1.本發(fā)明當(dāng)前要求保護(hù)的實(shí)施方案涉及用于測(cè)定受試者疾病的裝置、方法和試劑盒，以及更具體地，涉及通過選擇性地標(biāo)記、捕獲和定量細(xì)胞外囊泡(ev)測(cè)定受試者疾病的裝置、方法和試劑盒。2.相關(guān)技術(shù)討論2020年，原發(fā)性肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。1在美國，盡管過去十年的發(fā)病率和死亡率趨勢(shì)平穩(wěn)，2,3據(jù)估計(jì)2021年原發(fā)性肝癌的死亡人數(shù)超過30000人。4肝細(xì)胞癌(hcc)占原發(fā)性肝癌的80-85％，5,6并且主要發(fā)生在肝硬化或慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染的患者中。6hcc的預(yù)后不佳主要是由于診斷時(shí)疾病已進(jìn)入晚期，并且研究表明，早期發(fā)現(xiàn)hcc與增加對(duì)治愈性治療的接受和改善患者預(yù)后有關(guān)。3,7目前的臨床實(shí)踐指南推薦，對(duì)高?；颊哌M(jìn)行一年兩次的聯(lián)合/不聯(lián)合血清甲胎蛋白(afp)的肝超聲hcc監(jiān)測(cè)，以實(shí)現(xiàn)在治愈階段發(fā)現(xiàn)hcc的目標(biāo)。8,9然而，它們的準(zhǔn)確性仍然相對(duì)較低，在特異性為90％時(shí)，靈敏度在60％-70％之間。10-13因此，仍然迫切需要用于早期發(fā)現(xiàn)hcc的新型生物標(biāo)志物。細(xì)胞外囊泡(ev)是指正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都釋放的納米顆粒。14,15ev被脂質(zhì)雙層膜包裹，含有包括dna、rna、蛋白質(zhì)、代謝物以及脂質(zhì)在內(nèi)的生物分子。通過轉(zhuǎn)移這些貨物，腫瘤來源的ev參與細(xì)胞間通信和癌癥進(jìn)展。鑒于它們?cè)谀[瘤發(fā)生過程中的早期存在于循環(huán)中，對(duì)腫瘤來源的ev進(jìn)行分析被認(rèn)為是診斷早期癌癥的一種有希望的液相活檢方法。14,15已經(jīng)有數(shù)項(xiàng)研究調(diào)查了ev在高?；颊咧邪l(fā)現(xiàn)hcc的作用，結(jié)果非常有希望。14,16,17例如，von?felden等和tseng等證明，ev中的非編碼rna16和mrna17標(biāo)志物可以分別用于區(qū)分巴塞羅那診所肝癌(bclc)0至a期hcc和肝硬化，其受試者操作特性曲線下面積(aurocs)為0.93。因此，ev在改進(jìn)當(dāng)前監(jiān)測(cè)策略和改善hcc患者的結(jié)局上具有巨大的潛力。鑒于目前發(fā)現(xiàn)早期肝細(xì)胞癌(hcc)的監(jiān)測(cè)方法的靈敏度是次優(yōu)的。細(xì)胞外囊泡(ev)是用于癌癥早期發(fā)現(xiàn)的有希望的循環(huán)生物標(biāo)志物。在本研究中，我們旨在開發(fā)一種基于hcc?ev的表面蛋白測(cè)定，用于hcc的早期發(fā)現(xiàn)。援引加入本文所示的所有出版物和專利申請(qǐng)均通過引用將它們的全部內(nèi)容并入，并且其程度與每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體和單獨(dú)地表明通過引用并入相同。

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一種受試者疾病的測(cè)定方法，包括：用第一dna條形碼選擇性地標(biāo)記來自所述受試者的樣本的細(xì)胞外囊泡(ev)，包括：用來自第一生物正交官能團(tuán)的第一分子功能化ev的第一捕獲劑，使得所述第一捕獲劑仍可連接到ev，并且所述第一分子能夠連接來自第二生物正交官能團(tuán)的第二分子，所述第二分子與所述第一分子互補(bǔ)，用第二分子功能化所述dna條形碼，連接所述功能化的第一捕獲劑與所述功能化的dna條形碼，以形成條形碼化的捕獲劑，將所述條形碼化的捕獲劑與所述樣本混合，以形成標(biāo)記的樣本；選擇性地捕獲來自所述受試者的所述樣本的所述ev，包括：用來自第三生物正交官能團(tuán)的第三分子功能化所述ev的第二捕獲劑，使得所述第二捕獲劑仍然可連接到所述ev，并且所述第三分子也能夠結(jié)合來自第四生物正交官能團(tuán)的第四分子，所述第四分子與所述第三分子互補(bǔ)，將所述功能化的第二捕獲劑與所述標(biāo)記的樣本混合，使得所述功能化的第二捕獲劑結(jié)合所述ev形成活化的樣本，用所述第四分子功能化捕獲表面，以及在功能化的捕獲表面的至少一部分上沉積所述活化的樣本的至少一部分，從而通過所述第四分子與所述第三分子的結(jié)合選擇性地捕獲所述ev；通過核酸測(cè)試測(cè)定所述第一dna條形碼；以及通過測(cè)定來自所述ev的所述第一dna條形碼確定所述受試者是否存在所述疾病。

