本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定中藥提取物及其制劑中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮含量的方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

咽炎，在中醫(yī)中屬“喉痹”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為咽炎是由溶血性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等病原體感染引起的咽部粘膜的急性炎癥。中醫(yī)認(rèn)為多因熱邪毒侵襲咽喉，內(nèi)傷于肺，相博不去，致咽喉腫痛；或邪熱壅盛，由肺衛(wèi)傳里，熱邪循經(jīng)灼傷咽喉而成喉痹。臨床主要表現(xiàn)為咽部紅腫、疼痛、干癢不適及異物感，常伴發(fā)熱。本病是以咽喉疼痛，咽部紅腫或有顆粒突起，喉核腫脹不明顯，全身有風(fēng)熱癥狀主要臨床表現(xiàn)的咽部急性炎癥。西醫(yī)治療多以抗生素為主，但多有毒副作用，而且易產(chǎn)生耐藥性，而中醫(yī)中藥治療，具有療效好，副作用小的特點(diǎn)。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為：急性咽炎(急喉痹)分為風(fēng)寒外侵、風(fēng)熱襲肺、肺衛(wèi)熱盛三型。臨床則多見風(fēng)熱襲肺、肺衛(wèi)熱盛兩型。風(fēng)熱襲肺型表現(xiàn)為咽痛，口微渴，發(fā)熱，微惡寒，咽部輕度充血、水腫，舌邊尖紅，苔薄白，脈浮數(shù)。治宜疏風(fēng)清熱，解毒利咽。肺衛(wèi)熱盛型表現(xiàn)為咽痛較劇，口渴多飲，咳嗽、痰粘稠，發(fā)熱，大便偏于干，小便短赤，咽部充血較甚，舌質(zhì)紅，苔薄黃，脈數(shù)有力。治宜泄熱解毒，利咽消腫。

消毒散載于宋代《小兒藥證直訣》，原方為“牛蒡子二兩、甘草半兩、荊芥穗一分?！敝髦危骸隘徴钗闯觯蛞殉鑫茨軇虮?。及治大人、小兒上膈壅熱，咽喉腫痛，胸膈不利”；其制法及用法為“上同為粗末，每服三錢，水一盞半，煎至一盞，溫服，不拘時(shí)?！睔v代主要醫(yī)書中均有該方劑記載，如明代《活幼心方》等。

荊芥穗含揮發(fā)油1.69％，其中主要成分均為胡薄荷酮(pule-gone)，薄荷酮(menthone)，異薄荷酮(isomenthone)和異胡薄荷酮(isopulegone)，薄荷醇(menthol)，辣薄荷酮(piperitone)，辣薄荷烯酮(piperitenone)，葎草烯(humulene)，丁香烯(caryophyllene)，β-蒎烯(β-pinene)等。而這些成分很容易揮發(fā)，傳統(tǒng)工藝中，通過加熱，很容易導(dǎo)致該類成分的損失。甘草中含有甘草甜素(glycyrrhizin，即甘草酸glycyrrhinicacid,c42h62o16)6～14％，為甘草的甜味成分，是一種三萜皂甙。甘草酸水解產(chǎn)生一分子甘草次酸(glycyrrheticacid即glycyrrhetinicacid,c30h46o4)及二分子葡萄糖醛酸(glycuronicacid,c6h10o7)。并含少量甘草黃甙(即甘草甙l(fā)iquiritin,c21h22o9,為一種黃烷醇flavanone的甙，其甙元名甘草素liquiritigenin,,c15h12o4和甘草苦甙glycyamarin)、異甘草黃甙(iso-liquiritin,,c21h24o9)、二羥基甘草次酸(dihydroxyglycyrrheticacid即grabricacid,c30h46o5)、甘草西定(licoricidin,,c25h32o5,即3’，6-二異戊烯－2’，4’，5-三羥基異黃烷)、甘草醇(glycyrol,c21h18o6)、5-0-甲基甘草醇(5-0-methylglycerol,c22h20o6)、異甘草醇(iso-glycyrol,c21h18o6)等。牛蒡子中含牛蒡甙(arctiin)，水解生成牛蒡甙元(arctigenin)及葡萄糖(glucose)。又含羅漢松脂酚(matairesinol)，絡(luò)石甙元(trachelogenin)，倍半木質(zhì)素(sesquiligenan)及脂肪油，其中脂肪酸成分有：花生酸(arachicacid)，硬脂酸(steraicacid)，棕櫚酸(palmiticacid)和亞油酸(linoleicacid)等。

《中國(guó)藥典》(2015版)中，分別有牛蒡子中牛蒡苷、甘草中甘草酸、荊芥(穗)中胡薄荷酮的含量測(cè)定方法，但尚未見有同時(shí)測(cè)定牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法，為了更好地開發(fā)利用“消毒散”這一經(jīng)典古方，本發(fā)明對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行了深入研究，并建立了同時(shí)測(cè)定牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定“消毒散”提取物及制劑中牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法，具體地提供一種用高效液相色譜法測(cè)定“消毒散”提取物及制劑中牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法。

