本發(fā)明屬于飼料檢測(cè)的，具體涉及一種飼料中農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素殘留的快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、隨著畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，也帶動(dòng)了飼料產(chǎn)業(yè)發(fā)展。飼料的加工、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中也極易受到各種真菌污染從而產(chǎn)生各種真菌毒素，其生產(chǎn)使用的農(nóng)作物等原材料還存在農(nóng)藥殘留的污染。這些農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素類(lèi)的殘留，不僅影響動(dòng)物健康，也對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成威脅。通過(guò)檢測(cè)，有助于確保飼料產(chǎn)品符合法規(guī)要求，可以防止含有禁用藥物的飼料進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，從而提高畜禽等產(chǎn)品的質(zhì)量，利于控制耐藥性發(fā)展，保護(hù)消費(fèi)者健康，促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展，有助于提高我國(guó)畜禽產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。

2、飼料的原材料和飼料中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法少，基本上參照食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法或者針對(duì)特殊類(lèi)型的飼料進(jìn)行單獨(dú)的優(yōu)化改良。由于獸藥種類(lèi)繁多，檢測(cè)方法可能無(wú)法覆蓋所有可能的殘留物，導(dǎo)致某些獸藥殘留物的檢測(cè)被忽視。快速檢測(cè)方法雖然操作簡(jiǎn)便，但在準(zhǔn)確性和靈敏度上存在不足。真菌毒素的檢測(cè)方法面臨樣品前處理復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度和特異性不足的問(wèn)題。近年來(lái)，使用高分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行飼料殘留分析變得越來(lái)越流行，該技術(shù)可以監(jiān)測(cè)各種潛在污染物和殘留物，包括農(nóng)藥、獸藥和天然毒素。全掃描分析理論上可以在單次分析中篩選無(wú)限數(shù)量的化合物，掃描范圍廣，必定損失靈敏度，尤其是大部分低限值的藥物靈敏度不夠，檢測(cè)限達(dá)不到限量要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種飼料中農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素殘留的快速檢測(cè)方法，所述快速檢測(cè)方法通過(guò)優(yōu)化樣品提取技術(shù)，結(jié)合納米材料輔助的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽畜飼料中420種農(nóng)藥、163種獸藥及其代謝物和13種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性和速度，同時(shí)降低成本和操作復(fù)雜性，大大降低了檢測(cè)工作強(qiáng)度，降低了檢測(cè)成本，使用的試劑量少，對(duì)人和環(huán)境友好。

2、具體技術(shù)方案如下：

3、一種飼料中農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素殘留的快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：采用甲醇、乙腈和異丙醇的混合提取液，依次在堿性條件和酸性條件下對(duì)試樣進(jìn)行提取，經(jīng)混合、固相萃取吸附劑凈化后，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下檢測(cè)，通過(guò)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法定量，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)飼料中420種農(nóng)藥、163種獸藥及其代謝物和13種真菌毒素同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析；

4、所述固相萃取吸附劑包括n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑。

5、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明采用甲醇、乙腈常規(guī)提取溶劑的基礎(chǔ)上，加入異丙醇，增加溶劑和試樣的相融性，配合酸性混合溶液和堿性混合溶液，提取飼料中更多酸堿性不同、極性不同的更多類(lèi)型和種類(lèi)的殘留化合物，經(jīng)n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑有效凈化，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，達(dá)到充分提取、徹底凈化、有效分離、高靈敏度檢測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)了10分鐘內(nèi)同時(shí)檢測(cè)飼料中420種農(nóng)藥、163種獸藥及其代謝物和13種真菌毒素。

6、進(jìn)一步，所述混合提取液為甲醇、乙腈和異丙醇等體積混合均勻，所述混合提取液中分別添加堿性調(diào)節(jié)劑和酸性調(diào)節(jié)劑，依次對(duì)試樣進(jìn)行提取。

7、進(jìn)一步，所述堿性調(diào)節(jié)劑包括氨水，所述氨水的添加量占混合提取液體積分?jǐn)?shù)的1.0%~4.0%；所述酸性調(diào)節(jié)劑包括甲酸，所述甲酸的添加量占混合提取液體積分?jǐn)?shù)的0.2%~2.0%。

8、進(jìn)一步，所述提取方式為酸堿溶液共同提取，試樣先用含堿性調(diào)節(jié)劑的氨化混合提取液渦旋振蕩進(jìn)行第一次提取，再用含酸性調(diào)節(jié)劑的酸化混合提取液渦旋振蕩進(jìn)行第二次提取，兩次提取液合并，混合均勻，得待凈化提取液。

