本發(fā)明屬于光學(xué)成像，具體涉及一種單像素式熒光拉曼雙模態(tài)成像系統(tǒng)與方法。

背景技術(shù)：

1、生物成像是了解生物體組織結(jié)構(gòu)，闡明生物體各種生理功能的一種重要研究手段。它利用光學(xué)或電子顯微鏡直接獲得生物細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)圖像，通過對所得圖像的分析來了解生物細(xì)胞的各種生理過程。目前，常用的生物成像技術(shù)有熒光成像和拉曼成像，其中熒光成像是利用生物體熒光特性的變化來獲得光學(xué)圖像，拉曼顯微成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的物質(zhì)分析方法。由于在很多生物結(jié)構(gòu)和生物過程中都缺少內(nèi)源熒光材料，很難利用生物樣本的本征熒光進行成像和探測，因此多數(shù)情況下需要引入外源熒光材料作為造影劑，對特定細(xì)胞或組織器官進行標(biāo)定，可實現(xiàn)組織中成像細(xì)胞的定位和形態(tài)學(xué)分析，但對于組織細(xì)胞內(nèi)多種脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)的熒光標(biāo)記存在很大的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多種生物大分子的同時分析需要解決光路設(shè)計、多種熒光同時標(biāo)記的困難和研究成本較高的問題。而拉曼成像技術(shù)可對生物樣品進行非標(biāo)記的特異性成像，且能夠避免水溶液的干擾，但傳統(tǒng)的拉曼成像存在其點掃描方式成像速度慢、線掃描方式像場彎曲和光子散射、寬場照明方式成像質(zhì)量低的問題。

2、基于上述熒光成像和拉曼成像存在的問題，現(xiàn)有技術(shù)將熒光-拉曼兩種檢測模式結(jié)合得到熒光拉曼雙模態(tài)成像系統(tǒng)，采用透射式熒光成像技術(shù)作為組織中成像細(xì)胞的定位系統(tǒng)，通過拉曼散射技術(shù)獲得成像細(xì)胞的分子指紋譜，充分利用其各自優(yōu)勢進行互補和協(xié)同，使得檢測靈敏度和準(zhǔn)確性實現(xiàn)大幅度提升。但在現(xiàn)有的熒光/拉曼寬場成像需要采用不同設(shè)備分別獲取，如科研級ccd作為傳感器進行圖像采集，成像視場與ccd軸線垂直。因此，當(dāng)拉曼/熒光圖像來自不共軸的不同陣列探測器，圖像視場、成像角度、分辨率、像素數(shù)等圖像參數(shù)皆存在不相同，即空間不匹配。另一方面，不同成像設(shè)備擁有不同的時鐘，所以時間上二者可能存在同步困難。由此可見，不同模態(tài)圖像難以同機同時獲取，造成各圖像時間空間不匹配，給圖像融合、圖像分析、目標(biāo)定位帶來困難。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、要解決的技術(shù)問題：

2、為了避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種單像素式熒光拉曼雙模態(tài)成像系統(tǒng)與方法，將熒光成像和拉曼成像進行融合，再結(jié)合單像素成像技術(shù)進行熒光拉曼雙成像，即采用同一激發(fā)源下，使用不同探測器獲得的單像素圖像的視場、分辨率、像素數(shù)等參數(shù)完全匹配，實現(xiàn)了無誤差圖像融合。本發(fā)明解決了現(xiàn)有成像系統(tǒng)無法在同一激發(fā)源下獲得時空一致的多模態(tài)圖像，并實現(xiàn)圖像融合的問題。

3、本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種單像素式熒光拉曼雙模態(tài)成像系統(tǒng)，包括沿光路依次設(shè)置的光源模塊、可編碼結(jié)構(gòu)光模塊、顯微成像模塊、樣本控制模塊、信號收集模塊，所述信號收集模塊將分別采集的熒光信號和拉曼信號傳輸至控制與計算模塊，經(jīng)處理后得到二維或三維圖像；

