本發(fā)明涉及疾病預測，尤其涉及dr5于制備肝衰竭風險預后的檢測系統(tǒng)中的應用。

背景技術：

1、肝細胞癌(hcc)是一種常見的惡性腫瘤，是全球主要的癌癥致死原因之一。根據(jù)2023年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2022年新確診的肝癌病例數(shù)高達36.8萬例，占全球新發(fā)肝癌病例的42.4％；同年肝癌死亡人數(shù)達到31.7萬例，占全球肝癌死亡總數(shù)的41.7％。不少肝癌患者因腫瘤的不可切除性而無法通過手術達到根治目的。不可切除的肝細胞癌在醫(yī)學上分為兩個主要類別：外科學上的不可切除和腫瘤學上的不可切除。這兩種情況都涉及到不同的醫(yī)學考量和治療策略?！巴饪茖W上的不可切除”指由于解剖學或生理學的限制而使得腫瘤無法安全切除的情況，包括殘肝體積不足(當預計切除腫瘤后剩余的肝臟體積不足以維持必要的肝功能時)、腫瘤位置(腫瘤可能位于肝臟的關鍵區(qū)域，如緊鄰重要的血管結構或膽管，使得手術風險極高)、多支重要血管受累(腫瘤可能侵犯了多支重要的肝臟流入道，如肝動脈、門靜脈，或流出道，如肝靜脈、下腔靜脈，這些血管的損傷可能對肝臟功能造成不可逆的影響)等情況。這些情況下，手術切除可能會導致嚴重的并發(fā)癥，甚至可能無法完成手術。因此，醫(yī)生可能會尋求其他治療方法，如局部消融、介入治療、放療或系統(tǒng)性治療?！澳[瘤學上不可切除”指即使技術上能夠切除腫瘤，但由于腫瘤的生物學特性或分布情況，手術切除可能不會為患者帶來生存上的優(yōu)勢，包括多發(fā)性腫瘤(多個病灶的ⅱb期hcc，手術可能無法完全清除所有腫瘤，而且手術風險和患者恢復期間的并發(fā)癥風險較高)、血管癌栓(合并下腔靜脈主干或門靜脈主干癌栓的ⅲa期hcc，這些癌栓可能預示著腫瘤的侵襲性和高復發(fā)風險)、肝外轉移(某些ⅲb期hcc可能已經出現(xiàn)肝外轉移，如肺轉移或骨轉移)等情況。在腫瘤學上不可切除的情況下，醫(yī)生可能會推薦非手術治療，如全身化療、靶向治療、免疫治療或它們的聯(lián)合治療，以期達到控制疾病進展、緩解癥狀和提高生活質量的目的。

2、目前的醫(yī)學進展豐富了非手術治療肝細胞癌的方法，提高了hcc的帶瘤生存率。某些方案通過“降期”治療，可成功地將原本不可切除的腫瘤轉化為可手術切除的狀態(tài)。然而，不可切除hcc患者的預后差異很大。這種差異性主要受到幾個關鍵因素的影響，首先，肝功能的儲備能力是決定患者預后的重要因素，其影響著肝臟對疾病和治療的響應；其次，肝臟的炎癥環(huán)境也對患者的預后產生影響，慢性炎癥可能導致肝臟損傷的進一步加劇。此外，肝細胞的凋亡傾向，即肝臟細胞自我毀滅的能力，也是影響患者預后的一個因素。這些因素相互作用可能最終導致慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic?liver?failure，aclf)的嚴重臨床情況。

3、aclf是一種在慢性肝病基礎上，由多種因素觸發(fā)的臨床綜合征。這種病狀以急性黃疸的加劇和凝血功能障礙為特征，可合并包括肝性腦病、腹水、電解質紊亂、感染、肝腎綜合征、肝肺綜合征等并發(fā)癥，以及肝外器官功能衰竭。患者的臨床癥狀急性出現(xiàn)，黃疸迅速加深，血清總膽紅素水平顯著升高，至少達到正常值上限的10倍，或者每天的增加量不少于17.1μmol/l。此外，患者還表現(xiàn)出出血傾向，這可以通過凝血酶原活動度(pta)低于40％或國際標準化比值(inr)高于或等于1.5來評估。除了肝臟問題，患者至少在一個肝外器官系統(tǒng)(如神經系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)或腎臟)中出現(xiàn)功能衰竭。這些癥狀表明患者的病情嚴重，且具有較高的短期死亡風險。目前，對于晚期及進展較快的aclf還沒有確切有效的治療方法，但若能盡早識別潛在的aclf風險，則可以通過積極的保肝治療幫助部分患者改善預后。同時，研究表明，對于存在潛在肝衰竭風險的、不可切除的肝癌患者，若采取積極的抗腫瘤治療措施，如靶向治療、免疫治療或介入性微創(chuàng)手術等，可能會進一步加劇肝臟損傷，反而對患者的預后產生不利影響。雖然對于嚴重的普通aclf患者，肝移植可能有效，但由于hcc的病理特性，特別是發(fā)生在hcc基礎上的aclf，患者接受肝移植的條件受到限制，這增加了治療的復雜性，因此對肝癌患者中aclf發(fā)生風險的評估策略極為重要。

