專利名稱：監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的試紙及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測害蟲對殺蟲劑抗性的試紙及其制法，特別是涉及一種監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的試紙及其制備方法。
害蟲是農業(yè)的天敵，人們在實施殺滅某一害蟲時，如果所施用殺蟲劑的劑量低于該害蟲對此殺蟲劑的抗性，則達不到殺滅害蟲的目的；如果施用的殺蟲劑劑量過大，在造成不必要浪費的同時，也會增加對環(huán)境的不必要污染，所以測定害蟲對殺蟲劑的抗性水平十分重要。
有機磷殺蟲劑的種類很多，其結構也各有所不同，有的含P＝O鍵，也有的含P＝S鍵；有的含苯環(huán)，有的不含苯環(huán)，有的是雙乙基，有的是雙甲基或丙基等等。它們對害蟲的作用機制也有所不同。因此害蟲對不同類型有機磷殺蟲劑所顯示的抗性水平不用。目前廣泛使用的監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的手段有如下幾種一.生物測定法用不同濃度的有機磷(5-7個濃度)的丙酮液，以點滴、噴霧或浸漬的方法與害蟲接觸，經(jīng)24小時或48小時后觀察死亡率，計算致死中劑量(LD50)或致死中濃度(LC50)，以比較害蟲對殺蟲劑的抗性水平。這種方法常需要大量的標準蟲，測定條件也較苛刻，只能在實驗室的恒溫、恒濕和一定光照條件下才能得出滿意的結果；同時易受其它因素的干擾，特別在抗性個體頻率產(chǎn)生微小改變時，LD-P線中的LD50和b值不會有明顯的改變。因此獲得的結果總是滯后于抗性的發(fā)展速度，也不可能用LD50或LC50值預測抗性。
隨著抗藥性問題的日趨普遍和嚴重，人們對抗性監(jiān)測的要求是快速、簡易，不但能監(jiān)測抗性水平的動態(tài)變化，而且特別希望進行早期預警，及時采取措施以防抗性發(fā)展，因此，此生物測定的方法不能滿足人們對害蟲抗性監(jiān)測的需求。
二.生化測定方法根據(jù)Pasteur et al(1998)，Abdel-Aal et al(1990)，F(xiàn)eng et al(1996)和李梅等(1997)等文獻，在研究蚜蟲，蚊蟲對有機磷殺蟲劑抗性機理的基礎上，明確了蚜蟲體內α-萘酯酶或β-萘酯酶活力的增加是抗性的主要原因，提出了用濾紙作為載體測定非特異性酯酶的生化方法1.濾紙酯酶斑點法①制備蟲體勻漿液單個成蚜(或家蠅成蟲頭，或個體害蟲)放在試管內(5cm×0.5cm)。加50-100微升含有0.5％的Triton100的0.2mol/L PH7.4的磷酸緩沖液，用玻璃棒勻漿，而后蟲體勻漿液液面上放一小塊擦鏡紙以防蟲體渣污染濾紙斑點；②每頭取出2微升上清夜分別點在13cm×6cm的Whatman 1號濾紙上，每張點10頭；③放入含有底物為0.1％乙酸萘酯(α-NA)的磷酸緩沖液中浸泡2分鐘，取出在水中漂洗，用吸水紙吸干；④將濾紙片放入含有0.15％牢固藍RR或GBC或牢固藍B的水溶液中浸泡2分鐘，現(xiàn)出藕紫色斑點或粉色斑點，用水漂洗；⑤放在10％的冰醋酸水溶液內浸泡數(shù)分鐘，取出放在吸水紙中待干；⑥用便攜式的RCP光密度計進行吸收值測定。每個種群隨機取50-100頭，根據(jù)吸收值(OD值)可計算種群中酯酶活力的分布頻率，并可測出種群中抗性基因的頻率，從而進行抗性早期預警。
這種方法只能測出害蟲種群中個體酯酶活力的頻率分布，只能說明某一類型殺蟲劑對酯酶活力的影響，而不能確定某一種有機磷殺蟲劑的抗性基因頻率。又由于有機磷殺蟲劑結構不同，以及各地施用殺蟲劑的種類也各不相同，所顯示的抗性水平不同，所測出的酯酶分布頻率不能代表某一具體殺蟲劑的抗性。另外，基層用戶在測定害蟲對殺蟲劑抗性時，還必須具有Whatman 1號濾紙以及底物α-NA等，操作極不方便。
2.測試有機磷殺蟲劑對害蟲個體非特異性酯酶濾紙法①將預先配制的含一定濃度的某有機磷殺蟲劑(例如甲基1605，辛硫磷，久效磷等)分別先點1微升到濾紙上；②然后再重復上述方法1中的第①至⑥步驟。
