專利名稱：Pcr微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片涉及的是一種PCR與探針相結(jié)合的檢測(cè)型生物芯片的新方案，尤其是采用液體環(huán)繞式或往復(fù)式流動(dòng)方式多溫度區(qū)域聚合酶鏈反應(yīng)基因選擇性擴(kuò)增，結(jié)合固相微探針陣列技術(shù)進(jìn)行基因診斷的新型生物芯片。
生物芯片主要是指通過平面微細(xì)加工技術(shù)及超分子自組裝技術(shù)，在固體芯片表面構(gòu)建的微分析單元和系統(tǒng)。生物芯片可把許多不同功能器件集成在一起，例如，生物樣品的預(yù)處理，遺傳物質(zhì)的提取，特定基因片段的擴(kuò)增，生物探針陣列以及毛細(xì)管電泳形成整體的微流體系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞以及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的篩選或檢測(cè)?；蛐酒亲钪匾囊活惿镄酒闪舜罅康拿芗帕械幕蛱结?，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的基因，使人們可迅速地讀取和分析生命的程序。
生物芯片在生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義。例如在生物學(xué)中，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，特別是舉世矚目的人類基因組計(jì)劃實(shí)施以來，有關(guān)核酸、蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長(zhǎng)。而下世紀(jì)最富挑戰(zhàn)性的工作就是人類基因組計(jì)劃完成后，即在后基因時(shí)代，我們?nèi)绾芜\(yùn)用大量的生物分子信息服務(wù)于人類社會(huì)，并使醫(yī)學(xué)、治療產(chǎn)生根本革命。在醫(yī)學(xué)中，“系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞層次上的第二階段醫(yī)學(xué)”正在向“基因水平上的，DNA→RNA→蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)與核酸相互作用，以及它們與環(huán)境相互作用水平上的第三階段醫(yī)學(xué)”轉(zhuǎn)化。這種在分子層次上進(jìn)行的基因診斷與基因治療，將根本地認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的根源，并將有希望根本認(rèn)識(shí)和治療包括癌癥在內(nèi)的重大疾病。這些生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的根本變革，一個(gè)根本的前提是基因序列的測(cè)定和分析。能否有效快速地進(jìn)行基因測(cè)序與分析，將影響到人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，從而影響生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。傳統(tǒng)基因測(cè)序所采用的方法包括化學(xué)反應(yīng)、凝膠電泳法等一系列繁雜的步驟，這些方法花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且操作繁復(fù)，尤其在大規(guī)模測(cè)序方面費(fèi)時(shí)、并且不適宜便攜化快速測(cè)序。在對(duì)傳統(tǒng)基因測(cè)序方法進(jìn)行改進(jìn)的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)是將生命科學(xué)研究中所涉及的許多不連續(xù)的分析過程，如樣品制備，化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)等通過采用微電子，微機(jī)械等工藝集成到芯片中，使之連續(xù)化，集成化，微型化和自動(dòng)化。這一技術(shù)的成熟和應(yīng)用將在下世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開發(fā)、司法鑒定、食品和環(huán)境等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命，為生物信息的獲取及分析提供強(qiáng)有力的手段。
PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應(yīng))作為一種選擇性體外基因擴(kuò)增的方法，由于在經(jīng)25～35輪循環(huán)后就可使DNA擴(kuò)增106倍，多年來在科研和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。但由于PCR存在假陽性等缺陷，自98年6月起已被國家衛(wèi)生部禁止用于臨床診斷。究其原因，其一是PCR過程中諸多實(shí)驗(yàn)條件(引物的設(shè)計(jì)與選擇、材料配比、反應(yīng)時(shí)間、溫度、循環(huán)周期等)造成的不穩(wěn)定因素導(dǎo)致產(chǎn)生PCR的錯(cuò)誤擴(kuò)增。其二是，PCR過程的后續(xù)電泳檢測(cè)方法僅可判斷是不是得到特定長(zhǎng)度的片段，而無法確定其具體序列。其三，PCR反應(yīng)與檢測(cè)是兩個(gè)分立的過程，操作繁瑣且增加了污染的機(jī)會(huì)。因此，對(duì)于檢測(cè)條件和設(shè)備有限的中、小醫(yī)院，PCR的檢測(cè)的準(zhǔn)確性受到了很大的影響。此外，當(dāng)前的PCR擴(kuò)增過程對(duì)于操作人員的技術(shù)水平和素質(zhì)有很高的要求。
生物(基因)芯片近年來一直是國際上的一個(gè)研究熱點(diǎn)，并正以驚人的速度向前發(fā)展。美國等國際上已有多家公司進(jìn)入生物芯片領(lǐng)域，研究出把PCR與DNA陣列相集成的生物芯片。這些系統(tǒng)通常在芯片上制備一個(gè)PCR微反應(yīng)池，通過控制微反應(yīng)的溫度循環(huán)，進(jìn)行基因的擴(kuò)增。接著將擴(kuò)增后的基因引入雜交池中，與固相微陣列探針雜交，進(jìn)行檢測(cè)。Affymetrix公司則把PCR微反應(yīng)池進(jìn)一步制備成微流體管道。但目前用于科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的芯片大多是一個(gè)或若干個(gè)獨(dú)立器件。盡管已有將PCR技術(shù)與芯片檢測(cè)合為一體的報(bào)導(dǎo)，但其特點(diǎn)是整個(gè)PCR過程在一個(gè)微反應(yīng)池中進(jìn)行，因而，需要對(duì)器件的同一部位反復(fù)地升溫降溫，這將無法對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤和實(shí)時(shí)定量分析。而且由于升溫降溫需要一定的時(shí)間，延長(zhǎng)了工作時(shí)間。
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前PCR技術(shù)與芯片檢測(cè)存在不足之處提供一種PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片，這是一種控制PCR反應(yīng)溶液在不同溫度區(qū)域進(jìn)行環(huán)繞式或往復(fù)式流動(dòng)擴(kuò)增的新方案，并將PCR技術(shù)與基因微陣列探針技術(shù)合為一體，構(gòu)成一個(gè)集成型生物芯片，既可簡(jiǎn)化操作步驟，縮短PCR時(shí)間，提高效率，又可將反應(yīng)體系與外界進(jìn)行嚴(yán)密有效隔離，并使PCR擴(kuò)增一探針雜交檢測(cè)過程一體化，將PCR循環(huán)中的變性、退火、延伸過程與微陣列探針芯片構(gòu)成一個(gè)整體，可以將變性、退火、延伸和雜交四個(gè)步驟的溫度分別控制在恒定溫度，從而可避免反復(fù)的升溫降溫過程及由于溫控的誤差帶來的影響。
PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片是采取以下方案實(shí)現(xiàn)的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片是將PCR循環(huán)過程與探針雜交檢測(cè)設(shè)計(jì)在一個(gè)PCR微陣列探針芯片內(nèi)，PCR的變性退火、延伸與微陣列探針雜交反應(yīng)的四個(gè)微反應(yīng)器，構(gòu)成一個(gè)往復(fù)式或環(huán)繞式循環(huán)系統(tǒng)，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環(huán)的效率，上述PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片循環(huán)體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨(dú)立恒溫控制的，在同一芯片上集成多個(gè)可用于測(cè)量不同樣的PCR微陣列探針型芯片系統(tǒng)。變性、退火、延伸各微反應(yīng)器可以是各種形式，如微溝槽、微管、微池等。微陣列探針可以是原位合成或通過點(diǎn)樣方法制備的低密度或高密度、單功能或多功能陣列式探針。退火、延伸各個(gè)微反應(yīng)器可以合并成一個(gè)。PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的反應(yīng)完成后，檢測(cè)雜交信號(hào)并給出檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明提出了一種控制PCR反應(yīng)溶液在不同溫度區(qū)域進(jìn)行環(huán)繞或往復(fù)式流動(dòng)擴(kuò)增的新方案，并將PCR技術(shù)與基因微陣列探針技術(shù)合為一體，構(gòu)成一個(gè)集成型生物芯片，其中微陣列可以是高密度或低密度的、點(diǎn)樣制備或原位合成的、單功能或多功能的。