本發(fā)明屬于犬心臟損傷的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在犬中，亦稱為粘液性二尖瓣變性(mmvd)、退行性二尖瓣疾病(dmvd)、瓣膜退行性疾病(vdd)或瓣膜病的瓣膜性心臟病(vhd)，是由于心瓣膜的變性或病變而導(dǎo)致的常見心臟病。這種變性通常與瓣膜的不可滲透性有關(guān)，而瓣膜的不可滲透性又導(dǎo)致每次心跳時(shí)心耳中的血液回流。這導(dǎo)致送入動(dòng)脈的血液量減少，從而導(dǎo)致二尖瓣厚度大量增加。vhd的功能性后果是增加了對(duì)心肌的體積和/或壓力負(fù)荷，導(dǎo)致心力衰竭及其后果：呼吸短促(或呼吸困難)、咳嗽、腎衰竭或肺水腫。此外，遺傳、壓力、焦慮、缺氧、感染或內(nèi)分泌失調(diào)會(huì)使該病惡化。在犬中，瓣膜病的退行性改變的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成和沉積，破壞了小葉和腱索中的膠原含量和組織(患有粘液性二尖瓣變性的犬中血小板、血漿、二尖瓣小葉和左心室心肌組織中的血清素濃度，se?cremer等，j?vet?intern?med?2014；1-3)。mmvd主要影響像騎士查理王犬、約克夏犬、貴賓犬之類的小型犬。

2、心肌肌鈣蛋白(ctnt)是一種結(jié)構(gòu)蛋白，存在于肌原纖維細(xì)絲中，有3種不同結(jié)構(gòu)的亞單位，肌鈣蛋白t(ctnt)、肌鈣蛋白i(ctni)、肌鈣蛋白c(ctnc)，均由不同基因所編碼。其中ctnt是心臟的特異性抗原，在心肌內(nèi)以游離和結(jié)合兩種形式存在，含量豐富。當(dāng)心肌受損時(shí)便迅速釋放入血，血中半衰期為120min，其釋放動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是血中出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，峰值濃度高。作為心肌損傷的標(biāo)志物，它的種屬特異性非常強(qiáng)，與骨骼肌肌鈣蛋白幾乎不發(fā)生交叉反應(yīng)。ctnt因其高度心肌特異性、高敏感度、診斷的早期性而被認(rèn)為是目前反映心肌損傷最好的直接病理學(xué)血清標(biāo)志物之一，其診斷價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了以往的含m和b亞基的肌酸磷酸同工酶(ckmb)等。因此，測(cè)定血清ctnt濃度可反映心肌受損的嚴(yán)重程度。在危重病早期即存在較高比例的心肌損傷，認(rèn)為心肌損傷與復(fù)蘇患者高死亡率有關(guān)。心跳驟停后復(fù)蘇成功率較低，既往的研究表明心肌損傷是造成心肺復(fù)蘇成功后患者早期死亡的主要原因之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒及應(yīng)用。

2、本發(fā)明目的之一提供檢測(cè)犬心臟損傷的探針，包括：

3、探針p208a-1：biotin-tttttttttacaagctttttgctcgtcttatcccccc-fam,?seq?idno:3；

4、探針p208b：

5、biotin-tttttttttacaaaccttttgttcgtcttattttttttttttttttttttttttttttttt-fam,?seq?id?no:4。

6、本發(fā)明目的之一提供檢測(cè)犬心臟損傷的偶聯(lián)物，包括鏈霉親和素包被的納米磁珠及偶聯(lián)于所述納米磁珠上的所述的探針。

7、其中，所述偶聯(lián)物的制備方法包括：

8、將洗滌干凈的鏈霉親和素包被的納米磁珠于緩沖液ii中重懸，加入如權(quán)利要求1所述的探針于恒溫?fù)u床上輕微震蕩，孵育20min；

9、將得到的孵育產(chǎn)物進(jìn)行磁分離，棄去上清液，所得沉淀用緩沖液ii洗滌，去除未結(jié)合的探針，再加入1ml6%bsa封閉液，反應(yīng)2h；

10、產(chǎn)物用pbs緩沖溶液洗滌，再用100μl結(jié)合緩沖液ii重懸，得到的納偶聯(lián)物于4℃保存。

11、其中，緩沖液ii為10?mm?tris-hcl，1.0?mm?edta，2.0?m?nacl，ph?7.5。

12、本發(fā)明目的之一提供檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒，包括所述探針或所述偶聯(lián)物及雙鏈特異性核酸切割酶。