4、hcc的治療效果在很大程度上受肝功能儲備的影響。肝實質損傷或肝功能儲備下降時，一系列血清學指標會反映出這種變化：天冬氨酸氨基轉移酶(ast)、丙氨酸氨基轉移酶(alt)、堿性磷酸酶(alp)、γ-谷氨酰轉肽酶(ggt)、乳酸脫氫酶(ldh)和總膽紅素(tbil)的水平升高，而白蛋白(alb)的水平則降低，同時凝血時間會延長。這些關鍵指標不僅揭示了肝臟的健康狀況，還被用于構建多個評分系統(tǒng)，以評估患者的預后。child-pugh評分、終末期肝病模型(meld)評分以及慢性肝衰竭(clif)評分等工具，通過綜合這些生化指標，為臨床醫(yī)生提供了評估aclf患者肝功能和預測疾病進展的重要依據(jù)。而炎癥相關指標如nlr、其他結合炎癥和肝功能的血液生物標志物，包括新格拉斯哥預后評分(neo-gps)、天冬氨酸氨基轉移酶-淋巴細胞比值指數(shù)(alri)、γ-谷氨酰轉肽酶-淋巴細胞比值(glr)、crp-白蛋白比值(car)也被報道為hcc的獨立預后預測因子。此外，巴塞羅那評分及分期系統(tǒng)(barcelona?clinic?liver?cancer，bclc)是一種肝癌臨床分期系統(tǒng)，包含有肝功能相關指標，可通過評估肝功和肝癌的狀態(tài)，指導臨床治療并協(xié)助預測患者預后。公布號為cn116555416a的專利文獻公開了評估肝臟手術后肝衰竭風險或再生狀況的預測模型及其應用，其首次揭示包含vegfa(血管內皮生長因子a)和pedf(人色素上皮衍生因子)的標志物組合于肝臟手術后肝功能衰竭風險預后或肝臟再生狀態(tài)預后中的應用。腫瘤壞死因子受體超家族(tumor?necrosis?factor?receptor?superfamily，tnfrsf)在細胞凋亡和炎癥等過程中發(fā)揮重要作用，同時也參與細胞增殖和細胞分化。死亡受體5(dr5，又名trail-r2、tnfrsf10b)高表達于大部分肝癌組織，而在正常組織及細胞中表達較低。目前dr5與肝癌基礎上的肝衰竭的相關性研究尚屬空白。

5、證據(jù)顯示，不可切除的肝癌患者一旦發(fā)生慢加急性肝衰竭，其90天死亡率可達82.14％。目前所提供的評估肝功和肝癌狀態(tài)的工具在準確評估患者近期發(fā)生aclf的風險，尤其是hcc基礎上的aclf風險方面并沒有相關報道。同時，目前也沒有經過驗證的生物標志物來識別hcc患者是否具有明確的肝衰竭傾向。

6、此外，一方面由于對本領域技術人員的理解存在差異；另一方面由于申請人做出本發(fā)明時研究了大量文獻和專利，但篇幅所限并未詳細羅列所有的細節(jié)與內容，然而這絕非本發(fā)明不具備這些現(xiàn)有技術的特征，相反本發(fā)明已經具備現(xiàn)有技術的所有特征，而且申請人保留在背景技術中增加相關現(xiàn)有技術之權利。

技術實現(xiàn)思路

1、aclf是一種臨床情況復雜的病狀，其發(fā)病機制牽涉到多系統(tǒng)和多因素的交互作用，這些因素包括遺傳背景、免疫狀態(tài)、代謝異常、感染、藥物或毒素暴露等。由于這些復雜的相互作用，單憑一個因素或一個生物標志物很難全面預測aclf的發(fā)病和預后。診斷hbv-aclf時，通常依賴于丙氨酸氨基轉移酶(alt)、天冬氨酸氨基轉移酶(ast)、總膽紅素(tbil)水平的顯著升高，以及凝血酶原時間(pt)的延長等肝損傷指標。但在chb急性加重至aclf的早期，這些指標可能不出現(xiàn)明顯變化，因而使得早期診斷變得復雜。部分患者甚至在沒有肝硬化的情況下也可能迅速進展為肝衰竭，這種肝硬化前期的肝衰竭現(xiàn)象難以被及時檢測。因此，單純依賴傳統(tǒng)的生化和凝血指標，aclf的早期準確診斷面臨困難。