2、一種受試者疾病的測(cè)定方法，包括：用第一dna條形碼選擇性地標(biāo)記來自所述受試者的樣本的細(xì)胞外囊泡(ev)，包括：用來自第一生物正交官能團(tuán)的第一分子功能化ev的第一捕獲劑，使得所述第一捕獲劑仍可連接到ev，并且所述第一分子能夠連接來自第二生物正交官能團(tuán)的第二分子，所述第二分子與所述第一分子互補(bǔ)，用第二分子功能化所述dna條形碼，連接所述功能化的第一捕獲劑與所述功能化的dna條形碼，以形成條形碼化的捕獲劑；用來自第三生物正交官能團(tuán)的第三分子功能化所述ev的第二捕獲劑，使得所述第二捕獲劑仍可連接到所述ev，并且所述第三分子能夠連接來自第四生物正交官能團(tuán)的第四分子，所述第四分子與所述第三分子互補(bǔ)，將所述條形碼化的捕獲劑以及所述功能化的第二捕獲劑與所述樣本混合，以形成活化的樣本；從來自所述受試者的所述樣本選擇性地捕獲所述ev，包括：用所述第四分子功能化捕獲表面，以及在功能化的捕獲表面的至少一部分上沉積所述活化的樣本的至少一部分，從而通過所述第四分子與所述第三分子的結(jié)合選擇性地捕獲所述ev；通過核酸測(cè)試測(cè)定所述第一dna條形碼；以及通過測(cè)定來自所述ev的所述第一dna條形碼確定所述受試者是否存在所述疾病。

3、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中選取的用于捕獲所述ev的所述第二捕獲劑是腫瘤特異性捕獲劑并且結(jié)合腫瘤來源的ev特異性表達(dá)的表面標(biāo)志物。

4、前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中選擇性地捕獲來自受試者的樣本的細(xì)胞外囊泡(ev)，在用第一dna條形碼選擇性地標(biāo)記來自所述受試者的所述樣本的所述ev之前進(jìn)行。

5、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法，進(jìn)一步包括：重復(fù)用第二dna條形碼選擇性地標(biāo)記來自所述樣本的所述細(xì)胞外囊泡(ev)，使得所述ev被與所述ev不同區(qū)域結(jié)合的不同第一捕獲劑標(biāo)記，所述第一dna條形碼和第二dna條形碼彼此可區(qū)分；使用核酸測(cè)試測(cè)定所述第二dna條形碼；以及通過測(cè)定來自所述ev的所述第一dna條形碼和第二dna條形碼確定所述受試者是否存在所述疾病。

6、根據(jù)前述實(shí)施方案的測(cè)定方法，進(jìn)一步包括：重復(fù)用更多種dna條形碼選擇性標(biāo)記來自所述樣本的所述細(xì)胞外囊泡(ev)，使得所述ev被各自與所述ev不同區(qū)域結(jié)合的多種不同捕獲劑標(biāo)記，所述第一dna條形碼和更多種dna條形碼各自彼此可區(qū)分；使用多重核酸測(cè)試測(cè)定所述更多種dna條形碼；以及通過測(cè)定所述多種dna條形碼確定表面蛋白表達(dá)特征。

7、根據(jù)前述實(shí)施方案的測(cè)定方法進(jìn)一步包括：多次重復(fù)選擇性地標(biāo)記、選擇性地捕獲、dna條形碼的測(cè)定以及表面蛋白表達(dá)特征的確定，以預(yù)測(cè)疾病階段和/或區(qū)分不同疾病階段。各自選擇性地捕獲使用一種捕獲劑，所述捕獲劑結(jié)合所述ev的一部分，所述部分不同于其它捕獲劑用于選擇性地捕獲的部分。

8、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法進(jìn)一步包括：在測(cè)定前從所捕獲的ev釋放所述dna條形碼。

9、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法是通過，在用多種dna條形碼選擇性地標(biāo)記來自所述受試者的所述樣本的所述ev之前，選擇性地捕獲來自受試者的樣本的細(xì)胞外囊泡(ev)實(shí)施的。

10、根據(jù)前述實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中表面蛋白表達(dá)特征在不同的疾病階段之間有區(qū)分。

11、根據(jù)前述實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中epcam+cd63+在hcc?ev上的表達(dá)、cd147+cd63+在hcc?ev上的表達(dá)以及gpc3+cd63+

12、在hcc?ev上的表達(dá)，與肝硬化患者相比，在肝癌(hcc)患者中更高。

13、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中使得能夠捕獲所述ev的所述捕獲劑被選自反式環(huán)辛烯(tco)、炔烴以及環(huán)辛炔的第三生物正交官能團(tuán)功能化，并且其中所述捕獲表面被選自四嗪(tz)和疊氮化物的第四生物正交官能團(tuán)功能化。

14、根據(jù)前述任一項(xiàng)實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中所述捕獲表面是懸浮液中珠的表面。

15、根據(jù)前述任一項(xiàng)實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中所述捕獲表面是微流體裝置的表面。

16、根據(jù)前述任一項(xiàng)實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中所述測(cè)定包括使用多重pcr。

17、根據(jù)前述任一項(xiàng)實(shí)施方案的測(cè)定方法，其中所述測(cè)定包括使用下一代測(cè)序工藝。

18、根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的用于測(cè)定受試者疾病的試劑盒，

19、包括：多種捕獲劑，其中的每一個(gè)結(jié)合ev的不同區(qū)域；具有互補(bǔ)生物正交官能團(tuán)的多種分子；多種dna條形碼；以及用所述多種dna條形碼標(biāo)記所述ev、捕獲所述ev、測(cè)定所述多種dna條形碼以及通過測(cè)定確定受試者是否存在所述疾病或預(yù)測(cè)所述疾病的階段的說明書。

20、根據(jù)前述實(shí)施方案的試劑盒進(jìn)一步包括在測(cè)定之前釋放所述多種dna條形碼的說明書。