本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白定量檢測(cè)的試劑盒，能夠用于海洋環(huán)境雌激素污染監(jiān)測(cè)。

背景技術(shù)：

環(huán)境雌激素是一種類型多樣的環(huán)境污染物，能夠干擾生物體內(nèi)激素的合成、釋放、運(yùn)輸、代謝、結(jié)合等一系列生物學(xué)過(guò)程，從而擾亂生物體內(nèi)的正常激素水平和內(nèi)分泌系統(tǒng)機(jī)能，并進(jìn)一步對(duì)生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生有害影響，如影響野生動(dòng)物的繁殖過(guò)程、種群性別比例及規(guī)模等。近年來(lái)，海洋環(huán)境雌激素污染問(wèn)題引起了越來(lái)越多的關(guān)注，在日本東京灣、加拿大圣約翰港以及西班牙比斯開(kāi)灣等海域均發(fā)現(xiàn)了不同程度的海洋環(huán)境雌激素污染。在我國(guó)也同樣發(fā)現(xiàn)了類似的情況。例如，受環(huán)境雌激素影響的遼東灣野生梭魚(yú)雌雄同體發(fā)生率高達(dá)50％以上。目前，環(huán)境雌激素已經(jīng)成為威脅海洋環(huán)境健康的重要因素之一。

對(duì)環(huán)境雌激素的污染水平進(jìn)行精確的監(jiān)測(cè)和評(píng)估是實(shí)現(xiàn)其污染控制的必要途徑。相比傳統(tǒng)的化學(xué)監(jiān)測(cè)，生物監(jiān)測(cè)能夠直觀的反映環(huán)境雌激素的綜合毒性效應(yīng)，是更為理想的環(huán)境雌激素污染監(jiān)測(cè)的技術(shù)手段。其中，魚(yú)類卵黃原蛋白(vitellogenin,vtg)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)是最為常用的環(huán)境雌激素監(jiān)測(cè)方法。vtg是卵黃蛋白的前體，在卵黃形成期17β-雌二醇的刺激下，由肝臟合成和分泌，通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至卵巢，作為胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)源。在通常情況下，vtg由卵黃生成期的雌魚(yú)大量合成，雄魚(yú)與幼魚(yú)因缺少雌激素而不能合成，但其肝臟也具有雌激素受體，在外源雌激素的作用下，也可被誘導(dǎo)合成與分泌vtg。因此，雄魚(yú)或幼魚(yú)體內(nèi)的vtg水平是指示環(huán)境雌激素污染的理想指標(biāo)。

目前，已建立成熟實(shí)驗(yàn)方法的模式魚(yú)類均為淡水魚(yú)類，如斑馬魚(yú)、黑頭呆魚(yú)、稀有鮈鯽等。海水環(huán)境與淡水環(huán)境的差異導(dǎo)致環(huán)境雌激素在海洋環(huán)境中的生態(tài)毒理學(xué)特性與淡水環(huán)境明顯不同，這些淡水實(shí)驗(yàn)生物難以直接用于監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境中的環(huán)境雌激素類物質(zhì)。海水青鳉魚(yú)(oryziasmelastigma)，又名黑點(diǎn)青鳉，原產(chǎn)于巴基斯坦、印度、緬甸和泰國(guó)沿海及淡水水域，具有體型小、對(duì)環(huán)境污染物反應(yīng)敏感、易于辨別雌雄、鹽度適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是新興的海洋生態(tài)毒理學(xué)模式生物。開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的海水青鳉魚(yú)vtg定量檢測(cè)方法，將有助于海洋環(huán)境雌激素污染的監(jiān)測(cè)與控制。然而，目前尚未建立使用海水青鳉魚(yú)vtg同源抗體的定量檢測(cè)方法。雖然使用異源抗體也能夠檢測(cè)海水青鳉魚(yú)vtg，但相比同源抗體，異源抗體的檢測(cè)靈敏度和特異性較低，制約了海水青鳉魚(yú)在海洋環(huán)境雌激素污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。因此，亟需制備海水青鳉魚(yú)vtg的同源抗體，并建立相應(yīng)的定量檢測(cè)方法及商品化試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白定量檢測(cè)的試劑盒、制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種用于海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白定量檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括1個(gè)盒體，盒體內(nèi)裝有：1塊空白96孔酶標(biāo)板；1支海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使用前用樣品稀釋液稀釋到所需濃度；1支兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，使用前用包被液稀釋至5μg/ml；1支辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，使用前用樣品稀釋液按1：2500的比例稀釋；包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1瓶。