本發(fā)明所述方法包括：

1)分別取牛蒡苷、甘草酸銨和胡薄荷酮標(biāo)準(zhǔn)品及含有牛蒡子、甘草、荊芥穗(或荊芥)中藥材的供試品溶于甲醇水溶液中，分別制成標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液；

2)分別取等體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的峰面積并進(jìn)行計(jì)算，即得供試品中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量。

其中，所述高效液相色譜儀的固定相為碳十八烷基鍵合硅膠；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水溶液。

本發(fā)明方法中，作為優(yōu)選的實(shí)施方案，所述碳十八烷基鍵合硅膠的粒徑為≤5μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm，4μm，3.5μm。

本發(fā)明所述流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水溶液，優(yōu)選為10％～15％甲醇及10％～90％的乙腈的水溶液梯度洗脫。

所述梯度溶液以體積百分比計(jì)，如下表所示：

本發(fā)明所述的一種同時(shí)測(cè)定牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的方法，可以用于任何包含牛蒡子、甘草、荊芥(穗)三味藥材的中藥復(fù)方，及其提取物，及其各種藥物劑型，如片劑、膠囊、口服液、注射劑、顆粒劑等成藥中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的同時(shí)測(cè)定。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，所述小兒咽寧口服液中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量測(cè)定方法，包括：

1)供試品溶液的制備：精密量取小兒咽寧口服液3ml，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇水溶液至刻度，搖勻，濾過，即得。

2)對(duì)照品溶液的制備：分別取牛蒡苷、甘草酸銨、胡薄荷酮對(duì)照品適量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml分別含含0.5mg、0.1mg、0.2mg的對(duì)照品溶液。

3)含量測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定對(duì)照品溶液及供試品溶液的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的含量。

其中，固定相為250×4.6mm,5μm的碳十八烷基鍵合硅膠柱，流動(dòng)相如下表所示梯度洗脫。

檢測(cè)波長(zhǎng)分別為：280nm(牛蒡苷)、237nm(甘草酸)、252nm(胡薄荷酮)，理論塔板數(shù)按牛蒡苷峰計(jì)算不低于3000。

附圖說明

圖1是牛蒡苷、甘草酸銨、胡薄荷酮標(biāo)準(zhǔn)品hplc色譜圖。圖中1.牛蒡苷；2.甘草酸銨；3.胡薄荷酮。

圖2是小兒咽寧口服液樣品hplc色譜圖。圖中1.牛蒡苷；2.甘草酸；3.胡薄荷酮。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明再做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明僅限于以下實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1小兒咽寧口服液(深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司制備，批號(hào)：20160401)中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮的含量測(cè)定

1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250×4.6mm,5μm)；以流動(dòng)相為甲醇-乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相，如下表所示梯度洗脫。

檢測(cè)波長(zhǎng)分別為：280nm(牛蒡苷)、237nm(甘草酸)、252nm(胡薄荷酮)，理論塔板數(shù)按牛蒡苷峰計(jì)算不低于3000。

2)供試品溶液的制備：精密量取小兒咽寧口服液3ml，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇水溶液至刻度，搖勻，濾過，即得。

3)對(duì)照品溶液的制備：分別取牛蒡苷、甘草酸銨、胡薄荷酮對(duì)照品適量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml分別含含0.5mg、0.1mg、0.2mg的對(duì)照品溶液。

4)含量測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定對(duì)照品溶液及供試品溶液的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的含量分別為：9.21mg/ml、0.76mg/ml、0.24mg/ml。

實(shí)施例2小兒咽寧口服液(深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司制備，批號(hào)：20160401)中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮的含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

1)專屬性在優(yōu)選的色譜條件下，小兒咽寧口服液中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮各色譜峰分離良好，無干擾，表明該方法具有較好的專屬性。見圖1.

2)線性精密配成不同濃度的牛蒡苷、甘草酸銨、胡薄荷酮對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液20μl，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以每個(gè)對(duì)照品的進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3個(gè)成分的線性回歸方程及線性范圍，見下表。

3個(gè)成分的線性回歸方程及線性范圍

3)精密度

日內(nèi)精密度(n＝5)準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液20μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15％、1.22％、0.37％。

日間精密度(n＝15)準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液20μl，連續(xù)測(cè)定三天，每天測(cè)定5次，測(cè)定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.63％、1.29％、1.18％。

4)重復(fù)性

取同一樣品(批號(hào)：20160401)6份，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.84％、1.59％、0.63％。

5)加樣回收率

取已知牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮含量的小兒咽寧口服液(深圳海王醫(yī)藥科技研究院有限公司制備，批號(hào)：20160401)1.5ml，精密量取6份，置25ml容量瓶中，每份加入等量的牛蒡苷、甘草酸銨、胡薄荷酮對(duì)照品，加入70％甲醇水溶液至刻度，搖勻，濾過，按“含量測(cè)定”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定各色譜峰面積，計(jì)算加樣回收率分別為：101.19％、100.95％、100.29％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：1.02％、1.14％、1.54％。

6)穩(wěn)定性

準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液20μl，于0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h進(jìn)行測(cè)定，以牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面積進(jìn)行考察，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.71％、0.85％、0.93％，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。