本發(fā)明屬于生物納米，特別是涉及一種膜張力響應(yīng)型的分子傳感器及其制備及應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞和細(xì)胞器被包裹在脂質(zhì)膜中，這些膜的機(jī)械特性在細(xì)胞分裂、內(nèi)吞作用和細(xì)胞遷移等各種細(xì)胞活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。在這些特性中，膜張力是膜變形過(guò)程中的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因素，在調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活動(dòng)中起著重要作用。例如，高膜張力可以通過(guò)抵消曲率傳感/產(chǎn)生bar家族蛋白而有效抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。傳統(tǒng)的膜張力測(cè)量方法依賴于牽引力測(cè)量技術(shù)，即使用光學(xué)鑷子或微管抽吸技術(shù)從脂質(zhì)雙分子層中提取小膜管并測(cè)量其恢復(fù)力。這些技術(shù)受限于較低的時(shí)空分辨率和較小的測(cè)試范圍，使其難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)在大視野范圍內(nèi)檢測(cè)膜張力(例如，整個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞)。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種可視化的具備高細(xì)胞膜靶向性和機(jī)械敏感的技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜張力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種膜張力響應(yīng)型的分子傳感器的制備及應(yīng)用方法，具備高細(xì)胞膜靶向性和機(jī)械敏感等優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)胞膜張力檢測(cè)提供了新工具。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種膜張力響應(yīng)型的分子傳感器，包括核酸框架結(jié)構(gòu)和振動(dòng)誘導(dǎo)發(fā)光分子，所述振動(dòng)誘導(dǎo)發(fā)光分子又稱vie分子，其中，所述vie分子被鏈接于所述核酸框架結(jié)構(gòu)；

3、并且，所述的核酸框架結(jié)構(gòu)是親水性的，而所述vie分子為疏水性的。

4、在另一優(yōu)選例中，所述核酸框架結(jié)構(gòu)通過(guò)親水性的核酸單體自組裝形成。

5、在另一優(yōu)選例中，所述自組裝通過(guò)多條核酸單體的互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行。

6、在另一優(yōu)選例中，所述的核酸單體包括鏈接有所述vie分子的核酸單體。

7、在另一優(yōu)選例中，當(dāng)激發(fā)光照射時(shí)，，所述的vie分子處于激發(fā)態(tài)，其構(gòu)象會(huì)依次處于以下構(gòu)象或發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變：彎曲構(gòu)象、平面構(gòu)象和扭曲構(gòu)象，并通過(guò)發(fā)射熒光回到基態(tài)。

8、在另一優(yōu)選例中，膜張力發(fā)生變化時(shí)，上述的振動(dòng)誘導(dǎo)發(fā)光分子構(gòu)象變化過(guò)程受到抑制程度也發(fā)生變化，最終導(dǎo)致發(fā)生不同的熒光光譜。

9、在另一優(yōu)選例中，所述的分子傳感器具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特性：

10、(a)所述的分子傳感器固定于或富集于細(xì)胞膜；

11、(b)所述的分子傳感器具有高的細(xì)胞膜/細(xì)胞內(nèi)的分配比r；

12、(c)所述的分子傳感器的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在450nm-700nm；

13、(d)所述的分子傳感器的熒光發(fā)射波長(zhǎng)b1不同于單獨(dú)的vie分子的熒光發(fā)射波長(zhǎng)b2。

14、在另一優(yōu)選例中，所述的分配比r為位于細(xì)胞膜處的分子傳感器數(shù)量c1與位于細(xì)胞內(nèi)的分子傳感器數(shù)量c2的比值c1/c2。

15、在另一優(yōu)選例中，所述的分配比r為位于細(xì)胞膜處的分子傳感器發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度q1與位于細(xì)胞內(nèi)的分子傳感器的熒光信號(hào)強(qiáng)度q2的比值q1/q2。

16、在另一優(yōu)選例中，所述的分配比r≥1，較佳地≥2，更佳地≥3，如1.5-1?0或2-5。

17、在一個(gè)優(yōu)選例中，包括：

18、所述的鏈接有所述vie分子的核酸單體ssdna-vie具有式i結(jié)構(gòu)：

19、z1-l-z2???(i)

20、式中，

21、z1為vie分子；

22、z2為核酸單體；

23、l為位于z1和z2之間的連接基團(tuán)。

24、在另一優(yōu)選例中，所述的核酸包括dna、rna、或其組合。

25、在另一優(yōu)選例中，所述的式i結(jié)構(gòu)是(i)炔基或烷基修飾的vie分子和(ii)疊氮基團(tuán)修飾的核酸單鏈通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)形成的。

26、在另一優(yōu)選例中，所述的炔基或烷基修飾的vie分子具有下式結(jié)構(gòu)：

27、

28、在另一個(gè)優(yōu)選例中，l為-l1-l2-l3-，其中，l1為-苯基-o-；l2為c3-c7的取代或未取代亞烷基；l3為點(diǎn)擊反應(yīng)形成的連接基團(tuán)，如

29、在另一優(yōu)選例中，所述的l2為c3～c7亞烷基。

30、在另一優(yōu)選例中，所述核酸框架結(jié)構(gòu)中，包含至少一條式i結(jié)構(gòu)的核酸單體。

31、在另一優(yōu)選例中，所述核酸框架結(jié)構(gòu)中，包含n個(gè)式i結(jié)構(gòu)的核酸單體，其中n為≥1的正整數(shù)。

32、在另一優(yōu)選例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

33、在另一優(yōu)選例中，一個(gè)核酸框架結(jié)構(gòu)鏈接m個(gè)vie分子，其中m為≥1的正整數(shù)。

34、在另一優(yōu)選例中，m為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

35、在一個(gè)優(yōu)選例中，包括：

36、所述的vie分子位于所述核酸框架結(jié)構(gòu)中的預(yù)定位置。

37、在另一優(yōu)選例中，多個(gè)vie分子分散位于所述核酸框架結(jié)構(gòu)中的預(yù)定位置。

38、在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的vie分子位于所述核酸框架結(jié)構(gòu)中定點(diǎn)位置。

