專利名稱：氨基胍的分析及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對氨基胍及其類似物的分析，特別是涉及在人體液中的氨基胍及其類似物的測量。
對化合物氨基胍的研究已進行多年，具體地說，最初確定它具有某些生理性質，其中的一個性質是對酶的組胺酶的抑制作用，氨基胍已被確定為雙胺氧化酶的一種選擇性抑制劑，為了研究組胺的新陳代謝而提供給動物和人體。更具體地說，如同Lindbergh等人在“The Inhibitory Effect of Aminoguanidine On Histamine catabolism in Human Pregnancy”《ACTA OBSTET.GYNECOL.SCAND.》(45131-139，1966)中指出的那樣，氨基胍被認為可以提高組胺的水平。特別是最近確認氨基胍作為蛋白質的葡萄糖傳遞交聯(lián)的抑制劑，例如有用在非酶蛋白質交聯(lián)狀態(tài)治療中，例如用在糖尿病引起的長期并發(fā)癥的治療中。氨基胍的這一新發(fā)現(xiàn)的作用由Cerami.Ulrich和Brownlee，在1988年7月19日出版，專利號為4758583美國專利說明書中公開。其中的相關部分作為本申請的參考技術引用。
由于前面所述的氨基胍在研究組胺新陳代謝中的應用結果，使在檢驗活組織中的氨基胍分布相應的測定方法取得了適當的進度。特別是由Beaven等人在《J.PHARMACOL.EXP.THER.》(16514-22，1969)，提出了一種根據在酸溶液中氨基胍與P-硝基苯甲醛的反應比色分析氨基胍。在這個反應中生成一種正黃色的物質，這種物質可以從內生的物質萃取到乙酸乙酯中，然后再返回到稀鹽酸中，再將該鹽酸萃取物變成堿性后，可以用分光光度法測定該黃色產物。
另一方面，由Beaven等人確認的方法提供了一種適于具有個別特性研究的測定，作為一種即將出現(xiàn)的治療試劑的氨基胍已經促進了更加完善的測定方法的發(fā)展，這種方法能夠自動地操作，迅速地分批分析生物樣品中的該化合物。這樣的測定將促進有效地、迅速地和精確地控制氨基胍的治療。這正如在美國專利4758583中所提及那樣，另外還有助于對這種化合物的新的潛在活性和各種應用識別。
此外，人們希望發(fā)展這種分析方法，這種方法不僅對氨基胍是有用的，對它的類似物也是有用的，這些同樣是根據上述的美國專利所教導的概要發(fā)展，而AG(氨基胍)及其類似物的代謝物的存在對于測量是重要的。
根據本發(fā)明，發(fā)展了一種分析方法和有關的材料，這種方法提供了確定氨基胍及其類似物質在生物樣品例如血漿和身體組織存在和分布的迅速和精確的手段。因此，在其本質方面本發(fā)明包括一種分析氨基胍及其類似化合物的方法，它包括A、收集一個確信包括有一些氨基胍及其類似化合物的生物樣品;
B、脫去該生物樣品中的蛋白質;
C、使經步驟B中除去過蛋白質的生物樣品同足夠量的吡啶醛反應，以使在該生物樣品中存在的氨基胍及其類似物全部轉化為相應的吡啶醛-取代腙;
D、用一個利用梯度洗脫高壓液相色譜法從反應混合物的剩余物分離出在步驟C中生成的全部取代腙;以及E、檢驗步驟D中所分離出的物質，以便估計該氨基胍和/或其類似物的分布和數量。
這個生物樣品可以通過用足夠數量的脫去蛋白質試劑或從用于沉淀蛋白質的中等強度酸到強酸選擇的試劑以及一種適合的有機溶劑脫去蛋白質;也可以使樣品經超過濾而脫去蛋白質。適用的酸包括高氯酸和三氯乙酸，而適用的有機溶劑包括甲醇、乙腈和二氯甲烷。在氨基胍是被分析的化合物的情況下，吡啶醛最好包括6-甲基-2-甲基吡啶醛，它對應于形成6-甲基-2-甲基吡啶醛脒腙。最好是使生物樣品和吡啶醛之間的反應在中等酸度的條件下進行，而色譜條件采用具有徑向壓縮的色譜柱和具有一均勻流量率和在離子對條件下進行。在缺少徑向壓縮的工藝的情況下，可以用鋼柱中類似填充材料來代替，雖然色譜儀調整可能需要。最后腙析出物可以用紫外光譜儀進行檢驗。對氨基胍來說在波長302nm能檢查出來。
上述程序具有各種應用，特別是適用于促進與糖尿病和衰老的有害影響斗爭而正在服用的氨基胍的測量，以便確定是否曾供給過氨基胍，倘若如此，為了獲得所希望的效果，氨基胍在體液中的合適數量是否已經達到，作為最后監(jiān)測的輔助手段，上述程序將進一步促進調整給藥量，以便使體液中的氨基胍的含量達到有效水平。這樣本發(fā)明分析方法例如可以利用生物流體樣品如尿、唾液、組織勻漿和血漿。
如上所述，借助于這個分析的檢測和測量氨基胍的方法適合于氨基胍的類似物。在這當中，下面將以N-乙基氨基胍測定作為氨基胍的典型的類似物的例子來說明，這個物質已作本分析系統(tǒng)的內部標樣，并表明這個分析系統(tǒng)適合于氨基胍的其它類似物。氨基胍可以用作其它類似物的內部標樣，只要氨基胍不是一種可疑的或該類似物的已知代謝物，并且它有測量需要的濃度。
本分析方法相應的應用范圍可以推廣到生物樣品是組織的情況下，此外，本發(fā)明可以擴展到一種測量在組織中氨基胍和/或及其類似物的存在的方法，這個方法是通過收集一個或多個組織樣品，然后對這些樣品完成本發(fā)明的測定。這樣這些組織例如可以是腎、骨膠原子、血管等以及類似物可以作為實驗動物研究和人體活組織研究同樣地被檢驗，以便測量在這些組織中氨基胍或類似物的水平，從而確定這樣的水平是否合適，以及在一新發(fā)現(xiàn)了氨基胍的衍生物的情況下，為了發(fā)揮所希望治療的抑制效果就要確定這些衍生物是否能夠定位在所期望的組織中。