這種方法雖可測出種群中某一有機磷殺蟲劑對個體害蟲的α-乙酸萘酯酶的抑制頻率分布，從而評價抗性程度，抑制率高(剩余酶活低)的為敏感個體，抑制率低(剩余酶活高)的為抗性個體。但這種方法使用起來極不方便(尤其對基層單位)，這種方法除了存在方法1的缺陷外，為了保證在測試時能將殺蟲劑和蟲體勻漿液準確地點在濾紙上的相同區(qū)域內，須在濾紙上先點殺蟲劑的地方做出明顯標記，所以造成監(jiān)測操作的不方便，同時測試結果也不易準確。
本發(fā)明目的在于克服上述方法存在的諸多缺陷，而提供一種監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的濾紙片及其制法，由于這種濾紙片預先經(jīng)過了含有底物(α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯)或同時含有底物(α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯)和某有機磷殺蟲劑的丙酮或酒精液的浸泡和涼干處理，在進行害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的測定時，不需要備有Whatman 1號濾紙片，底物α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯及標準有機磷殺蟲劑，而僅需將蟲體勻漿液點在濾紙上便可方便測出其抗性，且監(jiān)測結果準確。
本發(fā)明的實施方案如下
本發(fā)明提供的監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑的濾紙，其濾紙為生物工程中使用的定性濾紙，特征在于該濾紙經(jīng)過含α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯丙酮或酒精液充分浸泡和涼干處理；該濾紙每cm2上浸含有α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯28-140mg。該濾紙還可經(jīng)過同時含α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯與一種有機磷殺蟲劑的丙酮或酒精液的充分浸泡、涼干處理，該濾紙每cm2上浸含有α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯28-140mg，一種有機磷殺蟲劑0.2ug-100ug。
本發(fā)明的監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的試紙的制備方法如下1.浸泡處理將生物工程中使用的定性濾紙放在重量百分比濃度為0.1-0.5％的α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯的丙酮或酒精液中充分浸泡；或將生物工程中使用的定性濾紙放在同時含重量百分比濃度為0.1-0.5％的α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001-0.5％的一種有機磷殺蟲劑的丙酮或酒精液中充分浸泡；2.將浸泡過的濾紙取出涼干，鋁箔紙密封包裝，低溫下保存。
使用本發(fā)明提供的濾紙在監(jiān)測、測定某害蟲對某有機磷殺蟲劑抗性時，只須將害蟲的蟲體勻漿液點在濾紙上進行顯色即可。使用方便、快捷，且監(jiān)測結果準確，利于推廣，并且本發(fā)明的濾紙制造方法簡便，測定的結果可長期保存，有利測定田間不同時期的抗性動態(tài)變化，適用于多種害蟲如棉蚜、桃蚜等同翅目昆蟲及家蠅、蚊蟲等衛(wèi)生害蟲的抗性監(jiān)測。
實施例用本發(fā)明提供的方法制備本發(fā)明的監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的濾紙實例1.將Whatman 1號定性濾紙分別在重量百分比濃度為0.1％，0.25％和0.5％的α-乙酸萘酯的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，從而制成試紙A-1，A-2，A-3；試紙A-1，A-2，A-3上浸含α-乙酸萘酯含量分別為28mg/cm2，70mg/cm2，140mg/cm2。實例2.將Whatman 1號定性濾紙分別在重量百分比濃度為0.1％，0.25％和0.5％的β-乙酸萘酯的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，從而制成試紙B-1，B-2，B-3；試紙B-1，B-2，B-3上浸含β-乙酸萘酯含量分別為28mg/cm2，70mg/cm2，140mg/cm2。
