本發(fā)明涉及飼料中殘留藥物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種飼料中抗蠕蟲藥的同步測定方法。

背景技術(shù)：

1、肝片蠕蟲是一種人畜共患的食源性寄生蟲，主要寄生于哺乳動物的膽道內(nèi)，其分泌的毒素具有溶血作用，感染后可引起肝臟的損害和出血，對畜牧業(yè)和人類健康帶來巨大威脅。硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺是苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥。該類藥物主要用于驅(qū)殺肝片蠕蟲、蛔蟲、絳蟲、血毛線蟲等，因其具有給藥劑量小、方便、高效等特點(diǎn)，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)特別是食草畜牧業(yè)中應(yīng)用廣泛。然而，動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明碘醚柳胺有明顯胚胎毒性，氯氰碘柳胺對肝、腎具有一定毒副作用，高劑量硝碘酚腈可引起心臟、神經(jīng)、肌肉和呼吸的損害。為確保消費(fèi)者健康和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，很多國家已經(jīng)制定了動物食品和牛奶中的硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺最大殘留限量。我國對于獸藥殘留管控也很嚴(yán)格，gb31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留量》規(guī)定了硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺在牛奶中的殘留限量分別為20、10、45μg/kg。

2、飼料質(zhì)量安全是動物性食品安全的前提和根本保證，上述三種抗蠕蟲藥在食草畜牧業(yè)中應(yīng)用時(shí)非常容易被混入到所喂食的飼料中，這很有可能會通過食物鏈傳遞、環(huán)境蓄積污染飼料等方式，在動物組織中富集，引發(fā)食品質(zhì)量安全隱患，對消費(fèi)者健康造成威脅。

3、然而，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于抗蠕蟲藥的檢測方法研究較少，已存在的研究也主要針對的是動物組織和奶制品的檢測，不包含飼料基質(zhì)，而且檢測的藥物種類也較少。也就是說，迄今為止，我國尚無飼料中硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的檢測標(biāo)準(zhǔn)，也沒有飼料中硝碘酚腈、碘醚柳胺和氯氰碘柳胺三種抗蠕蟲藥同步檢測的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

4、因此，針對現(xiàn)有飼料中抗蠕蟲類藥物測定方法的缺乏以及飼料質(zhì)量安全監(jiān)測的需要，有必要建立飼料中上述三種抗蠕蟲藥的快速、靈敏且準(zhǔn)確的樣品前處理技術(shù)和儀器檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供一種飼料中抗蠕蟲藥的同步測定方法，其通過向待測飼料中加入乙腈，對硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺進(jìn)行提取，經(jīng)氮吹濃縮后采用prime?hlb固相萃取小柱對試樣提取液進(jìn)行凈化，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)進(jìn)行檢測，從而建立了對飼料中硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺三種抗蠕蟲藥的分析方法，為飼料質(zhì)量安全監(jiān)測提供了技術(shù)支撐，具有重要研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2、本發(fā)明公開了一種飼料中抗蠕蟲藥的同步測定方法，抗蠕蟲藥為硝碘酚腈、碘醚柳胺和氯氰碘柳胺三種；方法包括以下步驟：

3、s1，將待測飼料試樣用乙腈提取，得到待凈化溶液；

4、s2，將所述待凈化溶液采用prime?hlb固相萃取柱進(jìn)行凈化，收集全部流出液，用水定容，混勻后通過微孔濾膜，得到待測試樣溶液。

5、在本發(fā)明中，首先借助于乙腈提取，將待測飼料樣品中的待測藥物稀出，同時(shí)借助于采用水可浸潤性的強(qiáng)親水性聚合物作為吸附劑的prime?hlb固相萃取小柱，可去除復(fù)雜樣品中95％的常見基質(zhì)干擾物，如磷脂、蛋白質(zhì)等。而且，其操作流程更加簡單，無需活化和平衡等步驟即可獲得較高的回收率，使得本發(fā)明構(gòu)建了針對飼料中三種抗蠕蟲藥的分析方法，為飼料質(zhì)量安全監(jiān)測提供了技術(shù)支撐，具有重要研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

6、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在步驟s1之前，還包括步驟s0，基于各待測藥物的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，配制基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；在步驟s2之后，還包括步驟s3，將所述基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測試樣溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測定的各待測藥物的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，采用外標(biāo)法對各待測藥物進(jìn)行定量。

7、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在所述步驟s3中，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定的步驟中，液相色譜的色譜柱為c18柱，流動相體系為流動相a和流動相b，其中，流動相a為甲酸水溶液，流動相b為甲醇，采用梯度洗脫。

8、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，其中在液相色譜中，流動相體系的流速為0.1-0.5ml/min,流動相體系的梯度洗脫程序?yàn)椋?/p>