所述的包被液為50mmph9.6碳酸鹽緩沖液；所述的封閉液為含2％bsa的ph7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的樣品稀釋液為含0.05％tween-20及1％bsa的磷酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含0.05％tween-20的150mmph7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的顯色液為tmb單組分顯色液；所述的終止液為2m的h2so4水溶液。

上述用于海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白定量檢測(cè)的試劑盒的制備方法，主要制備海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，包括以下步驟：

所述的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括如下步驟：

1)采用水體暴露17β-雌二醇的方法誘導(dǎo)海水青鳉魚(yú)合成卵黃原蛋白，其中，17β-雌二醇的暴露濃度為50～200μg/l。將海水青鳉魚(yú)成魚(yú)置于5l的玻璃水族箱中，每個(gè)玻璃水族箱中放入10尾海水青鳉魚(yú)；每天全部換水，并重新加入相應(yīng)量的17β-雌二醇，保持暴露濃度不變；早晚飼喂餌料，保持水溫25℃，自然光照。

2)取暴露10天后的海水青鳉魚(yú)，稱重，加入海水青鳉魚(yú)3倍質(zhì)量的冰冷勻漿緩沖液，冰浴勻漿，勻漿液低溫離心10分鐘，收集上清液。所述的勻漿緩沖液為25mmtris,內(nèi)含0.07mnacl和0.5tiu/ml抑肽酶,ph7.6。

3)將收集到的上清液用于凝膠過(guò)濾層析，用25mmtri-hcl勻漿緩沖液以1ml/min的流速?zèng)_流層析柱，收集主洗脫峰，其中，25mmtri-hcl勻漿緩沖液內(nèi)含0.07mnacl和0.5tiu/ml抑肽酶,ph7.6。再將洗脫液加入陰離子交換層析柱，用分別含有0.07、0.1、0.2和1mnacl的25mmtris-hcl勻漿緩沖液繼續(xù)以1ml/min的流速洗脫，每個(gè)梯度沖洗60min，收集0.2m洗脫峰，即為海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，其中，25mmtris-hcl勻漿緩沖液(內(nèi)含0.5tiu/ml抑肽酶，ph7.5。

所述的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟：

取純化的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后制成免疫試劑，對(duì)雄性、健康新西蘭大白兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量0.1ml；隨后，每隔兩周加強(qiáng)免疫1次，單次免疫劑量為600μg，并使用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，連續(xù)加強(qiáng)免疫5次；第5次免疫后5天心臟采血，6000r/min離心20分鐘，收集血漿，獲得兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等體積的冰冷飽和硫酸銨溶液，4℃震蕩2小時(shí)后離心，棄去上清液，沉淀用10mlpbs緩沖液溶解；獲得的溶液使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，隨后加入到親和層析柱中，以pbs緩沖液洗脫10倍柱體積后，用ph2.7的0.1m甘氨酸洗脫，即獲得兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體。

所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟：

稱取6mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于2ml去離子水中，加入0.4ml新鮮配置的0.1m的naio4溶液，室溫避光條件下磁力攪拌20分鐘；將獲得的溶液裝入透析袋中，對(duì)1mmph4.4的醋酸鈉緩沖液4℃避光透析8-12小時(shí)；隨后，向其中加入0.5ml0.16m的乙二醇水溶液，室溫放置30分鐘；加入3mg的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，并混合均勻，裝入透析袋中，對(duì)0.05mph9.5的碳酸鹽緩沖液4℃避光透析8-12小時(shí)；向其中加入0.1ml5mg/ml的nabh4溶液，混合均勻后4℃放置2小時(shí)；緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃離心后棄去上清液，利用0.15mph7.4的pbs緩沖液溶解沉淀；裝入透析袋中，對(duì)pbs緩沖液4℃避光透析8-12小時(shí)；3000r/min離心獲取上清液即為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體。