4、所述光源模塊用于生成所需波長的激光；

5、所述可編碼結(jié)構(gòu)光模塊將所接收激光轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)光，投影至顯微成像模塊；

6、所述顯微成像模塊將結(jié)構(gòu)光放大后投影至樣本平面，同時收集由樣本被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光、瑞利散射光和拉曼散射光；

7、所述樣本控制模塊用于調(diào)整樣本并固定樣本的位置，將樣本置于成像視野的位置；

8、所述信號收集模塊將所接收的熒光信號和散射信號進行放大、分離、采集，再將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，傳輸至控制與計算模塊進行存儲和后續(xù)處理。

9、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述光源模塊為不同波長的激光器、連續(xù)波激光器或多波長led光源。

10、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述可編碼結(jié)構(gòu)光模塊通過數(shù)字微鏡器件、空間光調(diào)制器或物理光柵生成結(jié)構(gòu)光；所述數(shù)字微鏡器件生成結(jié)構(gòu)光的方式為，在數(shù)字微鏡器件上加載二值光柵圖樣，通過投影或成像的方式在物鏡的焦平面產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光；所述空間光調(diào)制器生成結(jié)構(gòu)光的方式為，結(jié)合濾波，利用衍射±1級兩束相干光干涉，在物鏡焦平面產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光。

11、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述連續(xù)波激光器和數(shù)字微鏡器件之間設(shè)置有光束整形單元，包括沿光路依次設(shè)置的第一濾波片、第一透鏡和第二透鏡，對激光器所發(fā)射光源進行擴束；所述第一濾波片使用帶通濾波片，濾掉雜散光，保留成像物體的激發(fā)光；所述第一透鏡、第二透鏡均為凸透鏡，焦距分別為50mm、150mm，組成4f系統(tǒng)進行擴束；所述第一濾波片放置于第一個透鏡的前焦點上，編碼結(jié)構(gòu)光平面位于第二個透鏡的后焦點上。

12、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述顯微成像模塊將結(jié)構(gòu)光輸入到樣品激發(fā)熒光信號和拉曼散射信號，包括沿光路依次設(shè)置的準(zhǔn)直鏡、第一二向色鏡、顯微物鏡；所述第一二向色鏡將激發(fā)得到的信號傳輸至信號收集模塊，通過第一二向色鏡將成像物體激發(fā)光波長范圍內(nèi)的光折射至顯微物鏡的焦平面；由顯微物鏡收集樣本被激發(fā)所產(chǎn)生的熒光、瑞利散射光和拉曼散射光，再通過第一二向色鏡將瑞利散射光濾除后，得到熒光-拉曼信號。

13、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述樣本控制模塊為多維旋轉(zhuǎn)臺，能夠調(diào)整樣本在空間的任意位置和角度。

14、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述信號收集模塊包括全景光合器、第二二向色鏡、熒光信號采集單元和拉曼信號采集單元，所述顯微成像模塊的出射光經(jīng)全景光合器后，通過第二二向色鏡將熒光-拉曼信號分離分別透射至熒光信號采集單元和拉曼信號采集單元，其中反射熒光信號采集單元的熒光信號依次穿過第二濾波片、第三透鏡，由第一單點探測器采集，透射至拉曼信號采集單元的拉曼信號依次穿過第三濾波片、管透鏡，由第二單點探測器采集；所述第一單點探測器采集和第二單點探測器采集均通過采集卡將所采集數(shù)據(jù)發(fā)送至控制與計算模塊。

15、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述第二二向色鏡根據(jù)所要反射的熒光信號和透射的拉曼信號的波長范圍選??；所述第二濾波片、第三濾波片的中心波長與需要分離的熒光或拉曼信號的波長匹配，第二濾波片的帶通寬度只允許熒光信號通過并阻擋其他波長的光，第三濾波片的帶通寬度只允許拉曼信號通過并阻擋其他波長的光。