既可簡(jiǎn)化操作步驟，縮短PCR時(shí)間，提高效率，又可將反應(yīng)體系與外界進(jìn)行嚴(yán)密有效的隔離，并使PCR擴(kuò)增-探針雜交檢測(cè)過程芯片一體化，不需進(jìn)行電泳分析，而是直接檢測(cè)雜交信號(hào)并給出檢測(cè)結(jié)果。由于探針雜交具有特異性，因而可以排除電泳法無法排除假陽性的缺陷。更重要的是，將PCR循環(huán)中的變性、退火、延伸過程與微陣列探針芯片構(gòu)成一個(gè)整體，可以將變性、退火、延伸和雜交四個(gè)步驟的溫度分別控制在恒定溫度，從而可避免反復(fù)的升溫降溫過程及由于溫控的誤差帶來的影響。由于采用了環(huán)繞式或往復(fù)式流動(dòng)PCR擴(kuò)增技術(shù)與雜交檢測(cè)一體化技術(shù)，每一組芯片單元的尺寸大大減小，從而可把幾十組或上百組芯片單元集成在一個(gè)芯片板上，可同時(shí)進(jìn)行多種生物樣品的檢測(cè)。由于本發(fā)明將PCR過程與微陣列探針芯片構(gòu)成一個(gè)往復(fù)式循環(huán)體系，不僅可在多次PCR循環(huán)后檢測(cè)結(jié)果，更可十分方便地跟蹤檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)的效率，從而獲得線性的PCR結(jié)果，并進(jìn)行動(dòng)態(tài)定量分析，真正可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化、無污染。
本發(fā)明提出的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片可有多種設(shè)計(jì)方案，以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。


圖1是本發(fā)明循環(huán)式PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片示意圖。
圖2是本發(fā)明往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片之一主視圖。
圖3是本發(fā)明往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片之一左視圖。
圖4是本發(fā)明往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片之二示意圖。
圖5是本發(fā)明往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片之三示意圖。
下面舉例說明。
參照附圖，PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片是將PCR循環(huán)過程與探針雜交檢測(cè)設(shè)計(jì)在一個(gè)PCR微陣列探針芯片內(nèi)，PCR的變性退火、延伸與微陣列探針雜交反應(yīng)的四個(gè)微反應(yīng)器，構(gòu)成一個(gè)往復(fù)式或環(huán)繞式循環(huán)系統(tǒng)，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環(huán)的效率，上述PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片循環(huán)體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨(dú)立恒溫控制的，在同一芯片上集成多個(gè)可用于測(cè)量不同樣的PCR微陣列探針型芯片系統(tǒng)。變性、退火、延伸各微反應(yīng)器可以是各種形式，如微溝槽、微管、微池等。微陣列探針可以是原位合成或通過點(diǎn)樣方法制備的低密度或高密度、單功能或多功能陣列式探針。退火、延伸各個(gè)微反應(yīng)器可以合并成一個(gè)。PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的反應(yīng)完成后，檢測(cè)雜交信號(hào)并給出檢測(cè)結(jié)果。
參照附圖1，本發(fā)明提出的環(huán)繞式PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片，PCR過程的變性在T1微流體反應(yīng)器中進(jìn)行，退火與延伸在微反應(yīng)器T2和T3中進(jìn)行，T4為微陣列探針。微陣列探針可以是原位合成或通過點(diǎn)樣法制備的低密度或高密度、單功能或多功能的陣列式探針。V1和V2為三通閥。上述各元件(T1、T2、T3、T4、V1、V2)構(gòu)成一個(gè)PCR-微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型芯片chip-1，由多個(gè)chip-1可組成一個(gè)多chip芯片板。成為在同一芯片上集成多個(gè)可用于測(cè)量不同樣品PCR微陣列探針型芯片系統(tǒng)。