本發(fā)明還擴展到一種測量腎功能的方法，該方法是通過對氨基胍及其類似物的消除半衰期測量來完成的，而在一個具體的實施例中，可以借助本分析方法來完成測定。當然，腎功能的測量可以通過從所檢測者收集血漿樣品;用足夠量的氯化有機酸除去血漿樣品中的蛋白質，使脫去蛋白質的血漿樣品同吡啶醛最好在中等強度的酸性條件下反應，以便生成一種吡啶醛取代脘;借助高壓液相色譜法分離形成的任何腙，并且最好用紫外光譜儀檢測這個分離物，以便確定氨基胍或其類似物。
整個的分析和程序包括服用一個固定劑量的氨基胍或及類似物，接著按不同的時間收集血漿樣品，完成本方法，從而確定在每個樣品中的氨基胍的含量，將計算出的氨基胍的排除數據，同根據曲線或列表的連續(xù)集得到的數據相比較，其中曲線或列表的數據是事先收集各種不同腎功能被試驗者中采集的氨基胍的排除數據中整理出來的，根據比較結果來確定目前被檢測者的腎功能。
本發(fā)明還涉及一個為完成本分析的試驗器材箱，這個器材箱中裝有A、供脫去生物樣品蛋白質用的一定量的試劑;
B、用于同獲得的氨基胍或其類似化合物反應的一定量的吡啶醛;
C、其它用在高壓液體色譜儀試劑和固定液;
D、使用這些器材的指南。
適合的脫去蛋白質的試劑可以從適合于沉淀蛋白質的中等強度的酸到強酸以及合適的有機溶劑中選擇。這些酸和溶劑早已列這當中。本測定器材箱還可以包括從氨基胍和它的類似物選出的內部標準，例如氨基胍的類似物N-乙基氨基胍。
在為測量腎功能而準備的試驗器材箱的情況，它可以包括在事先量過的適于被試驗者服用的劑型中一定量氨基胍或一種類似物，還應包括商的曲線或列表的連續(xù)集，或者從這樣一個連續(xù)集導出的公式，這個連續(xù)集由用腎小球濾過率(GFR)表示的氨基胍或它的類似物一致的消除半衰期(T1/2)確定，診斷者和門診醫(yī)師可以參考它解釋在腎合用性期間試驗結果。
這種予先確定的劑型，可以制成口服的，具可以事先制成固態(tài)或液態(tài)劑型，如所予期的片劑、膠囊、甘香酒劑、糖漿等。這個商包括由氨基胍或其類似物消除半衰期(T1/2)與腎小球濾過率(GFR)的比率得出的系數。
本發(fā)明呈現(xiàn)出廣泛的優(yōu)點，作為能夠迅速估計腎功能的現(xiàn)代診斷程序，以及與顯露診斷和治療作用相結合的有希望的效率，這對于氨基胍和它的類似物被預見。因為本發(fā)明的分析方法速度高，操作簡單，精度高，可靠，所以使它可作為一個極好的診斷和研究工具，將達到廣泛的接受和使用。
這樣，本發(fā)明的主要目的是提供一種測量氨基胍及其類似物質在組織和生物流體樣品中的分布。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述的方法，這種方法可在容易和廉價的方式中完成。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種上述的方法，這種方法可以用作對和氨基胍及其代謝物和類似物質具有同樣作用的藥品和其它化合物的分析。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種精確的可靠的估價腎功能的方法。
本發(fā)明的另一個目的提供一種為完成所述方法的試驗器材箱，它應用簡單。
本發(fā)明的再一個目的是在具有氨基胍或其類似物質的存在，活性或排除的有關病理學狀況或條件的哺乳動物中監(jiān)測藥物養(yǎng)生法或類似草案的有效性。
根據下面的說明書和結合附圖的描述對于本專業(yè)的技術人員來說，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將是顯而易見的。


圖1是從完成測定鼠、狗和人的血漿結果中得到的標準數據的概括的曲線。
圖2包括分別為人的空白血漿樣品，一個低濃度(0.1μg/ml)量的對照樣品和一個高濃度(8μg/ml)量對照樣品單獨的色譜圖。
圖3是一個從完成測定人的尿的結果中得到的標準曲線數據的概括的曲線。
圖4包括分別為人的空白尿樣品，一個低濃度(1、0μg/ml)量的對照樣品，和一個高濃度(90μg/ml)量的對照樣品的單獨色譜圖。
圖5是一個氨基胍排放半衰期(T1/2)對腎小球濾過率(GFR)商的連續(xù)集的關系曲線。
本發(fā)明涉及一種用于測量在人體流體和組織中的氨基胍及其類似物質的方法和有關材料。本發(fā)明的方法包括A、收集確信含有氨基胍或其類似物質的生物樣品;
B、對生物樣品進行脫去蛋白質處理;
C、使在步驟B中脫去過蛋白質的生物樣品同中足夠量的吡啶醛反應，以便使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物質全部轉換成相應的吡啶醛-取代腙;
D、借助于利用均勻洗脫的高壓液體色譜法從反應混合物的剩余物中全部分離出在步驟C中生成的取代腙。
E、檢驗步驟D中的分離物，以便估價該氨基胍和/或及類似物的數量和分布。
如上所述，本發(fā)明的方法力圖提供一個能夠用在自動的分批的基礎上使用測定程序，這個程序除了適合診斷和試驗目的外，還適合于治療目的。盡管Beaven等人公開的氨基胍已知測定方法中包括比色分析，但是本發(fā)明方法在生成吡啶醛取代腙這點上是具有特點的，這個吡啶醛取代腙可以用紫外光檢測，而更重要的是在其檢驗結果的穩(wěn)定性、相應的精度和重復性。生成腙本身不是新的發(fā)現(xiàn)，它已被Ceba等人在《Analytical Properties of Pyridine-2-Aledhyde Guanylhydrazone，》(TALANTA 28134-136 1981)所公開，這些作者公開了這種腙的制備方法并建議同各種無機陽離子一起作為分析試劑，因為用這種腙能生成視覺可以區(qū)分的絡合物。在Ceba等人的論文中，關于可以通過反應生成相應脒基腙來測定氨基胍，以及這最終的反應物可以在波長為302nm的紫外范圍內很容易檢測出來，這個構思一點也沒有提及。