9、進(jìn)一步，每次提取使用的混合提取液的用量相等，混合提取液的用量各為10.0毫升，渦旋振蕩的提取時(shí)間為5分鐘~10分鐘。

10、進(jìn)一步，所述凈化包括如下步驟：首先將n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑混合后，填于注射器式固相萃取柱中壓實(shí)，使用前分別用乙腈、甲醇和待凈化提取液潤(rùn)洗，注入空氣，排空液體，然后吸取待凈化提取液，過(guò)萃取柱，收集凈化液，過(guò)有機(jī)濾膜。

11、進(jìn)一步，所述n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑的質(zhì)量比為1：1~2。

12、進(jìn)一步，每毫升待凈化提取液的固相萃取吸附劑的用量為30毫克~50毫克。

13、進(jìn)一步，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)時(shí)，采用核殼色譜柱，流動(dòng)相a為2mm甲酸銨的水溶液（含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸），流動(dòng)相b為2mm甲酸銨的甲醇溶液，采用梯度洗脫方式，流速為0.5ml/min，進(jìn)樣體積為2μl，進(jìn)樣時(shí)間為10min。

14、進(jìn)一步，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)時(shí)，離子源為電噴霧電離源esi，采用極性切換正負(fù)離子同時(shí)掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。

15、更進(jìn)一步，一種飼料中農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素殘留的快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：

16、（1）試樣的稱(chēng)量：準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎均勻的試樣，若試樣的水分含量小于50%，則稱(chēng)取2.0克，然后加3.0ml水；若試樣的水分含量大于50%，則稱(chēng)取5.0克；

17、（2）混合提取液的配制：

18、混合提取液一的配制：先將甲醇、乙腈、異丙醇等體積混合，加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%~4.0%的氨水混合均勻，得混合提取液一；

19、混合提取液二的配制：先將甲醇、乙腈、異丙醇等體積混合，加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%~2.0%甲酸混合均勻，得混合提取液二；

20、（3）試樣的提?。合蚍Q(chēng)取好的試樣中先加入10毫升混合提取液一，以2000~2500轉(zhuǎn)每分鐘渦旋振蕩提取5分鐘~10分鐘，8000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘~10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至刻度比色管中，剩余殘?jiān)俅渭尤?0毫升混合提取液二重復(fù)提取，合并兩次提取液，并用乙腈定容至刻度至25毫升，得待凈化提取液；

21、（4）提取液的凈化：首先將n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑按照質(zhì)量比1：1~2混合后，得固相萃取吸附劑，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取固相萃取吸附劑30毫克~50毫克，填于1毫升的注射器式固相萃取柱中壓實(shí)備用，使用前分別用1.0毫升乙腈、1.0毫升甲醇和1.0毫升待凈化提取液潤(rùn)洗，注入空氣，排空液體，然后吸取待凈化提取液1.0毫升，過(guò)萃取柱，收集凈化液，過(guò)0.22μm聚四氟乙烯有機(jī)濾膜；

22、（5）超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（uplc-ms/ms）分析：使用的分離色譜柱為cortecs?premier?t3核殼色譜柱，內(nèi)徑2.1毫米，粒徑2.7微米，柱長(zhǎng)100毫米，流動(dòng)相a為2mm甲酸銨的水溶液（含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸），流動(dòng)相b為2mm甲酸銨的甲醇溶液，采用梯度洗脫方式，流速為0.5ml/min，進(jìn)樣體積為2μl，進(jìn)樣時(shí)間為10min；離子源為電噴霧電離源esi，采用極性切換正負(fù)離子同時(shí)掃描，離子源溫度為150℃，毛細(xì)管電壓為0.5~1.5千伏，去溶劑氣溫度為400~450℃，去溶劑氣流速為900~1100升每小時(shí)，噴霧氣流速300升每小時(shí)，錐孔反吹氣流速150~300升每小時(shí)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下檢測(cè)，通過(guò)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)飼料中農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