參照附圖2、3，本發(fā)明提出的往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針檢測(cè)型芯片之一。圖2為主視圖，圖3為左視圖，在基片A上開有微溝槽1，2，3，4……n，這些微溝槽兩端分別以-微孔與相鄰微溝槽相通，基片A分為4個(gè)溫度區(qū)T1、T2、T3、T4。分別對(duì)應(yīng)于PCR過程的變性、退火、延伸及雜交反應(yīng)的溫度。每個(gè)微溝槽在T4區(qū)內(nèi)都有微陣列探針，在基片A的反面開有與上述微溝槽垂直的四個(gè)溝槽。變性、退火、延伸、各微反應(yīng)器可以是各種型式，如微溝槽、微管、微池等其中之一。1，2，3，4……n中都布有兩小塊與相應(yīng)溝槽吻合又能在其中自由滑動(dòng)的小鐵塊。這兩小鐵塊表面覆有一疏水有機(jī)聚合物薄膜。PCR反應(yīng)溶液事先注入微溝槽中的兩小鐵塊之間，然后以一透明薄膜覆蓋密封，有微溝槽的基片A及基片A上覆蓋的透明材料構(gòu)成芯片。使用時(shí)，試樣a、b、c、d……n由注射器或其它進(jìn)樣器穿透薄膜注入PCR反應(yīng)溶液中，然后以玻片壓緊固定。輕搖混勻后，即可開始PCR反應(yīng)，首先在T1區(qū)進(jìn)行變性，然后由磁鐵N帶動(dòng)微溝槽中的小鐵塊連同反應(yīng)體系溶液迅速移到T2區(qū)進(jìn)行退火，再移到T3區(qū)進(jìn)行延伸；延伸后迅速移到T1區(qū)開始第二個(gè)循環(huán)，或先移到T4區(qū)進(jìn)行雜交反應(yīng)后再移到T1開始第二個(gè)循環(huán)。如此繼續(xù)循環(huán)過程，直到獲得所有結(jié)果。
參照附圖4，本發(fā)明提出的往復(fù)式流動(dòng)PCR微陣列探針檢測(cè)型芯片之二。與附圖2、3設(shè)計(jì)不同之處在于不是靠磁鐵帶動(dòng)微溝槽內(nèi)小鐵塊進(jìn)而驅(qū)動(dòng)PCR反應(yīng)液體進(jìn)行PCR循環(huán)，而是由通過控制氣體F1、F2的壓力差驅(qū)動(dòng)PCR溶液1，2……n在微溝槽內(nèi)往復(fù)運(yùn)動(dòng)，因此不需磁鐵。其余結(jié)構(gòu)的原理同附圖2、3。
參照附圖5，本發(fā)明提出的往復(fù)式流動(dòng)PCR-微陣列探針檢測(cè)型芯片之三，與附圖2、3不同之處在于芯片上的微溝槽1，2……n兩端不再分別與溝槽相通，而是另以微溝槽將上述1，2……n每個(gè)溝槽兩端獨(dú)立聯(lián)接起來。這樣既保持PCR體系始終處于一個(gè)壓力平衡狀態(tài)，便于磁鐵N帶動(dòng)小鐵塊并驅(qū)動(dòng)PCR反應(yīng)液體，又彼此完全隔離，互不污染。其余設(shè)計(jì)同附圖2、3。
實(shí)施實(shí)例1(線性定量分析)參照附圖1，乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的使用。將由簡(jiǎn)單步驟預(yù)處理所得DNA模板與PCR反應(yīng)液由F1導(dǎo)入T1中，在94℃變性45秒，然后迅速流入T2中于45℃退火60秒，然后在T3于72℃延伸2分鐘，再經(jīng)V1沿路徑1進(jìn)入T4與微陣列探針雜交，檢測(cè)該P(yáng)CR循環(huán)效率。然后經(jīng)V2由路徑3入T1開始第二個(gè)PCR循環(huán)。如此，可得到每一個(gè)PCR循環(huán)的效率，并進(jìn)行定量分析監(jiān)控。30次循環(huán)后液體經(jīng)V2由導(dǎo)出口F2導(dǎo)出。檢測(cè)雜交信號(hào)并給出結(jié)果。
實(shí)施實(shí)例2(不作線性定量分析)參見附圖1，乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的使用。取病人血樣(經(jīng)預(yù)處理后與PCR反應(yīng)液混和，由F1導(dǎo)入T1中，經(jīng)下述流程T1(94℃，45秒)→T2(45℃，60秒)→T3(72℃，2分鐘)→V1→通道2→T1，進(jìn)行30次循環(huán)后，將反應(yīng)液體經(jīng)V1、通道1導(dǎo)入T4中與微陣列探針雜交，雜交后由導(dǎo)出口F2導(dǎo)出液體，檢測(cè)雜交信號(hào)并給出結(jié)果。
實(shí)施實(shí)例3(線性定量分析)參見附圖2、3，多功能的多種肝炎病毒的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片的使用。將一組預(yù)處理所得病人血清透過密封膜分別注入附圖2、3中PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片中的微溝槽1，2，3，……n中的兩小鐵塊之間的PCR溶液中，然后用玻璃板壓緊，并用夾子將玻璃板與整個(gè)芯片固定在一起，輕搖混勻。通過控制器C5用磁鐵N把樣品移到T1區(qū)(94℃)變性45秒，然后迅速移到T2(45℃)區(qū)退火60秒，然后移到T3區(qū)(72℃)延伸2分鐘，再移到T4區(qū)與微陣列探針雜交。檢測(cè)PCR循環(huán)效率。隨后移到T1區(qū)開始第二個(gè)PCR循環(huán)，如此進(jìn)行循環(huán)30次?？傻玫矫恳粋€(gè)PCR循環(huán)的效率，并進(jìn)行定量分析監(jiān)控。檢測(cè)雜交信號(hào)并給出結(jié)果。