如上所述，為了脫去樣品的蛋白質可以用能夠沉淀蛋白質的試劑來處理樣品，也可以用其它分離技術處理樣品，例如超過濾技術。適合的試劑可以從中等強酸到強酸，例如高氯酸和三氯乙酸一類酸中選取，后者優(yōu)先選用。如果用三氯乙酸，其典型的濃度為7.5%。試劑也可以從由在溶劑一以蛋白質為基礎沉積程序中使用的有機溶劑，例如甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。蛋白沉積技術是公知的，在這里要提及的是補充的程序。當然在這里試劑和規(guī)定的程序是為了說明的目的，以及依照申請人要盡公開完成本發(fā)明最好的方式的義務而提出的。
用在本發(fā)明的吡啶醛可以是6-甲基甲基吡啶醛，它可以制成例如10mg/ml濃度的溶液。此外，在吡啶醛和脫去過蛋白質的生物樣品之間的反應最好在中等強度酸中進行。然而具體的吡啶醛及其具體的濃度在這個工藝中是可以改變的，上述的選擇數據同樣是為了使申請人盡公開完成發(fā)明的最好方式的義務而提出的。
本方法的下一個步驟中是要借助于采用均勻或梯度的洗脫的高壓液體色譜法從生物樣品和吡啶醛之間的反應形成取代腙，然后從反應混合物的剩余物中把所有取代腙全部分離出。具體地說，色譜方案可以利用具有均勻流量率的在離子對條件下的徑向壓縮色譜柱的。然后，用紫外光譜法對最終的腙的分離物進行檢驗，而在氨基胍的具體情況下，可以在302nm波長檢測。這個檢測特異性是本發(fā)明的優(yōu)點之一，并且它區(qū)別公知的比色分析測定方法。
實踐本方法包括一個內部標樣的參考標準，這個標準最好是同根據本方法的步驟B對它處理之前的生物樣品結合，要選擇具有類似結構和功能性的樣品作為這個內部標樣，以便能保持對本方法的程序對照作用。適合作為內部標樣的化合物包括氨基胍及其類似物質。內部標樣可以是氨基胍或一個類似物質，例如N-乙基氨基胍(＝N-ethylhydrazine carboximidamide)。當然，利用具體化合物作為內部標樣不是對本發(fā)明的限定，而采用其它與氨基胍的結構和功能相似的化合物作為標樣也在本發(fā)明的保護范圍內。
如前所述，本方法具有很多應用，其中包括對在各種生物環(huán)境下的氨基胍及其類似物質的檢測，具體地說，根據本方法可以測量的生物樣品包括流體，例如血漿、唾液、尿和組織等，本方法還具有多種診斷和治療應用。
在進一步實施例中，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測治療方案或藥物療法的效率的方法，這些治療中包括服用例如氨基胍或及類似物質的化合物，以便與過強的身體蛋白質糖化作用的有害影響斗爭，如在老化過程和糖尿病中所證明的。本發(fā)明的方法可以借助分離和檢驗由血漿，尿或組織所取的生物樣品來完成。為了確定在血中存在的氨基胍的治療劑量是否達到要求，可以測試血漿樣品，而為了測定氨基胍的清除率可以測定尿樣品，以便確定為保持有效的治療劑量所需要的相應的氨基胍的給藥。最后，組織樣品可以從與治療目的有關的器官或人體的局部取出，以確定輸送到這個局部治療試劑是否已經夠用。
本發(fā)明擴展一種為治療病人以抑制在該病人體內過強的糖基化作用的最后產物，該方法包括服用這樣的過強糖基化作用的一種有效數量的抑制劑，它包括一種從氨基胍及其類似物質中選出的化合物。該方法還包括連續(xù)監(jiān)測在取自試驗對象的樣品中氨基胍或它的類似物質的含量是否達到治療有效的水平，這些樣品包括體液和組織。在這種情況下，本發(fā)明的分析方法可以在規(guī)定的時間間隔中進行，精確的時間間隔應根據單個服藥方案和病人簡況改變。例如，這些時間間隔可以在一小時到24小時內調整。
本發(fā)明可以應用于檢測上面提及的氨基胍的類似物質，就此而論，擴展到一種確認化合物篩選測定，這種化合物可以抑制過強的糖基化作用最后產物的生成，并且這類化合物具有和氨基胍相似的結構。在這樣的情況下，一種生物樣品例如組織樣品或細胞培養(yǎng)物，可以用一定量的化合物在試驗中培養(yǎng)，此后本分析方法在觀察時可以測定被檢查化合物的存在和活性，從而測定它的吸收、分布、新陳代謝和/或排泄簡況。在這種情況，予見的具有和氨基胍相似的結構抑制劑化合物臨床試驗正在進行中，則可以將這個新藥物供給實驗對象，然后接規(guī)定的間隔取出尿樣品，從而確定被檢測藥品的范圍和它的腎清除率發(fā)生。這個試驗可以作為檢驗組織和血漿樣品的輔助手段來進行。從而不僅確定了新藥品的療效，還試圖有系統(tǒng)地闡述一個適宜的給藥方案。
本發(fā)明同樣擴展到一個測試器材箱，以便完成氨基胍及其類似物質的分析，它包括A、一定數量用于脫去生物樣品中蛋白質的試劑;
B、一定數量用于同獲得的氨基胍或類似化合物反應吡啶醛;
C、在高壓液體色譜法中應用的其它試劑和固定液;
D、關于該器材箱的使用指南。
在本器材箱中的脫去蛋白質的試劑和吡啶醛的選擇如前所述。同樣，這個器材箱可以包括一定量的內標以及一般用在高壓色譜法中試劑和材料。