2、目前有一些用于評估肝病嚴重程度的評分系統(tǒng)，如child-pugh、meld、nlr、clif、clif-c?aclfs、bclc評分等。child-pugh評分根據(jù)患者的總分將肝臟儲備功能分為三級，以對應不同嚴重程度的肝臟損害，但該評分工具不能體現(xiàn)肝癌患者關于腫瘤本身進展帶來的肝衰竭風險。meld評分可用于預測非肝移植aclf患者的病死率，還可用于預測等待肝源及肝移植后患者的病死率。但是該評分系統(tǒng)也難以體現(xiàn)肝癌本身進展帶來的肝衰竭風險。nlr是反映機體免疫狀態(tài)的炎癥指標，是hbv-aclf患者短期預后的相對簡單、快捷的預測指標，但其對肝臟儲備功能整體的把握存在一定的局限性，且在預測肝癌發(fā)展過程中發(fā)生肝衰竭風險的預測價值還需要進一步證實。clif-caclfs評分在短期病死率的預測方面較為準確，但是該評分系統(tǒng)沒有與肝癌基礎上的肝衰竭風險預測相關的研究。bclc分期對肝癌具有較強的分類和預測預后的能力，但缺少預測肝衰竭風險的判斷及指導意義。在肝衰竭風險預測方面，目前公開有vegfa、pedf、scd163等標志物，但其主要針對的是肝切除術后發(fā)生肝衰竭的預測，對不可切除hcc基礎上的肝衰竭而言，這些指標的預后價值的研究有限。

3、肝衰竭患者肝組織中的大量肝細胞死亡是導致肝衰竭的直接原因。在aclf的情況中，肝組織通常會受到大量炎癥細胞的侵襲，而炎癥和細胞壞死的程度及其類型，對判斷病情的進展和預后至關重要。尤其地，hcc-aclf患者中的內環(huán)境更加復雜，腫瘤的快速生長會引起腫瘤內部的肝細胞大量壞死，釋放大量內源性細胞因子及炎癥介質，誘發(fā)或加重肝衰竭。因此，為了更準確地評估肝癌患者aclf的風險，有必要引入新的生物標志物指標。

4、針對現(xiàn)有技術之不足，本發(fā)明第一方面提供dr5于制備肝衰竭風險預后的檢測系統(tǒng)中的應用。檢測系統(tǒng)優(yōu)選為檢測試劑、試劑盒或檢測裝置。優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)用于檢測dr5的表達水平或存在量。特別優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)用于檢測可溶性dr5(sdr5)的表達水平或存在量。

5、本發(fā)明第二方面提供dr5于制備肝癌基礎上的肝衰竭風險預后的檢測系統(tǒng)中的應用。肝癌基礎上的肝衰竭優(yōu)選為肝細胞癌基礎上發(fā)生慢加急性肝衰竭(hcc-aclf)。肝癌基礎上的肝衰竭優(yōu)選為不可切除肝細胞癌基礎上發(fā)生慢加急性肝衰竭。檢測系統(tǒng)優(yōu)選為檢測試劑、試劑盒或檢測裝置。優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)用于檢測dr5的表達水平或存在量。特別優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)用于檢測血清中可溶性dr5(sdr5)的表達水平或存在量。

6、根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，根據(jù)dr5的表達水平或存在量，進行選自下組的應用：

7、預測或評估肝癌基礎上的肝衰竭的發(fā)生風險；和/或

8、預測或評估肝癌基礎上的肝衰竭的嚴重程度。

9、根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，根據(jù)dr5的表達水平或存在量：

10、若dr5的表達水平或存在量大于177.78pg/ml，則表明患者具有90天內發(fā)生aclf的風險。

11、本發(fā)明第三方面提供一種用于評估肝癌基礎上的肝衰竭風險的試劑盒，該試劑盒包括檢測dr5的表達水平或存在量的檢測試劑，以及使用說明書。該檢測試劑能夠為免疫檢測試劑、測序試劑或pcr檢測試劑。

