng)暴露于一種或多種草藥組合物，選擇關(guān)于一種或多種生物反應(yīng)的數(shù)據(jù)，和將收集的生物反應(yīng)數(shù)據(jù)加到那個(gè)草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列中。
13.一種評價(jià)草藥組合物的方法，包括a).將生物系統(tǒng)暴露于草藥組合物并且收集兩種或多種標(biāo)記的數(shù)據(jù)；和b).把收集到的標(biāo)記數(shù)據(jù)和與批草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列進(jìn)行比較。
14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步地包括預(yù)測該批草藥組合物的生物反應(yīng)。
15.權(quán)利要求11或13的方法，其中標(biāo)記選自分子的、細(xì)胞遺傳學(xué)的、生物化學(xué)的和大分子的標(biāo)記。
16.權(quán)利要求11或13的方法，其中標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列進(jìn)一步地包括關(guān)于植物相關(guān)數(shù)據(jù)的信息。
17.建立具有已知生物反應(yīng)的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的草藥生物反應(yīng)陣列(HBR陣列)的方法，其中該方法包括a).將生物系統(tǒng)暴露于批草藥組合物并且測量結(jié)果基因表達(dá)的質(zhì)和量的改變以產(chǎn)生那個(gè)批的作為一個(gè)數(shù)據(jù)的HBR陣列；b).使用不同草藥組合物的制劑重復(fù)步驟a)以產(chǎn)生數(shù)據(jù)作為附加的HBR陣列；c).通過分析在步驟a)和b)中獲得的HBR陣列來選擇一套不同的遺傳標(biāo)記以建立草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。
18.評價(jià)草藥組合物的方法包括a).將生物系統(tǒng)暴露于批草藥組合物并且測量結(jié)果基因表達(dá)的質(zhì)和量的改變，來作為那個(gè)批的草藥生物反應(yīng)陣列(HBR陣列)；以及b).比較在步驟a)中獲得的HBR陣列和基本上相等的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化的HBR陣列。
19.權(quán)利要求17和18的方法，其中基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生。
20.權(quán)利要求17和18的方法，其中基因表達(dá)在翻譯水平上發(fā)生。
21.權(quán)利要求1、11、12、13、17或18的方法，其中生物系統(tǒng)選自細(xì)胞、組織、器官、整個(gè)生物體和體外分析。
22.權(quán)利要求11、14和17的方法，其中生物反應(yīng)選自生理學(xué)反應(yīng)、形態(tài)學(xué)反應(yīng)、認(rèn)知反應(yīng)、動(dòng)機(jī)反應(yīng)和自主反應(yīng)。
23.預(yù)測草藥組合物的生物學(xué)活性的系統(tǒng)，包括a.包括一種或多種不同類型的細(xì)胞、組織、器官或體外分析的生物系統(tǒng)；b.批草藥組合物；c.兩種或多種分子標(biāo)記；d.施用批草藥組合物于生物系統(tǒng)和測量分子標(biāo)記差異反應(yīng)的裝置；e.計(jì)算機(jī)處理器，包括存儲(chǔ)器，用于分析和貯存分子標(biāo)記差異反應(yīng)的測量結(jié)果以便產(chǎn)生批草藥組合物的草藥生物反應(yīng)陣列(HBR陣列)的數(shù)據(jù)集；f.計(jì)算機(jī)處理器，包括存儲(chǔ)器，用于比較批草藥組合物的HBR陣列和一種或兩種先前貯存的HBR陣列以便預(yù)測批草藥組合物的生物學(xué)活性，其中用于產(chǎn)生一種或兩種先前貯存的HBR陣列的草藥組合物的生物學(xué)活性是已知的。
全文摘要
本發(fā)明為指導(dǎo)草藥組合物標(biāo)準(zhǔn)化,確定草藥組合物中與任何特定生物活性相應(yīng)的成分,預(yù)測某特定草藥組合物的生物活性,以及開發(fā)改進(jìn)的草藥治療方案提供了必要的工具和方法學(xué)。本發(fā)明提供了創(chuàng)建、維持、改進(jìn)和使用草藥生物反應(yīng)陣列(HBR Arrays)的工具和方法學(xué),其中HBR陣列由與特定草藥組合物相關(guān)的數(shù)據(jù)集組成。本發(fā)明的HBR陣列可包括草藥成分的植物相關(guān)數(shù)據(jù),施用草藥組合物于生物系統(tǒng)后收集的標(biāo)記信息,以及施用草藥組合物于生物系統(tǒng)后收集的生物反應(yīng)信息。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1335892SQ99815015
公開日2002年2月13日 申請日期1999年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月23日
發(fā)明者P·C·昆, Y·C·程 申請人:耶魯大學(xué)