應(yīng)用上述試劑盒進(jìn)行海洋環(huán)境雌激素污染檢測(cè)，包括以下步驟：

(1)采用盒體中的包被液稀釋兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體至5μg/ml，向96孔酶標(biāo)板的各孔中加入100μl該溶液，4℃包被8-12小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；

(2)向96孔酶標(biāo)板加入封閉液300μl，室溫下封閉1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；

(3)利用樣品稀釋液將海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為3.9、7.8、15.62、31.25、62.5、125及250ng/ml的濃度梯度，按100μl/孔的量將不同濃度梯度的海水青鳉魚(yú)卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別加入96孔酶標(biāo)板不同的孔中，37℃下孵育1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；所述的待測(cè)樣品為海水，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍之內(nèi)。

(4)采用盒體中的樣品稀釋液將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體稀釋2500倍，每孔加入該稀釋抗體100μl，37℃下孵育1小時(shí)；

(5)每孔加入100μl顯色液，37℃避光反應(yīng)10分鐘；

(6)反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μl終止液，并用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定需在反應(yīng)終止后15分鐘內(nèi)完成；

(7)計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將待測(cè)樣品的吸光值代入方程式，計(jì)算得到待測(cè)樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測(cè)樣品中海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白的實(shí)際濃度。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本試劑盒首次利用海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白同源抗體進(jìn)行檢測(cè)，相比其他利用異源抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)度高的優(yōu)點(diǎn)。

(2)本試劑盒采用雙抗夾心法定量檢測(cè)海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白，相比其他方法具有操作方法簡(jiǎn)便、快速、工作量小的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的試劑盒對(duì)海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明的試劑盒對(duì)雄性及雌性海水青鳉魚(yú)勻漿液的定量檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一下說(shuō)明。

一種用于海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白定量檢測(cè)的試劑盒，包括1個(gè)盒體，盒體內(nèi)裝有：96孔酶標(biāo)板1塊，包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1瓶。其特征在于該試劑盒還裝有海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1支、兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支。

制備該試劑盒包括以下步驟：

(1)制備海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；

(2)制備兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體；

(3)制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體；

其中，所述(1)制備海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品方法如下：

采用水體暴露17β-雌二醇的方法誘導(dǎo)海水青鳉魚(yú)合成卵黃原蛋白。將海水青鳉魚(yú)成魚(yú)置于5l的玻璃水族箱中，每個(gè)玻璃水族箱中放入10尾海水青鳉魚(yú)；17β-雌二醇的暴露濃度為100μg/l，每天全部換水，并重新加入相應(yīng)量的17β-雌二醇，以保持暴露濃度不變；早晚飼喂餌料，保持水溫25℃，自然光照；暴露10天后將斑馬魚(yú)放入50％的酒精中麻醉處死，稱重，并加入3倍體積冰冷的勻漿緩沖液(25mmtris,內(nèi)含0.07mnacl和0.5tiu/ml抑肽酶,ph7.6)，冰浴勻漿，勻漿液低溫離心10分鐘，收集上清液；將收集到的上清液用于凝膠過(guò)濾層析(sephacryls-300)，用25mmtri-hcl緩沖液(內(nèi)含0.07mnacl和0.5tiu/ml抑肽酶,ph7.6)以1ml/min的流速?zèng)_流層析柱，收集主洗脫峰；再將洗脫液加入deae-sepharose陰離子交換層析柱，用分別含有0.07、0.1、0.2和1mnacl的25mmtris-hcl緩沖液(內(nèi)含0.5tiu/ml抑肽酶，ph7.5)繼續(xù)以1ml/min的流速洗脫，每個(gè)梯度沖洗60min，收集0.2m洗脫峰，即為海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