用上述1.2實施例制作的試紙A-1，A-2，A-3和B-1，B-2，B-3監(jiān)測棉蚜抗性，具體步驟和效果如下取50頭棉蚜，每頭棉蚜加60微升含0.5％Triton100的0.2mol/L PH7.4的磷酸緩沖液在(5cm×0.5cm)試管內用玻璃棒勻漿，勻漿液液面上放一小塊擦鏡紙以防蟲體渣污染斑點，將每頭勻漿液分別取2微升點在A-1，A-2，A-3和B-1，B-2，B-3的濾紙片上，每張濾紙點10頭；2分鐘后將濾紙片放在0.15％牢固藍GBC的水溶液中浸泡2分鐘，顯出藕紫色或粉色斑點后，用水漂洗；再放入10％冰醋酸溶液內固定數(shù)分鐘后，取出放在吸水紙上涼干，用便攜式的光密度計測定OD值，測定結果見表1表1.比較三種不同濃度底物測定棉蚜個體酯酶活力
上述結果表明用A-1，A-2，A-3濾紙片測定棉蚜個體的α-NA酯酶活力(OD值)的波動范圍在0.00-0.06之間，波動范圍小于0.05的個體占84％。用B-1，B-2，B-3濾紙片測定β-NA酯酶活力(OD值)波動范圍在0.00-0.08，波動范圍小于0.05的個體占84％。由此表明A-1，A-2，A-3和B-1，B-2，B-3的濾紙片均適合于測定個體酯酶的頻率分布。
用上述A-1和B-1試紙分別測定了山東康莊，河北井溝和北京種群棉蚜的酯酶頻率分布，見表2表2.不同地區(qū)酯酶頻率分布
結果表明，以α-NA酯酶活力(OD值)小于0.1為敏感個體，OD值大于0.40為抗性個體，那北京棉蚜種群中敏感個體占26％，抗性個體為0；康莊種群敏感個體為0，抗性個體為16％；井溝種群中敏感個體占3％，抗性個體為0。β-NA酯酶活力小于0.05為敏感個體，大于0.30為抗性個體，則北京種群敏感個體占26％，抗性個體為0；康莊種群敏感個體為0，抗性個體為32％；井溝敏感個體占3％，抗性個體為0。因此以這個方法可以對不同地區(qū)棉蚜種群中α-NA和β-NA酯酶的頻率分布。僅能認為康莊棉蚜種群對有機磷殺蟲劑抗性比井溝和北京種群高，與生物測定結果相類似。實例3.將Whatman 1號定性濾紙分別在同時含重量百分比濃度為0.1％的α-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的甲基1605殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙C-1甲(A-1)，C-2甲(A-1)，C-3甲(A-1)；分別在同時含重量百分比濃度為0.25％的α-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的甲基1605殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙C-1甲(A-2)，C-2甲(A-2)，C-3甲(A-2)；分別在同時含重量百分比濃度為0.5％的α-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的甲基1605殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙C-1甲(A-3)，C-2甲(A-3)，C-3甲(A-3)。
用上述試紙片C-1甲(A-1)，C-2甲(A-1)，C-3甲(A-1)；C-1甲(A-2)，C-2甲(A-2)，C-3甲(A-2)；C-1甲(A-3)，C-2甲(A-3)，C-3甲(A-3)，測定不同濃度的甲基1605對棉蚜個體α-NA酯酶的抑制率的頻率分布，A-1作對照組.表3.不同濃度甲基1605對棉蚜α-NA酯酶的抑制后酶活
*()內數(shù)據(jù)為抑制百分率表4為不同濃度甲基1605對α-NA酯酶的抑制頻率分布表4.不同濃度甲基1605對α-NA酯酶的抑制頻率分布
