本發(fā)明屬于藥物篩選，具體涉及一種基于比色傳感結(jié)合親和色譜技術(shù)篩選中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的方法。

背景技術(shù)：

1、乙酰膽堿酯酶（ache）是一種中樞和神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，能夠快速催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ach）為非活性膽堿。乙酰膽堿酯酶被抑制后會導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸間隙積聚，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)受阻。由于乙酰膽堿酯酶與阿爾茲海默癥（ad）及其它因乙酰膽堿酯酶分解代謝而導(dǎo)致的乙酰膽堿水平低為特征的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，使其重新受到人們的關(guān)注。因此，開發(fā)具有靈敏度高、反應(yīng)快、操作簡便的檢測乙酰膽堿酯酶活性的有效策略已成為阿爾茨海默癥藥物篩選和醫(yī)學(xué)臨床診斷的當(dāng)務(wù)之急。

2、目前，臨床常用乙酰膽堿酯酶抑制藥物有多奈哌齊、卡巴拉丁等。多奈哌齊屬于六氫吡啶類氧化物，常用于輕度或中度阿爾茲海默型癡呆癥狀的治療，服用藥物以后能夠達(dá)到緩解病情的目的，是治療老年癡呆的常用藥；卡巴拉丁主要是通過抑制乙酰膽堿酯酶，來增加大腦中釋放膽堿的神經(jīng)元功能。若與其他類的膽堿酯酶抑制劑、擬膽堿藥及除極化型肌松劑合用時，可增強(qiáng)其作用，出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，而與抗膽堿能藥物合用可能干擾其療效；是膽堿酯酶抑制劑，對乙酰膽堿酯酶具有選擇性抑制作用，具有促進(jìn)記憶再現(xiàn)、增強(qiáng)記憶保持和加強(qiáng)肌肉收縮強(qiáng)度的作用，常用于治療良性記憶障礙、重癥肌無力以及癡呆患者和腦器質(zhì)性病變引起的記憶障礙等疾病。

3、現(xiàn)有的一些篩選方法，毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法和熒光技術(shù)篩選等，由于樣品成分復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多，操作繁瑣，費時等缺點，仍存在不足。

4、基于此，我們開展了篩選乙酰膽堿酯酶活性成分方法的研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明目的在于創(chuàng)建一種基于比色傳感器結(jié)合親和色譜技術(shù)篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，可以簡便快捷、高效且精確的從大量中藥中篩選出有效的抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

3、一種基于比色傳感結(jié)合親和色譜技術(shù)篩選中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的方法，其特征在于，包括步驟：

4、（1）具有抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品的篩選：將中藥提取物溶解成適宜濃度后加入到乙酰膽堿酯酶溶液中，反應(yīng)30分鐘后加入乙酰膽堿溶液，再反應(yīng)30分鐘后加入膽堿氧化酶，取樣后采用過氧化氫試紙條進(jìn)行顯色反應(yīng)。根據(jù)過氧化氫試紙條顯色顯著變淺時，即為具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的中藥提取物。

5、（2）乙酰膽堿酯酶親和色譜載體材料的制備：將戊二醛與氨基二氧化硅在室溫下震蕩反應(yīng)一定時間，使在二氧化硅上加入醛基，離心后水洗過濾，加入乙酰膽堿酯酶反應(yīng)一定時間，使氨基二氧化硅的醛基與乙酰膽堿酯酶的羧基共價結(jié)合，再加入賴氨酸震蕩一定時間，用以封閉二氧化硅上多余的醛基，得到乙酰膽堿酯酶二氧化硅（ache@sio2）親和色譜載體材料。

6、（3）中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選及鑒定：采用親和色譜法分離能夠與乙酰膽堿酯酶結(jié)合的中藥成分。將第（1）步篩選出來的具有抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的中藥提取物溶解成適宜濃度，加入到由（2）得到的ache@sio2親和色譜載體材料中，充分震蕩反應(yīng)一定時間后，離心取出未吸附的上清液。采用適宜溶劑洗脫得到與ache@sio2結(jié)合的溶液，為洗脫液。將中藥提取物初始液、未吸附液、洗脫液分別注入高效液相色譜儀中檢測，通過分析不同溶液中成分峰面積的變化，篩選出中藥與ache@sio2結(jié)合的成分；采用液質(zhì)聯(lián)用對與ache@sio2結(jié)合的成分進(jìn)行鑒定；通過測定篩選并鑒定出的結(jié)合成分對乙酰膽堿酯酶的半數(shù)抑制濃度，最終得到具有抑制乙酰膽堿酯酶作用的活性成分。

7、優(yōu)選的，步驟（1）所述的具有抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品的篩選，其特征在于，所述中藥提取物溶液濃度為2.5?mg/ml。

8、優(yōu)選的，步驟（1）所述的具有抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品的篩選，其特征在于，所述中藥提取物、乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿、膽堿氧化酶的體積比為2:2:4:1。

9、優(yōu)選的，步驟（2）所述乙酰膽堿酯酶親和色譜載體材料制備，其特征在于，詳細(xì)步驟如下：將氨基二氧化硅分散于pbs緩沖液中，加入戊二醛震蕩活化2小時，水洗滌3次，加入乙酰膽堿酯酶，將混合物置于振蕩器中震蕩4小時，使乙酰膽堿酯酶固定在sio2表面，再加入賴氨酸溶液震蕩反應(yīng)2小時，離心分離復(fù)合混合物，用水洗滌3次后得到ache@sio2載體材料，采用pbs緩沖液分散保存。