本發(fā)明進一步實施例擴展到一種測定腎功能的方法，它包括，向待檢測對象供給一事先確定的數量或從由氨基胍及其類似物質組成的組中選定的主要試劑量;按規(guī)定的時間間隔從該待檢對象身上，收集血漿樣品，并檢測該標品中上述的氨基胍或其類似物質的含量和分布。這種方法主要注視作為這個目的主要試劑氨基胍及其類似物質應用，并擴展到各種試驗方案，在這些方案中，可以服用這樣的試劑，然后進行監(jiān)測和/或測量。這些方案的具體例子將在這里著重說明，對試驗器材箱同樣也予以考慮，它包括一定數量的從氨基胍及其類似物中選出的主要試劑，其它的試劑和底物以及器材的使用指南。
下面說明一種測量腎功能的具體方法，它包括測量氨基胍或及類似物質的排放半衰期(T1/2)，并把這些數據同從各種參考個人樣品得到的同類數據集相比較。更具體地說，這種方法包括服用一確定劑量氨基胍或其類似物質，然后按規(guī)定的各個時間間隔，依次從該被檢對象身體中收集血漿樣品，用本法檢測這些樣品，根據其檢測結果確定每個樣品的排放半衰期數據，再將這些數據與從有各種腎功能個別人試驗和分析中得到的數據的預先確定的數據集相比較。這個測定的數據包括排放半衰期和腎小球濾過率(GFR)，將這些單個數據綜合起來考慮，以便確定一個比值，根據這個比值，可以用表格或曲線圖的數據集表示出來。
作為
背景技術：
，腎功能的測量數據長期以來被認為是在一般的健康評價以及具體的病癥例如腎病(nephropathy)的重要指標。因為腎在人體呼吸和新陳代謝活動中起著同等重要的作用，所以與病理無關的腎衰老或腎衰竭是危險的。例如，腎衰竭需要血液透析或進行腎移植，在血透析的情況下，必須連續(xù)地監(jiān)測腎功能，以便確定透析處理的必要性和頻次。因此可以正確估價腎衰竭是否由糖尿病引起的。上述的方法一般應用在任何病理條件下的腎功能的評價上。
公知的測量腎功能的方法有多種，其中有血靜脈內灌輸放射性示蹤物，首先服用示蹤物，然后取出血液和定量的尿樣品，再測定在穩(wěn)定條件下這些示蹤物的腎清除率。雖然這種方法是精確的，但是它有許多缺點，其中包括需要小心管理病人和定時收集尿和血樣品等，此外病人服用的放射性物質可能表現(xiàn)對人體安全有危害，以及附帶的同位素的存儲和運輸、銷售的價格高和由于這些同位素的半衰期短，需要經常補充的等問題，還有安全幫資金上的考慮。因為放射性同位素的半衰期短而需經常補充，在很多情況下，在用這種物質之前，設備、病人和在測定中使用這種物質的工作人員，都要受到附加的污染。
第二種方法是測量內生的肌酸酐排放量，在這種方法中必需從病人收集血和全尿樣品，誤差主要是由于很難收集全尿樣品，很多要求測定腎功能的病人呈現(xiàn)有神經方面的損傷，使他們完全排空膀胱，如果不是不可能至少也是困難的。而且為了收集全部尿，24小時尿收集需要病人在家里或在醫(yī)院里配合，這種配合病人很難保證。于是雖然肌酸酐排放量的測定是科學可靠的，和理論上精確，但是常常在獲得精確檢測樣品的實踐中失敗。
通過上述的比較，作為適合于測定腎功能的本方法提供了一個簡單方便和可能的方案。所需要做的只是一次服用小劑量的氨基胍和分三次取出血液樣品。服用小劑量的氨基胍表現(xiàn)低的危險，減少了流體收集的次數，同樣還減少了對病人的危險和不方便。正如下面指出的那樣，從完成用于腎功能的本方法中所獲得的數據指出在氨基胍的消除半衰期和借助腎小球濾過率測定的腎功能之間的線性關系有極好線性相關。
如前所述，完成評價腎功能的本方法的具體實施例的步驟包括A、給病人服用一次300mg劑量的鹽酸氨基胍，鹽酸氨基胍可以是口服的膠束、片劑或液體糖漿、甘香酒劑等。
B、在氨基胍或類似物質服用后，定期收集血漿樣品，例如至少收集3ml血漿樣品，如果服用的是干的氨基胍(例如小丸狀)則應在服用后10小時取第一個樣品，在服用后14小時取第二個樣品，在服用后18小時取第三個樣品;如果服用的是液體氨基胍，可以按類似的規(guī)則進行取樣。
C、根據本發(fā)明的方法，對按指定時間間隔收集的樣品進行處理，以便測定氨基胍的濃度。
D、測定消除半衰期(T1/2)，具體地說，是參考關系式解釋和確定數據，其中血漿濃度的對數下傾的斜率隨時間關系被確定為消除率(Kelim)，消除半衰期(T1/2)和Kelim由下列方程來確定。
T1/2＝0.6931/KelimE、在測定出氨基胍消除半衰期以后，把它與一個連續(xù)集比較，這個集是氨基胍消除半衰期與從大量個人的腎功能值聯(lián)系起來，這些個人有各種各樣的腎功能，其中包括從腎功能正常的到不正常的試驗對象。在這些人身上，兩種測量結果都已事先得到。這個現(xiàn)存數據的基礎或連續(xù)集顯示出氨基胍的消除半衰期和腎小球濾過率(GFR)之間呈反比的關系。
以目前得到的數據和試驗為基礎，口服300mg劑量的鹽酸氨基胍以后測定氨基胍得到T1/2和腎小球濾過率(GFR)之間的關系如下氨基胍T1/2＝-0.14(GFR)+22.04(r＝0.875，n＝18)上述關系式可以根據腎小球濾過率解出，將解出的最終的數據點同根據的已知腎功能個人試驗建立的數據的連續(xù)集相比較。圖5中示出這樣連續(xù)集的代表。它包括一個氨基胍的清除半衰期隨著腎小球濾過率(GFR)變化的曲線和并包括求出的數據點，這個圖將在后面的例3中說明。
正如前所述，本方法的優(yōu)點之一是擺脫了因繁瑣的尿的收集和檢驗而帶來的不精確和不方便。本方法可以通過簡單服用事先確定數量的氨基胍，然后按照如上面所建議的時間間隔依次收集血漿樣品來完成，然后根據本方法處理這些樣品，將這測量數據變換氨基胍的相應的消除數據，再將這些數據與借助于曲線或表格表示的已有的連續(xù)集比較。根據這個方法，可以得到一安全有效的簡單的監(jiān)測腎功能的方法?？砂堰@種方法推廣到檢測與腎功能有關的病癥的發(fā)作和存在，這是可取的。