從上述結果表明，不同濃度甲基1605與不同底物濃度α-乙酸萘酯對棉蚜個體α-NA酯酶的抑制作用，可以看出低濃度(0.2ug/cm2)甲基1605與0.1％α-NA處理的濾紙片對棉蚜個體α-NA酯酶的抑制頻率分布明顯低于20ug/cm2和100ug/cm2。如以0.2ug/cm2甲基1605處理，抑制率低于30％的頻率有10％個體，大于70％個體有56％，而20ug/cm2和100ug/cm2抑制率低于30％個體分別為2和0，而抑制率大于70％的分別為90％和88％個體，說明濃度對棉蚜酯酶的抑制率是隨濃度增加而增加，這與用生物測定方法是一致的，因此用這種方法可以用來監(jiān)測抗性的水平。實例4.將Whatman 1號定性濾紙分別在同時含重量百分比濃度為0.1％的β-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的辛硫磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙D-1辛(B-1)，D-2辛(B-1)，D-3辛(B-1)；分別在同時含重量百分比濃度為0.25％的β-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的辛硫磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙D-1辛(B-2)，D-2辛(B-2)，D-3辛(B-2)；分別在同時含重量百分比濃度為0.5％的β-乙酸萘酯和重量百分比濃度為0.001％、0.1％、0.5％的辛硫磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡后，取出涼干，制成試紙D-1辛(B-3)，D-2辛(B-3)，D-3辛(B-3)；用上述試紙片測定不同濃度辛硫磷對棉蚜β-萘酯酶的抑制頻率分布，具體操作分別取25頭北京和山東的二個棉蚜種群以編號1-25號為北京種群，26-50為山東種群，其它步驟和計算等方法同實例3。
表5.辛硫磷對北京和山東康莊棉蚜酯酶抑制后的酶活
表6-1.D-辛(B-1)濾紙測定北京和山東地區(qū)棉蚜個體β-NA酯酶的頻率分布
表6-2.D-辛(B-2)濾紙測定北京和山東地區(qū)棉蚜個體β-NA酯酶的頻率分布
表6-3.D-辛(B-3)濾紙測定北京和山東地區(qū)棉蚜個體β-NA酯酶的頻率分布
上述結果表明，以小同濃度辛硫磷與不同底物濃度配制的試紙片測定辛硫磷對棉蚜個體β-NA酯酶的抑制作用，可以看出，低濃度0.2ug/cm2)辛硫磷與不同底物濃度處理的試紙片，無論是北京和山東康莊種群均差異不大。而用20ug/cm2和100ug/cm2辛硫磷與28mg/cm2β-NA處理的濾紙片，可以明顯看到抑制率小于30％(作為抗性個體)北京種群均為0，山東種群分別為80％和12％；用20ug/cm2和100ug/cm2辛硫磷與70mg/cm2β-NA處理的濾紙片，北京種群為0，山東種群分別為20％和0％。上述結果均反應了北京棉蚜種群是一個比較敏感的種群，無抗性基因個體。而康莊種群中β-NA酯酶的抗性基因頻率明顯高于北京種群，并且隨辛硫磷濃度的增加其抑制作用也隨之增加，這與生物測定結果也是一致的。由此用這種方法可以確定田間種群中害蟲β-NA酯酶的抗性基因頻率。實例5.將Whatman 1號定性濾紙用重量百分比濃度為0.1％α-乙酸萘酯與重量百分比濃度為0.1％甲基1605殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，制成試紙E-甲；將Whatman 1號定性濾紙用重量百分比濃度為0.1％α-乙酸萘酯與重量百分比濃度為0.1％辛硫磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，制成試紙E-辛；將Whatman 1號定性濾紙用重量百分比濃度為0.1％α-乙酸萘酯與重量百分比濃度為0.1％久效磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，制成試紙E-久；將Whatman 1號定性濾紙用重量百分比濃度為0.1％α-乙酸萘酯與重量百分比濃度為0.1％丙溴磷殺蟲劑的丙酮液中充分浸泡之后取出涼干，制成試紙E-丙；試紙E-甲，E-辛，E-久和E-丙的α-乙酸萘酯含量為28mg/cm2，殺蟲劑含量均為20ug/cm2。用制成的E-甲，E-辛，E-久和E-丙的試紙片測定三個不同地區(qū)二齡棉鈴蟲幼蟲個體α-乙酸萘酯酶的抑制頻率分布。