9、0.0～1.0min，所述流動相a的體積百分比為65％；

10、1.0～4.0min，所述流動相a的體積百分比由65％勻速降至5％；

11、4.0～7.0min，所述流動相a的體積百分比為5％；

12、7.0～7.1min，所述流動相a的體積百分比由5％勻速增至65％；

13、7.1～10.0min，所述流動相a的體積百分比為65％。

14、初始甲醇比例設(shè)為35％，這適當(dāng)增大流動相中的有機(jī)相比例可以縮短樣品檢測時(shí)間，解決因抗蠕蟲藥的極性較小而出峰時(shí)間較晚的問題；1-4min，甲醇比例逐漸增大，能夠使得各待測物依次從色譜柱中流出；當(dāng)4-7min，甲醇比例為95％，借助于高比例的有機(jī)相能夠使得樣品中的非極性雜質(zhì)盡可能流出，避免在色譜柱中的堆積，污染色譜柱；而當(dāng)7-10min，回到初始比例，平衡3min后從而能夠進(jìn)下一針樣品?；诒景l(fā)明所設(shè)定的整個(gè)梯度洗脫程序，使得能夠保證硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺三種抗蠕蟲藥在合適的時(shí)間出峰并獲得良好的峰型，同時(shí)避免其他雜質(zhì)在色譜柱中的堆積，保證在反復(fù)多次進(jìn)樣時(shí)依舊能獲得較好的重復(fù)性。

15、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，流動相a為0.1％甲酸水溶液。

16、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在液相色譜中，柱溫箱溫度為40℃，進(jìn)樣量為5μl。

17、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中質(zhì)譜的測定條件為：離子源為電噴霧離子源，監(jiān)測方式為多反應(yīng)監(jiān)測，掃描方式為負(fù)離子掃描，電噴霧電壓4.5kv，去溶劑溫度450℃。

18、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在所述步驟s0中，取適量的硝碘酚腈、碘醚柳胺和氯氰碘柳胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液配制成濃度分別為5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

19、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在所述步驟s1中，包括：

20、步驟s11，取待測飼料試樣1-5g，置于50ml離心管中，加入乙腈5-15ml，超聲提取15min，于4000r/min離心3-5min，取上清液于另一離心管中；

21、步驟s12，下層殘留物再次用乙腈5-15ml重復(fù)提取，取上清液；

22、步驟s13，將步驟s11和步驟s12中所得上清液合并，渦旋后加入無水硫酸鎂和無水乙酸鈉進(jìn)行渦旋、振蕩，以獲得最終的上清液；

23、步驟s14，將最終所得上清液于40℃水浴氮?dú)獯抵良s2-5ml，加水定容至5ml，混勻，得到待凈化溶液。

24、其中，優(yōu)選地，在步驟s11中，取待測飼料試樣5g，置于50ml離心管中，加入乙腈10ml，超聲提取15min，于4000r/min離心5min，取上清液于另一離心管中；在步驟s12中，下層殘留物再次用乙腈10ml重復(fù)提取，取上清液；然后再步驟s14中，將最終所得上清液于40℃水浴氮?dú)獯抵良s4ml，加水定容至5ml，混勻，得到待凈化溶液。

25、由于借助于乙腈、無水硫酸鎂和無水乙酸鈉對待測樣品進(jìn)行預(yù)處理，這樣最終所得上清液中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等干擾物質(zhì)被大大去除，同時(shí)，緊接著使用prime?hlb固相萃取柱進(jìn)行凈化，這能夠進(jìn)一步可去除復(fù)雜樣品中95％的常見基質(zhì)干擾物，如磷脂、蛋白質(zhì)等，從而能夠最大程度的使得硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺殘留被釋放出來。即，通過本發(fā)明中乙腈、無水硫酸鎂和無水乙酸鈉對待測樣品進(jìn)行預(yù)處理以及借助于prime?hlb固相萃取柱的方案，在最大程度去除雜質(zhì)的情況下，能夠最大程度的減少分析物的流失。

26、在根據(jù)本發(fā)明所公開的方法中，在步驟s3中，將待凈化液全部通過prime?hlb柱，收集全部流出液，用水定容至10ml，混勻，過0.22μm微孔濾膜，得到待測試樣溶液。

27、有益效果：在本發(fā)明的方法中，乙腈提取、prime?hlb固相萃取柱和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法形成一個(gè)緊密的整體，彼此之間具有協(xié)同作用，具體體現(xiàn)為，采用乙腈對飼料中三種抗蠕蟲藥(硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺)進(jìn)行提取，回收率高，重復(fù)性好；經(jīng)氮吹濃縮后采用prime?hlb固相萃取小柱對試樣進(jìn)行凈化，能夠去除飼料中的大部分脂類及其它雜質(zhì)，對目標(biāo)化合物具有良好的選擇性，且操作簡便，無需活化、平衡和淋洗雜質(zhì)等步驟，大大縮短檢測時(shí)間；通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)對三種抗蠕蟲藥同時(shí)定量，檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均較高，填補(bǔ)了目前針對飼料中硝碘酚腈、碘醚柳胺和氯氰碘柳胺檢測方法的空白，可以為飼料質(zhì)量安全監(jiān)測提供可靠技術(shù)支撐。

28、基于本發(fā)明所提供的方法，不但提取和凈化效果好，靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好，且操作簡便，大大縮短了檢測時(shí)間，適用于飼料樣品中硝碘酚腈、碘醚柳胺和氯氰碘柳胺三種抗蠕蟲藥殘留的高通量檢測。

29、下面結(jié)合附圖中所示的實(shí)施例以及附圖標(biāo)記詳細(xì)公開本發(fā)明的飼料中抗蠕蟲藥的同步測定方法。