12、本發(fā)明第四方面提供一種使用本發(fā)明第三方面提供的試劑盒檢測dr5的表達水平或存在量的方法，包括以下步驟：

13、提供待檢測樣本；

14、使待檢測樣本與試劑盒中的檢測試劑反應；

15、加入標記物并允許其與檢測試劑結合；

16、通過檢測標記物的信號來定量或定性dr5的表達水平或存在量。

17、本發(fā)明第五方面提供一種用于評估肝癌基礎上的肝衰竭風險的檢測裝置，該檢測裝置包括本發(fā)明第三方面提供的試劑盒、測序儀器、芯片、探針組、引物探針組或電泳裝置。

18、本發(fā)明第六方面提供dr5、tbil和inr標志物組合于評估肝衰竭風險中的應用。肝衰竭風險優(yōu)選為肝癌基礎上的肝衰竭風險。

19、根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，根據(jù)如下風險評分公式進行肝衰竭風險分析或評分：

20、0.04*dr5+0.012*tbil+3.006*inr。

21、在醫(yī)學上，tbil的水平是評估肝臟健康的重要指標之一。inr(internationalnormalized?ratio，國際標準化比率)是用于評估血液凝固能力的醫(yī)學指標，inr是通過凝血酶原時間(prothrombin?time，pt)來計算得出的標準化比值。

22、本發(fā)明第七方面提供一種用于評估肝癌基礎上的肝衰竭風險的試劑盒或檢測裝置，其中包括檢測dr5和tbil的存在量的檢測試劑。

23、本發(fā)明第八方面提供一種用于評估肝癌基礎上的肝衰竭風險的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括檢測單元和數(shù)據(jù)分析單元，

24、其中，檢測單元包括：檢測dr5和/或tbil的存在量的檢測試劑，或含有該檢測試劑的試劑盒或檢測裝置；

25、其中，該數(shù)據(jù)分析單元包括：用于對檢測單元的檢測結果進行分析處理的處理單元。

26、根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，處理單元利用如下風險評分公式進行肝癌基礎上的肝衰竭的風險分析或評分：

27、0.04*dr5+0.012*tbil+3.006*inr。

28、技術效果：雖然已有研究表明dr5在肝癌細胞系中表達，且不同細胞表面dr5的表達水平具有差異，如人肝細胞癌hepg2細胞為40％，人正常肝細胞hl-7702為20.3％。但并沒有涉及肝癌基礎上的肝衰竭背景下的dr5表達情況。在早期肝癌患者中，sdr5水平適度升高可能表明腫瘤負荷較低，免疫系統(tǒng)仍能夠有效清除腫瘤細胞，此時sdr5可能通過調控trail信號減輕肝臟負擔，從而降低肝衰竭風險。研究發(fā)現(xiàn)，在hcc患者的肝組織中，dr5的表達通常較低。這種低表達可能與肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關。同時，對于腫瘤晚期(如ⅲ/ⅳ期腫瘤)而言，dr5的表達顯著低于腫瘤早期(如ⅰ/ⅱ期)，dr5的下調可能使得肝細胞對凋亡信號的響應減弱，表明肝癌細胞可能通過降低dr5的表達來逃避或耐受trail誘導的凋亡，從而促進肝細胞的存活和腫瘤的進展。盡管已有研究表明，sdr5-fc蛋白在治療trail驅動的肝炎和肝衰竭疾病中安全有效，但將dr5應用于肝衰竭風險預后評估中的用途卻并非本領域技術人員基于現(xiàn)有技術能夠輕易推斷出來的。

29、現(xiàn)有技術主要關注于sdr5-fc蛋白作為一種治療手段，其用于阻斷trail信號通路以防止肝細胞凋亡，從而治療肝炎和肝衰竭。但并沒有公開dr5在肝衰竭風險預后中的應用，更沒有公開dr5在肝癌基礎上的肝衰竭風險預后中的應用。

30、就功能差異性而言，雖然dr5與trail信號通路密切相關，但其在治療和預后評估中的作用機制存在顯著差異。治療應用主要是通過阻斷信號通路來抑制細胞凋亡，而預后評估則涉及對體內dr5水平或活性的檢測和分析，以預測疾病進展和風險。本領域技術人員很難預見dr5在這兩種應用場景中的作用是可以互換的。