10、優(yōu)選的，步驟（3）所述中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選及鑒定，其特征在于，所述親和色譜方法具體為：色譜柱為xbridge?c18（4.6?×?150?mm；3.5?μm），檢測波長為320?nm，流動相a為0.1%磷酸，流動相b為甲醇，梯度洗脫程序為0?min-98%?a；3?min-88%a；12?min-85%?a；20?min-77%?a；35?min-67%?a；45?min-55%?a；48?min-98%?a；50?min-98%a，柱溫為35℃，流速為0.8?ml/min。

11、優(yōu)選的，步驟（3）所述中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選及鑒定，其特征在于，所述液質(zhì)聯(lián)用方法具體為：色譜柱為symmetry?c18?（2.1?mm?×?50?mm；3.5?μm），流動相a為0.1%甲酸，流動相b為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序為0?min-98%?a；2?min-98%?a；8min-90%?a；15?min-88%?a；18?min-75%?a；28?min-55%?a；35min-45%?a；50?min-10%?a；55min-98%?a；60?min-98%?a。霧化器壓力為35?psi，干燥氣體流速為8?l/min，氣體溫度為320℃，鞘氣溫度為350℃，氣體流速為11?l/min，質(zhì)量范圍選擇為50-3000（m/z）。

12、由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種基于生物傳感和親和色譜技術(shù)篩選中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的方法，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。本方法第一步采用比色傳感器技術(shù)快速識別具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的樣品，其原理是乙酰膽堿酯酶可催化乙酰膽堿生成膽堿，后者在膽堿氧化酶作用下可生成過氧化氫使得過氧化氫測試條變藍(lán)；當(dāng)被篩選的樣品中存在抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分時，過氧化氫測試條顏色顯著變淺。第二步通過親和色譜結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒別具有抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品中的成分，其方法是采用戊二醛在氨基二氧化硅上加入醛基，然后與乙酰膽堿酯酶反應(yīng)，再以賴氨酸封閉氨基二氧化硅中多余的醛基，形成ache@sio2親和色譜載體材料；將待篩選中藥提取物與親和色譜載體材料反應(yīng)一定時間，離心除去未吸附液后，采用適宜溶劑洗脫得到洗脫液；采用高效液相分析對比中藥提取物初始液、未吸附液、洗脫液各峰面積的變化，從而篩選出與乙酰膽堿酯酶有吸附作用的中藥成分；再采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對成分進(jìn)行鑒別。本方法可以簡便快捷、高效且精確的從中藥中篩選出抑制乙酰膽堿脂酶的活性成分。

技術(shù)特征：

1.一種基于比色傳感結(jié)合親和色譜技術(shù)篩選中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的方法，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選方法，其特征在于，所述中藥提取物溶液濃度為2.5?mg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選方法，其特征在于，所述中藥提取物、乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿、膽堿氧化酶的體積比為2:2:4:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選方法，其特征在于，所述親和色譜方法具體為：色譜柱為c18（4.6?×?150?mm；3.5?μm），檢測波長為320?nm，流動相a為0.1%磷酸，流動相b為甲醇，梯度洗脫程序為0?min-98%?a；3?min-88%?a；12?min-85%?a；20min-77%?a；35?min-67%?a；45?min-55%?a；48?min-98%?a；50?min-98%?a。柱溫為35℃，流速為0.8?ml/min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的篩選方法，其特征在于，所述液質(zhì)聯(lián)用方法具體為：色譜柱為c18?（2.1?mm?×?50?mm；3.5?μm），流動相a為0.1%甲酸，流動相b為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序為0?min-98%?a；2?min-98%?a；8?min-90%?a；15?min-88%?a；18?min-75%?a；28?min-55%?a；35?min-45%?a；50?min-10%?a；55?min-98%?a；60min-98%?a。霧化器壓力為35?psi，干燥氣體流速為8?l/min，氣體溫度為320℃，鞘氣溫度為350℃，氣體流速為11?l/min，質(zhì)量范圍選擇為50-3000（m/z）。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于比色傳感結(jié)合親和色譜技術(shù)篩選中藥中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的方法，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。本方法第一步采用比色傳感器技術(shù)快速識別具有抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的樣品，其原理是AChE可催化乙酰膽堿生成膽堿，后者與膽堿氧化酶作用生成過氧化氫（H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;）使測試條變藍(lán)；當(dāng)被篩選樣品具有抑制AChE活性時，測試條顏色顯著變淺。第二步通過親和色譜技術(shù)鑒別具有抑制AChE活性樣品中的成分，其方法將AChE固定化在載體材料上，通過溶劑洗脫得到可與AChE結(jié)合成分，再采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對成分進(jìn)行鑒別。本方法可以簡便快捷、高效且精確的從中藥中篩選出抑制乙酰膽堿脂酶的活性成分。

技術(shù)研發(fā)人員：馬學(xué)琴,馬金貴,撒玉萍,陳國寧
受保護(hù)的技術(shù)使用者：寧夏醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9