16、本發(fā)明的進一步技術(shù)方案是：所述控制與計算模塊包括控制單元和計算單元，通過控制單元對光源模塊、可編碼結(jié)構(gòu)光模塊、顯微成像模塊、樣本控制模塊、信號收集模塊進行控制，通過計算單元將采集到的光電信號還原成二維或三維圖像，所采用的計算成像算法為匹配結(jié)構(gòu)光的對應(yīng)算法，所述結(jié)構(gòu)光為傅里葉基底光，對應(yīng)算法為逆傅里葉算法。

17、一種單像素式熒光拉曼雙模態(tài)成像系統(tǒng)的成像方法，具體步驟如下：

18、根據(jù)樣本所激發(fā)光波段，選擇收集熒光信號和拉曼信號的濾波片；

19、沿光路布置光源模塊、可編碼結(jié)構(gòu)光模塊、顯微成像模塊、樣本控制模塊、信號收集模塊，并分別與控制與計算模塊連接；

20、成像前對樣本進行熒光標(biāo)記；

21、光源模塊的出射激光經(jīng)可編碼結(jié)構(gòu)光模塊后得到亮暗條紋的結(jié)構(gòu)光；結(jié)構(gòu)光經(jīng)顯微成像模塊投影至樣本上，并由顯微成像模塊收集樣本激發(fā)產(chǎn)生的熒光、瑞利散射光和拉曼散射光，將瑞利散射光濾除后，發(fā)射至信號收集模塊，分別對熒光信號和拉曼信號進行采集，并將采集信號發(fā)送至控制與計算模塊進行存儲和后續(xù)處理；

22、所述控制與計算模塊將熒光信號處理后得到熒光圖像，獲取了組織中待測細(xì)胞的熒光定位和特定細(xì)胞器的形態(tài)、生化信息；將拉曼信號處理后獲得樣本組織中熒光定位的待測細(xì)胞的拉曼光譜圖像。

23、有益效果

24、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明將基于結(jié)構(gòu)光照明的拉曼顯微成像系統(tǒng)與熒光顯微成像系統(tǒng)結(jié)合為雙模態(tài)單像素成像，提供優(yōu)于任何單獨模態(tài)的協(xié)同優(yōu)勢；在兩種成像系統(tǒng)融合過程中采用了全景光合器，在得到大視野的同時確保空間上一次采集到熒光-拉曼信號，并結(jié)合單像素成像技術(shù)，解決了現(xiàn)有熒光-拉曼成像系統(tǒng)的圖像融合問題。

25、本發(fā)明采用單像素成像解決熒光-拉曼雙模態(tài)圖像融合問題，不需要進行操作復(fù)雜的掃描或者使用工藝復(fù)雜的多陣列探測器。使用不同探測器獲得的單像素圖像的視場、分辨率、像素數(shù)等參數(shù)完全匹配，實現(xiàn)了無誤差圖像融合。由于熒光、拉曼發(fā)生過程通常發(fā)生在皮秒到數(shù)十納秒的時間內(nèi)，在宏觀尺度上可以看作同時發(fā)生，加入全景光合器使熒光信號、拉曼信號可同時被探測器收集，因此單像素成像實現(xiàn)利用同一激發(fā)源獲得時空一致的多模態(tài)圖像，從圖像采集原理上解決圖像融合問題，有助于精準(zhǔn)共定位，給圖像融合、圖像分析帶來極大的便利。另一方面，使用兩個單點探測器代替科研級ccd作為傳感器進行圖像采集，成本更低。

26、優(yōu)選的，本發(fā)明采用單點探測器與空間編碼策略結(jié)合來代替面陣探測器作為微弱光信號檢測單元，空間編碼策略可使用隨機編碼圖案、傅里葉編碼圖案、哈達瑪圖案?？梢詫?fù)雜的圖像采集過程簡化為一系列的單點測量，降低了數(shù)據(jù)采集的復(fù)雜性和處理的數(shù)據(jù)量。當(dāng)這些圖案照射到樣本上時，樣本的結(jié)構(gòu)信息會被編碼到光波的相位和振幅中，使用計算重建算法(如壓縮感知技術(shù))來重建樣本的圖像。