本發(fā)明還進一步提供一個根據本發(fā)明的一個最佳實施例評價腎功能的測試器材箱，它包括A)一定數量的氨基胍及類似物質，它被制成予先確定劑量的適于檢測對象服用的形式;
B)包括從氨基胍或其類似物質的消除半衰期T1/2同它的腎小球濾過率(GFR)的比值導出商的圖或連續(xù)集;
C)一定數量的用于脫去生物樣品中蛋白質的試劑;
D)一定數量的用于同可以獲得的氨基胍或其類似化合反應的吡啶醛;
E)用在高壓色譜儀中的其他試劑和固定液;
以及F)測試器材使用指南。
如前所述試驗器材箱，本測試器材箱可以包括一個內部標樣，例如氨基胍或其類似物質。同樣地在測試器材箱中的試劑可以包括前面指出脫去蛋白質試劑在內的那些試劑。這個測試器材箱可以根據重復使用基礎來準備，其中器材箱中的某些消耗品可以多倍劑量地提供;或者這個器材箱準備供一次使用;在其中提供特定數量的每種試劑和消耗物品。
同樣，某些試劑可以制成干式的，例如借助于凍干，以便于包裝，并附有特定的說明，為使用時加適當液體以便活化這些試劑。
在本測試器材箱中事先確定的或事先測量過的數量的氨基胍或其類似物質可以按各種服用方式制備，最好是制成固態(tài)或液態(tài)可口服的藥劑;如片、膠束、糖衣丸、密餞、糖漿、甘香酒劑等形式。此外具有各種濃度氨基胍都是有用的，本發(fā)明不限制氨基胍的特定濃度，300mg的鹽酸氨基胍及其類似物質的藥劑已經被利用并且是優(yōu)選的。
用下面的實施例加以說明，可以更好地理解本發(fā)明
例1、下列試驗曾經是為確定本方法檢驗一些哺乳動物血漿樣品的精度而進行的。這些樣品是從鼠、狗和人體中收集的，然后以一予先確定劑量的氨基胍處理。為了評價本分析程序的重復性和可靠性，兩個分析者進行獨立和平行分析，對于每位分析者的最后得到的樣品按下述方法處理分析方法1、樣品制備將0、5ml內部標準工作溶液(在7.5%三氯乙酸中10μg/mlN-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽)加到0.5ml的血漿樣品中，在旋渦10秒鐘和在微型離心機(microfuge)(Eppendorf，14000rpm，10分鐘)離心分離后，將上層清液傾析到一干凈螺旋塞培養(yǎng)管中，其中裝有0.1ml反應試劑的水溶液(10mg/ml)(6甲基-乙吡啶甲醛)，將該樣品用蓋蓋緊，在加熱裝置中(95°-100℃)反應10分鐘，待冷卻后，將樣品輸送到高壓液相色譜儀中管瓶中，從該瓶中取200μl的樣品，以供高壓液相色譜分析用。
2、色譜采用Waters Associates Model 510泵的帶有一徑向壓縮柱(Waters Novapak CN.8mm×10cm，4μm的大小顆粒)和一個氰基(Waters Resolve Guard-pak CN)前置柱。利用可變波長的紫外光檢測器(Waters 484)在302nm波長檢測。移動相(體積比)15%的乙腈10%的甲醇75%的各為0.01M的1-庚磺酸和磷酸一鈉。在室溫下流速保持在恒定的2.0ml/分，借助一個可編程序的取樣器順序地自動地注入樣品。(Waters WISP 712)
3、數據分析所有數據的獲得是用Waters Maxima 820系統(tǒng)來完成的，藥物峰高對內部標樣藥劑的濃度的峰高比對在標準構成日常方法標準化中加入的血漿中的濃度的峰高進行線性一致分析。從該線性回歸線的內插法，確定在質量對照和未知分析樣品中氨基胍的濃度。
4、結果和討論以每天為基礎，在游離的氨基胍濃度為0-10μg/ml范圍內觀察到線性(r＞0.998，p＜0.01)濃度最小的標樣(0.05μg/ml)可被穩(wěn)定地測出。圖1概括了從這些研究中得到的標準曲線數據，并表明平均峰高的比特性曲線和血漿濃度關系曲線。在這個研究中，從兩個分析者得到的標準曲線本質上是重疊的，因而圖是用總平均數據給出的。
從色譜的角度來看，6-甲基甲基吡啶醛脒腙(AGH)和6-甲基甲基吡啶醛-N-乙基脒腙(NEH)，這兩種在反應期間同甲基吡啶醛(6-甲基-2-吡啶-羰基醛)生成的兩個加合物易于彼此和從內生的干擾物中分離出來。圖2示出了一個人的空白血漿樣品色譜圖，一個低濃度(0、1μg/ml)質量的對照樣品色譜圖和一個高濃度(8μg/ml)的質量對照樣品色譜圖。
對每個試驗中的隨時間有明顯較小不同，如用標準曲線的予先質量對照試驗與標準曲線過后的質量對照試驗(數據未給出)，所示這種變化的原因可能歸因于有機溶劑對各種移動相水平的分配(色譜時移動相沒有攪拌)或因過夜運行時溫度波引動起的，但是在進行真實的生物樣品實際分析時，這些問題可以通過在整個試驗中緩慢連續(xù)攪拌移動相使標樣和質量對照樣品分散開來解決。因此對于這個研究使對所有的標樣的數據號(予先的和后來的質量對照)的回歸分析能充分模擬隨機分散標樣曲線上的結果。
三組被測試組的全部血漿質量對照樣品(質量對照樣品A-D的游離氨基胍的濃度分別為0.1，0.8，2.0和8.0μg/ml)，試驗數據匯總在下面的表Ⅰ中



誤差%＝100%×(觀測濃度-理論濃度)/(理論濃度)QC＝質量對照參看表Ⅰ，根據系數誤差確定人血漿的測定精度(用體積百分比表示)的范圍在所研究的濃度(0.1-8μg/ml)范圍內從3.6%-12.9%(總平均值＝6.5%)。根據與理論濃度的百分誤差測出的準確度的范圍從-0.90%到-5.8%(總平均值3.6%)對于從生物分析的觀點上看，這已是相當令人滿意的結果了。