31、就生物標志物的選擇性而言，在選擇用于預后評估的生物標志物時，往往需要考慮標志物與疾病進展之間的特異性關聯(lián)。dr5在體內的表達受到多種因素的調控，如免疫應答、細胞應激等，其水平變化未必能夠準確反映肝衰竭風險。生物標志物具有局限性或特異性，如甲胎蛋白(afp)雖然在肝癌的診斷中具有一定的特異性，但在評估肝功能狀態(tài)和肝衰竭風險時并非高度敏感。afp水平可能在多種肝病中升高，導致誤判。肝衰竭的生物標志物(如血清白蛋白、凝血酶原時間等)同樣可能受到肝癌以外因素的影響，如合并癥、感染等，使得其在評估肝癌患者的風險時不夠準確。肝癌的生物標志物往往與腫瘤的大小或分期相關，而肝衰竭的風險可能與這些因素無關。肝癌基礎上的肝衰竭具有其獨特性，涉及到腫瘤特征、肝功能損害和多種生理因素的相互作用。因此，本領域技術人員通常不會將dr5視為預后評估的首選標志物。

32、就現(xiàn)有文獻的局限性而言，已有文獻主要報道了sdr5-fc蛋白的治療作用，對于其在肝衰竭風險預后中的作用尚無明確揭示或系統(tǒng)研究。這意味著本領域技術人員在面對dr5的臨床應用時，其認知局限于治療功能，而缺乏將其擴展至預后評估用途的啟示。治療功能反映的是腫瘤細胞對藥物的敏感性、靶向治療的有效性；而預后標志物主要用于預測疾病的自然進程和患者的生存率。治療功能通常與特定的生物學通路或機制相關，例如靶向治療時，其可能與藥物的作用靶點直接相關。而具有預后功能的標志物可能與疾病的整體生物學特性、炎癥反應、免疫狀態(tài)等有關。兩者所反映的生物學過程可能完全不同?；诠δ?、臨床應用和生物學基礎的差異，dr5的應用不能互相替代或推導。

33、綜上所述，將dr5用于肝衰竭風險預后評估在現(xiàn)有技術中并不顯而易見，尤其是肝癌基礎上的肝衰竭，本領域技術人員在未有具體實驗數(shù)據(jù)支持或相關文獻揭示的情況下，很難預料其具有該用途。本發(fā)明提供的應用不僅創(chuàng)新性地擴展了dr5的功能范圍，也為肝衰竭的臨床管理提供了一種新的潛在工具。

34、dr5的主要形式是i型跨膜蛋白，但其細胞外結構域可以在血漿中作為可溶性單體表達，從而產生可溶性dr5(sdr5)。一般認為，患者血清中可溶性dr5的增加與腫瘤細胞的擴增與中性粒細胞增多相關，中性粒細胞顯著增多提示機體處于炎癥狀態(tài)，又是慢加急性肝衰竭的重要特征之一。因此，dr5不僅在大部分肝癌中高表達，也是aclf中細胞壞死、凋亡的重要靶點，這表明dr5不僅可以作為評估肝衰竭的重要指標，還可以作為評估hcc預后的重要指標。

35、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)dr5的表達水平與肝癌基礎上的肝衰竭發(fā)展相關，為該領域提供了一個新的生物標志物，將dr5可溶性片段sdr5作為一種預測肝癌基礎上發(fā)生的慢加急性肝衰竭的新型分子標志物具有重要意義與臨床價值。dr5的表達水平能夠作為早期診斷肝癌基礎上發(fā)生肝衰竭的指標，有助于及時識別高風險患者，通過對其早期診斷和治療，可能有助于提高肝癌基礎上肝衰竭患者的生存率；dr5的表達還可能有助于評估肝癌患者肝衰竭的嚴重程度和預后。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)能夠促進針對dr5的藥物開發(fā)，為治療肝癌基礎上的肝衰竭提供新的藥物靶點。此外，dr5與肝癌基礎上肝衰竭的關聯(lián)性研究可能促進肝病學、腫瘤學和生物標志物研究等領域的交叉合作。

36、在正確識別hcc-aclf風險方面，dr5特異性表現(xiàn)出色，高達96.74％，同時其敏感性達到70.59％，提示利用dr5進行hcc-aclf風險預測既能保證正確分類的比例，還能提高診斷的正確率，在決策支持方面的應用價值高。

37、進一步地，dr5、tbil和inr三指標模型可以作為臨床決策的有力工具，輔助醫(yī)生制定基于風險評估的治療計劃。在得到dr5、tbil和inr三指標模型的預測結果后，臨床醫(yī)生可以區(qū)分出不同類患者最優(yōu)的治療方案。例如，有的患者采取優(yōu)先保肝、抗炎、抗感染等針對基礎疾病的支持治療；還有的患者采用靶向、免疫及介入微創(chuàng)手術等為主的系統(tǒng)治療等。