24、（1）本發(fā)明采用甲醇、乙腈常規(guī)提取溶劑的基礎(chǔ)上，加入異丙醇，增加溶劑和試樣的相融性，配合酸性有機(jī)混合溶液（酸性調(diào)節(jié)劑）和堿性有機(jī)混合溶液（堿性調(diào)節(jié)劑），提取飼料中更多酸堿性不同、極性不同的更多類(lèi)型和種類(lèi)的殘留化合物，經(jīng)n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料和十八烷基化硅膠c18吸附劑有效凈化，核殼色譜柱的有效分離，高靈敏度極性切換正負(fù)離子同時(shí)掃描，達(dá)到充分提取、徹底凈化、有效分離、高靈敏度檢測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)了10分鐘內(nèi)同時(shí)檢測(cè)飼料中420種農(nóng)藥、163種獸藥及其代謝物和13種真菌毒素；

25、（2）本發(fā)明提供的快速檢測(cè)方法定量限在0.01微克每千克到50微克每千克，模擬添加回收率76.3%～99.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.7%，方法穩(wěn)健度高，通用性強(qiáng)，簡(jiǎn)單方便快捷，成本低，所用試劑少，對(duì)人和環(huán)境友好，屬于一種環(huán)境友好的綠色化學(xué)分析方法；

26、（3）甲醇和乙腈作為常規(guī)的提取溶劑，經(jīng)常被用于農(nóng)獸藥和真菌毒素等的提取，本發(fā)明中，異丙醇的加入增加了溶劑和試樣的相融性；混合提取液中的添加劑甲酸或氨水的加入，改變了混合提取液的ph值，能夠穩(wěn)定目標(biāo)物，增加目標(biāo)物的溶解性，依次通過(guò)堿性和酸性兩步提取，能夠更多的提取試樣中的殘留農(nóng)獸藥和真菌毒素；

27、（4）典型的固相萃取材料有c18鍵合硅膠、石墨化碳黑、n-丙基乙二胺（psa）、氧化鋁、高分子聚合物、多壁碳納米管等，應(yīng)用在農(nóng)藥殘留檢測(cè)、獸藥殘留檢測(cè)中，用于吸附各種雜質(zhì)和基質(zhì)干擾物，還有用陰陽(yáng)離子吸附劑，利用離子交換技術(shù)用于吸附特定類(lèi)型的化合物，然后再利用離子強(qiáng)弱的變化，使得目標(biāo)物得以富集和洗脫；一些專(zhuān)用型材料如分子印跡技術(shù)材料，受體-抗體作用機(jī)理用于捕捉提取液中某種或某類(lèi)化合物，其專(zhuān)一性更強(qiáng)，但不適用于多類(lèi)型的目標(biāo)物的分析；

28、飼料中的基質(zhì)更為復(fù)雜，各種金屬離子、有機(jī)小分子聚合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些復(fù)雜的成分可能引起儀器污染、信號(hào)干擾和基質(zhì)效應(yīng)等一系列問(wèn)題；納米表征技術(shù)是高新材料基礎(chǔ)理論研究與實(shí)際應(yīng)用交叉融合的技術(shù)，在納米表征技術(shù)下，磁性納米材料的應(yīng)用日顯勃勃生機(jī)；

29、本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，對(duì)比上述吸附材料，發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)n-乙烯基苯修飾的四氧化三鐵功能化磁性納米吸附材料，能夠有效吸附飼料中的金屬離子、有機(jī)小分子聚合物和蛋白質(zhì)，十八烷基化硅膠c18對(duì)各種飼料中的脂質(zhì)有較強(qiáng)的吸附能力，通過(guò)添加回收使用證實(shí)，其混合的質(zhì)量比為1：1~2，作為固相萃取吸附劑，使用量為30毫克~50毫克每毫升待凈化提取液，凈化時(shí)不會(huì)對(duì)農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素產(chǎn)生過(guò)多的吸附和干擾，同時(shí)儀器的信號(hào)干擾和基質(zhì)效應(yīng)能達(dá)到最低水平，滿足方法正確度的要求；

30、（5）本發(fā)明的uplc-ms/ms分析使用的分離色譜柱為cortecs?premier?t3核殼色譜柱，是實(shí)心核顆粒與maxpeak高性能表面（hps）技術(shù)結(jié)合，與同等尺寸的全多孔顆粒相比，實(shí)心核顆粒在低柱壓下可發(fā)揮更高的柱效，而maxpeak?hps技術(shù)可減少典型不銹鋼色譜柱中分析物與金屬離子之間不必要的相互作用；通過(guò)方便、高效的方式將這兩種技術(shù)結(jié)合在一個(gè)色譜柱系列中，能以更高的通量得到所有分析物的可靠數(shù)據(jù)，非常適合多種農(nóng)藥、獸藥和真菌毒素的同時(shí)分析。