39、在另一個(gè)優(yōu)選例中，核酸框架結(jié)構(gòu)和vie分子是共價(jià)連接的。

40、在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述核酸框架結(jié)構(gòu)控制所述vie分子的價(jià)態(tài)和空間位置。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的分子傳感器通過(guò)所述vie分子錨定或結(jié)合于膜的外表面。

42、在另一優(yōu)選例中，一個(gè)核酸框架結(jié)構(gòu)鏈接m個(gè)vie分子，其中m為≥1的正整數(shù)。

43、在另一優(yōu)選例中，m為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

44、在另一優(yōu)選例中，所述的膜張力響應(yīng)型中的膜包括通過(guò)擠壓或電激磷脂形成的模型膜。

45、在另一優(yōu)選例中，所述的膜包括活細(xì)胞的細(xì)胞膜。

46、在一個(gè)優(yōu)選例中，包括：

47、所述的核酸框架結(jié)構(gòu)為平面結(jié)構(gòu)或多面體結(jié)構(gòu)。

48、在另一優(yōu)選例中，所述的多面體結(jié)構(gòu)包括：四面體狀結(jié)構(gòu)、六面體狀結(jié)構(gòu)、八面體狀結(jié)構(gòu)。

49、在另一優(yōu)選例中，所述的核酸框架結(jié)構(gòu)為剛性或基本剛性的。

50、在另一優(yōu)選例中，所述多面體邊長(zhǎng)的范圍為5-6.5nm。

51、在另一優(yōu)選例中，所述多面體邊長(zhǎng)的范圍為10-20bp或nt。

52、在一個(gè)優(yōu)選例中，所述核酸框架結(jié)構(gòu)的核酸納米外殼為中空的四面體狀結(jié)構(gòu)，所述核酸框架結(jié)構(gòu)由四條互補(bǔ)的ssdna鏈制備構(gòu)成。

53、在另一優(yōu)選例中，所述四條互補(bǔ)的ssdna鏈包括至少一條式i結(jié)構(gòu)的核酸單體。

54、在另一優(yōu)選例中，一個(gè)所述四面體狀的核酸框架結(jié)構(gòu)鏈接一至三個(gè)所述vie分子。

55、本發(fā)明的第二方面，提供了一種基于上述分子傳感器的制備方法，包括：

56、(a)將所述vie分子與ssdna進(jìn)行化學(xué)連接，形成式i所示的鏈接有所述vie分子的核酸單體ssdna-vie：

57、z1-l-z2???(i)

58、式中，

59、z1為vie分子；

60、z2為核酸單體；

61、l為位于z1和z2之間的連接基團(tuán)。

62、(b)所述的式i所示的核酸單體通過(guò)自組裝形成核酸框架結(jié)構(gòu)，從而形成權(quán)利要求1所述的分子傳感器。

63、在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，進(jìn)行的自組裝的核酸單體包括：(i)式i所示的核酸單體，和(ii)任選的一條或多條未偶聯(lián)vie分子的核酸單體。

64、(c)進(jìn)行加熱和退火，其中通過(guò)改變ssdna-vie和未修飾的ssdna的相對(duì)比例，控制vie分子的數(shù)量。

65、在一個(gè)優(yōu)選例中，包括：

66、通過(guò)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)將所述vie分子與ssdna進(jìn)行化學(xué)連接；

67、在另一優(yōu)選例中，通過(guò)pcr儀對(duì)多條互補(bǔ)的ssdna鏈制備核酸框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行加熱和退火。

68、本發(fā)明的第三方面，提供了一種基于上述分子傳感器的用途，所述用途包括：用于制備測(cè)量細(xì)胞膜張力的試劑。

69、本發(fā)明的第四方面，提供了一種測(cè)定細(xì)胞膜張力的方法，所述方法包括：

70、(a)將權(quán)利要求1所說(shuō)的分子傳感器和細(xì)胞膜共混；

71、(b)觀測(cè)權(quán)利要求1所述的分子傳感器所發(fā)出的熒光信號(hào)。

72、在另一優(yōu)選例中，在室溫條件下孵育的時(shí)長(zhǎng)為20min。

73、在另一優(yōu)選例中，使用共聚焦掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行熒光成像。

74、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：

75、(c)基于熒光信號(hào)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)膜，從而測(cè)定細(xì)胞膜的張力。

76、本發(fā)明實(shí)施方式與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要區(qū)別及其效果在于：

77、解決了現(xiàn)有膜張力探針?biāo)苄圆睿资芴结槤舛扔绊?，?xì)胞膜靶向性差的問(wèn)題。

78、進(jìn)一步地，具有高效細(xì)胞膜靶向性，非濃度依賴性，模型膜磷脂有序區(qū)分性，細(xì)胞膜張力響應(yīng)性，生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。相比現(xiàn)有納米熒光探針具有顯著優(yōu)勢(shì)，為生物成像提供了新的工具。

79、進(jìn)一步地，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜張力的熒光比率成像，揭示了這種多功能分子傳感器在活細(xì)胞應(yīng)用中的巨大潛力。

80、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。