具體操作步驟取25頭二齡棉鈴蟲幼蟲，分別將1頭幼蟲放在(0.5cm×5cm)的玻璃試管內，加50微升含有0.5％的Triton 100的0.2mol/L PH7.4的磷酸緩沖液，用玻璃棒勻漿，在勻漿液液面上覆蓋一小塊擦鏡紙以防蟲體渣污染試紙；其它步驟同前面的實例。結果見表7.表7不同殺蟲劑對棉鈴蟲酯酶的抑制頻率(％)
結果表明，如以殺蟲劑的抑制率小于30％的個體作為抗性個體，抑制率大于70％的個體作為敏感個體，則植保所棉鈴蟲對甲基1605的抗性個體占4％，敏感個體為52％，辛硫磷分別為0％和16％；丙溴磷為0％和8％，久效磷為76％和0％；河北棉鈴蟲對甲基1605分別為0％和76％，辛硫磷為8％和4％；丙溴磷為8％和0％，久效磷為56％和8％；山東種群對甲基1605分別為12％和0％，辛硫磷為1％和30％；丙溴磷為0％和9％，久效磷為70％和0％。這些結果顯示了同一種群對不同有機磷殺蟲劑顯示的抗性程度不同。例植保所種群敏感個體頻率甲基1605＞辛硫磷＞丙溴磷＞久效磷，河北種群甲基1605＞久效磷＞辛硫磷＞丙溴磷，山東種群久效磷＞甲基1605＞辛硫磷＞丙溴磷。這方法可以準確同時比較幾種不同有機磷殺蟲劑的抗性程度。根據(jù)不同地區(qū)對殺蟲劑的抗性程度及時提出選用較好的殺蟲劑控制害蟲抗性的發(fā)展。
權利要求
1.一種監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的試紙，其試紙以生物工程中使用的定性濾紙，其特征在于該濾紙經(jīng)過含α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯丙酮或酒精液浸泡及涼干處理，或經(jīng)過同時含有α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯與一種有機磷殺蟲劑的丙酮或酒精液充分浸泡、涼干處理，每平方厘米的試紙上浸含有α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯28mg/cm2-140mg/cm2或每平方厘米的試紙上浸含有α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯28mg/cm2-140mg/cm2和一種有機磷殺蟲劑0.2ug/cm2-100ug/cm2。
2.一種監(jiān)測害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的試紙的制備方法，其特征在于①將生物工程中使用的定性濾紙放在含重量百分比濃度為0.1％-0.5％的α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯的丙酮或酒精液中充分浸泡；或將生物工程中使用的定性濾紙放在含重量百分比濃度為0.1％-0.5％的α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯和0.001-0.5％的一種有機磷殺蟲劑的丙酮或酒精液中充分浸泡；②將浸泡過的濾紙取出涼干，鋁箔紙密封包裝，低溫下保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測害蟲對殺蟲劑抗性的試紙片及其制法,特征在于:將生物工程中使用的定性濾紙經(jīng)過含有底物(α－乙酸萘酯或β－乙酸萘酯)或同時含有底物和一種有機磷殺蟲劑的丙酮(酒精)液浸泡和晾干處理,在進行害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的測定時,基層單位不再需要備有底物α－乙酸萘酯或β－乙酸萘酯及標準有機磷殺蟲劑等,而僅需將蟲體勻漿液點在該試紙上便可快捷方便地測出其抗性,且監(jiān)測結果準確,保留時間長。
文檔編號G01N21/77GK1245289SQ9811733
公開日2000年2月23日 申請日期1998年8月17日 優(yōu)先權日1998年8月17日
發(fā)明者馮國蕾, 李梅, 何鳳琴, 趙章成 申請人:中國科學院動物研究所