動物血漿的質量對照樣品(狗和鼠的)每天要用含水的氨基胍溶液注入到動物的空白血漿中的辦法來組成。這樣作的目的是為了評價測定來自小動物研究樣品的可行性。對于這些小動物來說要配制大量的血漿標準是有困難的。
就狗血漿質量對照樣品的測定精度來說，總平均的系數變差為9.7%(范圍8.2%到10.6%)。而就準確度來說與理論濃度總平均百分偏差為-2.6%(范圍-7.0%到1.8%)。
鼠血漿質量對照樣品的測定精度平均為8.7%體積濃度(范圍5.6%到13.3%)，而與理論濃度的平均百分偏差為1.5%(范圍-3.8%到9.1%)。
在現(xiàn)行的分析條件下，如果血漿樣品中被測得的游離氨基胍的濃度超過10μg/ml，則需要用人(或相應的動物)空白血漿稀釋，然后重新測定以使樣品的響應在標樣曲線的線性范圍內(0.05-10μg/ml)。應該把內推法氨基胍濃度少于0.05μg/ml的樣品稱為“NR”(不能報告的)，在進一步計算中(如藥物動力學，統(tǒng)計學等)作為零對待。
這個研究的結果表明，這個發(fā)展的高壓液相色譜分析方法的具有重復性，準確和穩(wěn)定，對于三組所有血漿樣品的總平均變差系數(精度)少于10%，總平均準確度在理論值的4%之內。分析穩(wěn)定性經兩個分析者在三天的確認期間非常好的結果，是很好的證明，在其中可檢測加合物，對一整天看來是穩(wěn)定的，從而可使或批樣品的處理簡化和高生產率地分析，利用人血漿標準曲線可成功地分析動物血漿的氨基胍濃度對于采用這個程序的未來的分析者可以予期得到10%的精度和5%的準確度標準。
總之，本分析方法在人、狗和鼠血漿中令人滿意地被確認。
例2這個試驗計劃按照類似于例1的方案進行，以便進一步證實本分析方法對于尿樣品測定的準確度、可操作性。兩個分析者利用一個HPLC系系統(tǒng)，獨立繪制一人尿標樣曲線和對四個已知的質量對照樣品反復四次作高壓液相色譜分析，每個工作日連續(xù)二天以便完成特定的分析操作規(guī)范。
分析方法1、樣品制備將0.5ml工作內標溶液(在7.5%三氯乙酸中10μg/mlN-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽)和在干凈螺旋塞培養(yǎng)管中0.5ml的含水(10mg/ml)溶液的反應試劑(6-乙基-2-吡啶-羰基醛)加到0.5ml的尿樣品中。將樣品蓋緊，旋渦(10秒)然后在加熱器(95°-100℃)上反應10分鐘，在冷卻后將樣品輸送到一個高壓液相色譜儀的管瓶中，從中50μl一份被注射用于高壓液相色譜儀分析用。
2、色譜法利用一個Waters Associates Model 510泵并帶有一個徑向加壓的柱(Waters Novapak CN，8mm×10cm，4μm顆粒大小)和一個氰基(Waters Resolve Guard-Pak CN)前置柱。用可變紫外光檢測器(Waters 484)在302μm波長檢測樣品的成份。移動相包括(體積比)10%乙腈10%的甲醇各0.01M的1-庚磺酸和磷酸-鈉80%。在整個試驗中，借助磁攪拌器緩慢地攪拌移動相防止有機溶劑分配。保持均勻的流速2.0ml/分，在室溫下。經一個可編程的取樣器順序自動注入樣品(Waters WISP 712)。
3、數據分析利用Waters Maxima 820色譜操作臺收集所有數據，由分析者利用線性試驗校正藥劑峰高和內部標樣峰高的比值同在標準構成日常的方法標準化中加入尿中的濃度關系，從線性回歸線內插法來確定在質量對照和未知的被測定樣品中的氨基胍濃度。
結果和討論以天為基準，被觀察到的線性(r＞0.998，p＜0.01)是在游離氨基胍的濃度0-100μg/ml的范圍內，最低標準樣品(0.5μg/ml)可以被穩(wěn)定檢測出。圖3匯總了從這個研究中標樣曲線數據，并示出了平均峰高比響應同血漿濃度關系曲線。和例1相同，由兩個分析者在這次研究中得到的標樣曲線基本上是可重疊的，因此總平均數據繪制成曲線。
從色譜的觀點來看，6-甲基甲基吡啶醛脒基腙(AGH)和6-甲基甲基吡啶醛-N-乙基脒基腙(NEH)，在同甲基吡啶醛(6-甲基-2-吡啶-羰基醛)反應期間生成的這兩種加合物易于彼此或從內生干擾物中分離出來。圖4示出人的空白尿的色譜，一個低濃度(1.0μg/ml)質量對照樣品的色譜和一個高濃度(90μg/ml)質量對照樣品的色譜。
和例1的分析結果相同，如用標樣樣品予先質量對照試驗同標準樣品曲線以后質對照試驗結果(數據未示出)的關系所示，二者隨時間的在每個試驗結果中記下了較小不同。引起這些變化可能是由于在夜間試驗中試驗室溫度波動引起的，這些可能的溫度波動對保留時間有很大的影響，然而感興趣的峰仍能有效地彼此以及與其他無關峰分開，這些峰容易檢測和積分。和例1相同，這些問題將通過在整個試驗中分散標樣和質量對照樣品最終得到平衡，因而對這個研究，對所有標樣點進行回歸分析可以充分模擬結果。
人尿的質量對照樣品(對于質量對照樣品A-D游離氨基胍的濃度分別為1.0，8.0，40和90μg/ml)結果匯總在下面的表Ⅱ中。

誤差%＝100%×(觀測濃度-理論濃度)/理論濃度QC＝質量對照利用m′(強制通過原點的回歸斜率n＝14)計算質量對照的濃度以便獲得最大的準確度。為確定未知的濃度，所給出的全部結果是用m′表示的。根據變差系數(用體積百分濃度)在所研究的濃度范圍(1.0-40μg/ml)測量的精度的范圍為1.8%到6.8%(總平均＝4.9%。用與理論濃度的百分誤差測量的準確度的范圍為-6.7%到15.5%(總平均＝4.8%)這對于生物分析觀點來說已是相當令人滿意的結果了。