13、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：緩沖液i：5.0?mm?tris-hcl，0.5?mm?edta，1.0?mnacl,?ph?7.5；緩沖液ii：10?mm?tris-hcl，1.0?mm?edta，2.0?m?nacl，ph?7.5；雜交緩沖液：50?mm?tris-hcl，25?mm?mgcl2，ph?8.0；te緩沖液：10?mm?tris-hcl，1?mm?edta-2na，12.5?mm?mgcl2，ph?8.0；醋酸鈉緩沖液：0.1?m?醋酸鈉，0.1m醋酸，ph?3.5。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括鏈霉親和素修飾的納米磁珠。

14、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：流動(dòng)相a相：30mm磷酸二氫銨+10mm四丁基溴化銨+10mm?l-3-溴樟腦磺酸胺和5%乙腈水溶液；流動(dòng)相b相：甲醇＋10mm、四丁基磷酸二氫銨。

15、本發(fā)明目的之一提供檢測(cè)犬心臟損傷的方法，包括：

16、將所述偶聯(lián)物與待測(cè)樣本充分混合，于40°c孵化180min后，用磁鐵將磁珠和未反應(yīng)的dna探針從溶液中分離出來(lái)；

17、將上清液注入hplc系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，hplc系統(tǒng)包括：采用purospher?star?rp-18封端柱(150?mm×4.6?mm?i.d.，5μm)用于mirna的分離，柱溫保持在35°c；熒光檢測(cè)器設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為495nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm；流速為1ml/min；進(jìn)樣量為2μl；進(jìn)行相同的梯度洗脫：采取梯度洗脫：b?相的比例在?20?min?內(nèi)從?10%變化到?60%；流動(dòng)相a相：30mm磷酸二氫銨+10mm四丁基溴化銨+10mm?l-3-溴樟腦磺酸胺和5%乙腈水溶液；流動(dòng)相b相：甲醇＋10mm的四丁基磷酸二氫銨。

18、本發(fā)明目的之一提供所述探針或所述偶聯(lián)物在制備檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒中的應(yīng)用。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

20、本發(fā)明提供的探針能夠被偶聯(lián)至磁珠表面形成偶聯(lián)物，便于對(duì)mirna-208a和mirna-208b同時(shí)檢測(cè)。

21、本發(fā)明提供的偶聯(lián)有探針的偶聯(lián)物能夠在dsn的輔助下，實(shí)現(xiàn)循環(huán)擴(kuò)增，快速捕捉目標(biāo)mirna。

22、本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒對(duì)目標(biāo)mirna具有高度匹配性，能夠?qū)瓜嚓P(guān)錯(cuò)配序列及其他rna序列的干擾。

23、本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒能夠?qū)θ鍢颖具M(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)血清檢測(cè)結(jié)果判斷犬心臟損傷情況，其準(zhǔn)確度高于常規(guī)方法。

技術(shù)特征：

1.檢測(cè)犬心臟損傷的探針，其特征在于，包括：

2.檢測(cè)犬心臟損傷的偶聯(lián)物，其特征在于，包括鏈霉親和素包被的納米磁珠及偶聯(lián)于所述納米磁珠上的如權(quán)利要求1所述的探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的偶聯(lián)物，其特征在于，其制備方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物，其特征在于，緩沖液ii為10?mm?tris-hcl，1.0?mmedta，2.0?m?nacl，ph?7.5。

5.檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒，包括如權(quán)利要求1所述的探針或權(quán)利要求2~4任一所述的偶聯(lián)物及雙鏈特異性核酸切割酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，還包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，還包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，還包括：鏈霉親和素修飾的納米磁珠。

9.檢測(cè)犬心臟損傷的方法，其特征在于，包括：

10.權(quán)利要求1所述的探針在制備檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于犬心臟損傷的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)犬心臟損傷的試劑盒及應(yīng)用。該試劑盒包括探針、偶聯(lián)物或試劑盒能夠在DSN的輔助下，實(shí)現(xiàn)循環(huán)擴(kuò)增，快速捕捉目標(biāo)miRNA。本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒能夠?qū)θ鍢颖具M(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)血清檢測(cè)結(jié)果判斷犬心臟損傷情況，其準(zhǔn)確度高于常規(guī)方法。

技術(shù)研發(fā)人員：黃挺,李杰,孫堯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上?；`生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6