實(shí)施實(shí)例4(不作線性定量分析)。參見附圖4，高密度的乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片檢測(cè)單點(diǎn)突變。取病人血樣(經(jīng)預(yù)處理后)，1，2，……n透過薄膜注入圖2中微溝槽1，2……n中的兩個(gè)小鐵塊之間的PCR溶液中，用玻璃板壓緊，并用夾子將玻璃板與整個(gè)芯片固定在一起，再將芯片嵌入到自行設(shè)計(jì)的PCR儀中的4個(gè)加熱元件上。然后通過控制器以磁鐵N將樣品移到T1區(qū)(94℃)變性45秒，再移到T2區(qū)(45℃)退火60秒，再移到T3區(qū)(72℃)延伸2分鐘，然后迅速移到T1區(qū)，開始第二個(gè)PCR循環(huán)，30次PCR循環(huán)后，移到T4區(qū)與微陣列探針雜交。檢測(cè)雜交信號(hào)并給出結(jié)果。
實(shí)施實(shí)例5、6，分別類似于實(shí)施實(shí)例3、4，但反應(yīng)液體的移動(dòng)通過調(diào)控微溝槽1，2……n兩端的壓力差來控制(參見附圖4)。
實(shí)施實(shí)例7、8。操作步驟同實(shí)施實(shí)例3、4，但改用圖5所示結(jié)構(gòu)的芯片。
附圖中小黑塊
為微鐵塊，陰影
為探針?biāo)趨^(qū)域。
權(quán)利要求
1.一種PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片，其特征在于1)將PCR循環(huán)過程與探針雜交檢測(cè)設(shè)計(jì)在一個(gè)PCR微陣列探針芯片內(nèi)，2)PCR的變性、退火、延伸與微陣列探針雜交反應(yīng)的四個(gè)微反應(yīng)器構(gòu)成一個(gè)往復(fù)式或環(huán)繞式循環(huán)系統(tǒng)，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環(huán)的效率，3)上述的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片循環(huán)體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨(dú)立恒溫控制的，4)在同一芯片上集成多個(gè)可用于測(cè)量不同樣品的PCR微陣列探針型芯片系統(tǒng)。
2.按照權(quán)利要求1的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片，其特征在于變性、退火、延伸各微反應(yīng)器可以是微溝槽、微管、微池形式之一。
3.按照權(quán)利要求1的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片，其特征在于所用微陣列探針可以是原位合成或通過點(diǎn)樣方法制備、低密度或高密度、單功能或多功能的陣列式探針。
4.按照權(quán)利要求1的PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片，其特征在于退火、延伸二個(gè)微反應(yīng)器可以合并成一個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明PCR微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片涉及的是一種PCR微陣列探針雜交檢測(cè)型生物芯片的新方案,尤其是采用氣體或液體往復(fù)式流動(dòng)方式多溫度區(qū)域聚合酶鏈反應(yīng)基因選擇性擴(kuò)增,結(jié)合固相微探針陣列技術(shù)進(jìn)行基因診斷的新型生物芯片。其特征在于將PCR循環(huán)過程與探針雜交檢測(cè)設(shè)計(jì)在一個(gè)PCR微陣列探針芯片內(nèi),PCR的變性、退火、延伸與微陣列探針雜交的四個(gè)微反應(yīng)器構(gòu)成一個(gè)往復(fù)式或環(huán)繞式循環(huán)系統(tǒng),循環(huán)體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨(dú)立恒溫控制的。在同一芯片上集成多個(gè)PCR微陣列探針型芯片系統(tǒng)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1248702SQ9911441
公開日2000年3月29日 申請(qǐng)日期1999年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月3日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 陸祖宏, 朱紀(jì)軍, 劉全俊, 陳亞利 申請(qǐng)人:何農(nóng)躍, 陸祖宏, 朱紀(jì)軍, 劉全俊, 陳亞利