在現(xiàn)行的分析條件下，如被分析樣品的游離氨基胍的濃度超過100μg/ml，則應用人(或相應的動物)空白尿來稀釋，然后重新分析，以便使樣品的響應在標樣曲線的線性范圍(0.5-100μg/ml)內。對內推的氨基胍濃度小于0.5μg/ml樣品應該被認為“NR”(不報告)在進一步計算中(如藥物動力學、統(tǒng)計學)以零對待。
這個研究的結果進一步證明了本分析方法是可重復的，準確的和穩(wěn)定的，以及對尿樣品是適用的。對人尿的總平均變差(精度)系數小于5%，總平均準確度在理論濃度5%以內。分析的穩(wěn)定性兩個試驗者在兩天確認期間所得到的結果證明是優(yōu)良的。在其中可檢測的加合物在一整天中看來是穩(wěn)定的，這樣就便于樣品的成批處理和高生產率的分析。予計利用這個確認程序的未來分析者可以期望得到5%的精度和5%準確度的標準。
例3為了說明本方法在測量腎功能中的應用，使一組19個試驗對象服用總劑量為300mg的鹽酸氨基胍。在病人服用這個總劑量后，按照規(guī)定的服用后10小時，14小時和18小時，依次從每個病人處取出血漿樣品，這些血漿被取出后，按例1的操作方案進行處理再用本發(fā)明的方法分析。
首先將這此樣品同一定量的在7.5%三氯乙酸中N-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽內部標準工作溶液相混合，將得到的試樣經10秒鐘旋渦處理，然后在14000rpm速度下離心分離10分鐘。將得到的上層清液倒入裝有0.1ml含水溶液(10μg/ml)的6-甲基吡啶醛的培養(yǎng)管中。再將這些樣品用蓋子蓋緊，在加熱器上反應10分鐘，待冷卻后，轉移到高壓液相色譜的管瓶中，從管瓶把等分的樣品供給高壓液相色譜分析。
利用一個等流量在離子對條件下的徑向加壓的色譜柱，測量是借助一個可變紫外檢測器在波長302nm完成的，利用所獲得數據并通過下式，把計算的消除率轉換為消除半衰期數據。
T1/2＝0、6931/Kelim然后，把這些數據相對于用放射性示蹤法測量的病人腎小球濾過率繪制成曲線，利用二者之間最后的線性關系式根據公式T1/2＝-0.14GFR+22.04(r＝0.875，n＝18)計算腎小球濾過率。然后對每個病人推導出T1/2和GFR的對應數值，這些數值列在下面表Ⅲ中表Ⅲ病人 GFR 氨基胍T1/21 12.8 24.592 52.4 14.193 116.3 3.83
4 44.1 21.755 31.1 19.046 80.5 6.787 26.7 14.838 12.1 24.919 117.2 4.7310 148.9 3.9411 111.9 6.8212 103.8 6.0813 41.6 14.9214 39.2 9.5415 113.2 4.8116 82.2 6.0318 131.3 7.0519 131.1 6.46此外，這些數據被整理成表格形式，并示在圖5中，從這些列出的數據中可以發(fā)現(xiàn)十分一致和一個線性關系存在，可以測定氨基胍的消除以及確定相應的正常腎功能。因而氨基胍T1/2值在腎功能中用作鑒定反常，根據這個腎功能結果可以確定腎損傷和/或潛在的病理狀態(tài)。
本發(fā)明可以包括另外的形式或在不背離本發(fā)明的精神或主要特征的條件下通過其它方法完成。因此，本說明書只是為對所有的方面進行說明，而不是對這些方案的限定。本發(fā)明的范圍由權利要求書限定，所有的在相等意義和范圍內變化都應在本發(fā)明范圍內。
權利要求
1.一種分析氨基胍及其類似物的方法，它包括A、收集確信包含有氨基胍或其類似物的生物樣品；B、脫去該生物樣品中的蛋白質；C、使在步驟B中脫去蛋白質的生物樣品同足夠量的吡啶醛反應，以使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物全部生成相應的吡啶醛一取代腙；D、借助于利用均勻或梯度洗脫的高壓液相色譜法從步驟C中生成的反應混合物的剩余物中分離全部取代腙；E、檢測步驟D中的分離物，以便估價該氨基胍和/或類似物的數量和分布。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品可以從血漿、尿和組織中選取。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品根據一個已知相等含量的內標來制備。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該內標可以從氨基胍和其類似物中選取。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該內標由氨基胍組成。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該內標由N-乙基氨基胍組成。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品用從中等強度酸到強酸、以及可以沉淀蛋白質的有機溶劑中選取的脫去蛋白質試劑處理，來脫去蛋白質。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，該酸從高氯酸和三氯乙酸中選取。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，該有機溶劑從甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品通過使該樣品經超過濾處理來脫去蛋白質。