所述(2)制備兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體方法如下：

取800μg純化的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)雄性、健康新西蘭大白兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量0.1ml；隨后，每隔兩周加強(qiáng)免疫1次，單次免疫劑量為600μg，并使用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，共連續(xù)加強(qiáng)免疫5次；第5次免疫后5天心臟采血，6000r/min離心20分鐘，收集血漿，獲得兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等體積的冰冷飽和硫酸銨溶液，4℃震蕩2小時(shí)后離心，棄去上清液，沉淀用10mlpbs緩沖液溶解；獲得的溶液使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，隨后加入到hitrapproteing親和層析柱中，以pbs緩沖液洗脫10倍柱體積后，用ph2.7的0.1m甘氨酸洗脫，即獲得兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體。

所述(3)制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體方法如下：

稱取6mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于2ml去離子水中，加入0.4ml新鮮配置的0.1m的naio4溶液，室溫避光條件下磁力攪拌20分鐘；將獲得的溶液裝入透析袋中，對(duì)1mmph4.4的醋酸鈉緩沖液4℃透析過(guò)夜；隨后，向其中加入0.5ml0.16m的乙二醇水溶液，室溫放置30分鐘；加入3mg權(quán)利要求1所述的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，并混合均勻，裝入透析袋中，對(duì)0.05mph9.5的碳酸鹽緩沖液4℃透析過(guò)夜；向其中加入0.1ml5mg/ml的nabh4溶液，混合均勻后4℃放置2小時(shí)；緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃離心后棄去上清液，利用0.15mph7.4的pbs緩沖液溶解沉淀；裝入透析袋中，對(duì)pbs緩沖液4℃透析過(guò)夜；3000r/min離心獲取上清液即為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體。

最后，將制備的海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1支、兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支、空白96孔酶標(biāo)版1塊，以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1瓶裝入盒體內(nèi)，構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。

其具體組成如下：

(1)空白96孔酶標(biāo)版1塊；

(2)海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1支，使用前用樣品稀釋液稀釋到所需濃度；

(3)兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支，使用前用包被液稀釋至5μg/ml；

(4)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體1支，使用前用樣品稀釋液按1：2500的比例稀釋；

(5)包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1瓶，所述的包被液為50mmph9.6碳酸鹽緩沖液：1.59gnaco3及2.93gnahco3溶于1l蒸餾水中；洗滌液為含0.05％tween-20的150mmph7.4的磷酸鹽緩沖液：8.0gnacl,0.2gkcl,2.9gna2hpo4·12h2o,0.2gkh2po4及0.5mltween-20溶于1l蒸餾水中；封閉液為含2％bsa的ph7.4的磷酸鹽緩沖液：0.2gbsa溶于10mlph7.4的磷酸鹽緩沖液中；樣品稀釋液為含0.05％tween-20及1％bsa的磷酸鹽緩沖液：0.1gbsa溶于10ml封閉液；顯色液為北京諾博萊德科技有限公司生產(chǎn)的tmb單組分顯色液；終止液為2m的h2so4水溶液。

本試劑盒可以用于海洋環(huán)境雌激素污染的監(jiān)測(cè)，使用時(shí)分為以下步驟：

(1)使用盒體中的包被液稀釋兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體至5μg/ml，向96孔板各孔中加入該溶液100μl，4℃包被過(guò)夜，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；

(2)向96孔板中加入封閉液300μl，室溫下封閉1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；

(3)利用樣品稀釋液將海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為3.9、7.8、15.62、31.25、62.5、125及250ng/ml的濃度梯度，按100μl/孔向96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度或待測(cè)樣品(適當(dāng)稀釋)，37℃下孵育1小時(shí)，棄去孔內(nèi)溶液，使用洗滌液洗滌5次；

(4)使用樣品稀釋液1：2500倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白抗體，每孔加入該稀釋抗體100μl，37℃下孵育1小時(shí)；

(5)每孔加入100μl顯色液，37℃避光反應(yīng)10分鐘；

(6)反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μl終止液，并用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定需在反應(yīng)終止后15分鐘內(nèi)完成；

(7)計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的吸光值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中海水青鳉魚(yú)卵黃原蛋白的實(shí)際濃度。