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該吡啶醛是甲基吡啶醛。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，該吡啶醛是6-甲基甲基吡啶醛。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C是在中等強度酸的條件下完成的。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D的高壓液相色譜法的方案是利用徑向壓縮色譜柱和等流量以及離子對條件下進行。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟E的檢驗包括用紫外分光光譜在302nm波長分析分離出物質，檢測所有的氨基胍和/或其類似物。
16.用于完成分析氨基胍及其類似物的測試器材箱，包括A、一定數量的用于和可得到的氨基胍或類似化合物反應的吡啶醛;B、用在高壓液相色譜中的其它試劑和固定液;C、使用這些器材的指南。
17.如權利要求16所述的測試器材箱，進一步包括一定數量用于脫去該生物樣品中蛋白質的試劑。
18.如權利要求16所述的測試器材箱，包括一個從氨基胍及其類似物中選定的內標。
19.如權利要求18所述的測試器材箱，其特征在于該內標是氨基胍。
20.如權利要求18所述的測試器材箱，其特征在于該內標是N-乙基氨基胍。
21.如權利要求16所述的測試器材箱，其特征在于借助于從由中等強度酸到強酸，以及可以沉淀蛋白質的有機溶劑中選取脫去蛋白質試劑來脫去該生物樣品中的蛋白質。
22.如權利要求21所述的測試器材箱，其特征在于該酸從高氯酸和三氯乙酸中選取。
23.如權利要求21所述的測試器材箱，其特征在于該有機溶劑從甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。
24.如權利要求16所述的測試器材箱，其特征在于該生物樣品是超過濾處理該樣品來脫去蛋白質的。
25.如權利要求16所述的測試器材箱，其特征在于該吡啶醛是甲基吡啶醛。
26.如權利要求16所述的測試器材箱，其特征在于該吡啶醛是6-甲基甲基吡啶醛。
27.用于測量腎功能的權利要求16所述的測試器材箱，還包括一定數量的予先確定的適合于試驗對象服用劑型的氨基胍或其類似物;一個商值曲線或表格形式的連續(xù)集，該商值是根據氨基胍或其類似物的消除半衰期(T1/2)與腎小球濾過率(GFR)的比率得出的，據此可以向診斷者和臨床醫(yī)生提供解釋腎功能測試結果。
28.如權利要求27所述的測試器材箱，該預先確定的劑型是口服劑型。
29.如權利要求28所述的測試器材箱，其特征在于該口服劑型是從藥丸、糖果劑、膠囊、糖衣丸、甘香酒劑、糖漿中選取的。
30.如權利要求29所述的測試器材箱，其特征在于該口服劑型含有300mg鹽酸氨基胍或其類似物。
31.一種監(jiān)測哺乳動物腎功能的方法，包括服用由氨基胍和其類似物中選取的主試劑一確定劑量，在規(guī)定的時間間隔從所述哺乳動物收集血漿樣品，檢驗這些樣品，以便確定該主試劑的存在和分布。
32.如權利要求31所述的方法，還包括(1)用下述方法檢驗這些樣品A、收集確信含有氨基胍或其類似物的生物樣品;B、脫去該生物樣品中的蛋白質;C、使在步驟B中脫去了蛋白質的生物樣品同足量的吡啶醛反應，以便使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物全部轉換成相應的吡啶醛-取代腙;D、借助于使用均勻或梯度洗脫的高壓液相色譜法從步驟C中反應混合物的剩余物中分離出形成的所有取代腙;E、檢驗在步驟D中的分離出的物質，以便估價所述氨基胍和/或其類物的數量和分布;(2)根據所得結果確定氨基胍和/或其類物的消除半衰期;以及(3)把這些確定的消除數據與從各種已知腎功能的哺乳動物得到氨基胍的消除數據圖或表格連續(xù)集比較。
33.完成權利要求31所述方法的測試器材箱包括A、從氨基胍和其類似物中選取的一種主試劑的固定劑量;B、其他試劑和固定液;C、這些器材的使用說明。
34.一種檢測與腎功能改變有關疾病的出現(xiàn)或存在的方法，包括完成權利要求31或32的方法。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于該疾病是腎病和糖尿病。
36.一種監(jiān)測抑制過強的糖基化最終產物在人體中生成的藥物療效的方法，包括完成權利要求1的方法。
37.一種篩選可以抑制在人體內過強糖基化最終產物形成的新化合物培育的生物樣品，確定吸收、分布、代謝和/或排泄的簡況，并用權利要求1的方法檢驗該樣品。
全文摘要
公開了用于檢測和測量在生物樣品中氨基胍和其類似物的存在和數量的方法和包括試驗器材箱的有關材料。生物樣品包括血漿、尿或組織。本方法可以用于確定氨基胍和其類似物的活性和效果，物別是對這些材料用作防止過強的蛋白質糖化作用的試劑程度。本發(fā)明擴展到新藥分析、適用的試驗器材箱，并擴展到評價腎功能和幫助在腎機能障礙是癥狀的潛在病狀的診斷中的可能性。
文檔編號G01N33/53GK1055063SQ9110178
公開日1991年10月2日 申請日期1991年2月20日 優(yōu)先權日1990年2月20日
發(fā)明者彼得·C·烏爾里希, 齊·M·盧克 申請人:杰里科技有限公司