一種制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna損傷的檢測(cè)方法，屬于分析化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
及食品安全
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：dna是生命體的重要遺傳物質(zhì)，但是dna損傷是在生物體內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的事情。外源性的化學(xué)或者生物物質(zhì)及其代謝物，例如生物毒素及其代謝物，經(jīng)常會(huì)對(duì)細(xì)胞中的dna造成氧化（堿基氧化、堿基脫落或單、雙鏈斷裂）和/或堿基修飾（堿基加合物、堿基甲基化或形成嘧啶二聚體）等在內(nèi)的結(jié)構(gòu)性損傷。此類損傷的dna很容易造成基因突變甚至造成機(jī)體的癌變。因此，開展dna損傷檢測(cè)對(duì)與環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全（特別是跨境食品安全）等都密切相關(guān)，目前急需發(fā)展針對(duì)dna損傷產(chǎn)物的高特異性、高靈敏的新型快速檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)外源性的化學(xué)與生物物質(zhì)對(duì)dna損傷的程度進(jìn)行準(zhǔn)確和定量分析。圓二色光譜的產(chǎn)生是由于體系中的手性物質(zhì)對(duì)左右圓偏振光的吸收不同。目前，圓二色光譜主要是通過測(cè)量生物大分子的光譜學(xué)信號(hào)，從而對(duì)其二級(jí)或者三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。近年來，手性納米組裝超結(jié)構(gòu)成為人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)問題，特別是自從我們?cè)?009年成功構(gòu)建了具有類似有機(jī)手性碳的等離子納米手性四面體結(jié)構(gòu)以來，等離子手性光學(xué)活性已經(jīng)成功吸引了大量科學(xué)界和工業(yè)界的關(guān)注。生物分子的圓二色光譜學(xué)信號(hào)主要是位于紫外區(qū)域，天然的生物分子的圓二色光譜信號(hào)位于可見光區(qū)域。而等離子手性圓二色光譜學(xué)信號(hào)不同于生物分子的圓二色光譜學(xué)信號(hào)，其不僅僅在傳統(tǒng)的生物分子往往處于的紫外區(qū)域具有較強(qiáng)的光譜學(xué)信號(hào)，其還在可見光/近紅外區(qū)域產(chǎn)生了極強(qiáng)的圓二色光譜學(xué)信號(hào)，并且更為重要的是，等離子手性信號(hào)的靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前檢測(cè)分析中最靈敏的放射性傳感信號(hào)。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，該等離子手性無機(jī)納米組裝體在可見光/近紅外區(qū)域的信號(hào)的強(qiáng)度和信號(hào)的光譜學(xué)位置與納米級(jí)組裝基元的元素、尺寸、構(gòu)型和其相應(yīng)的產(chǎn)率息息相關(guān)，充分說明了等離子手性光譜學(xué)信號(hào)可成功應(yīng)用于生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域。利用核酸進(jìn)行組裝形成刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體產(chǎn)生可見光/近紅外區(qū)域的圓二色光譜信號(hào)進(jìn)而用于生物毒素及其代謝物對(duì)dna損傷的檢測(cè)尚屬空白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備方法，構(gòu)建了利用等離子圓二色光譜信號(hào)檢測(cè)dna損傷的新技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案，一種制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna損傷的檢測(cè)方法。本發(fā)明的主要實(shí)施步驟為：（1）金納米棒的合成；（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成；（3）刺狀鉑包裹的金納米棒結(jié)構(gòu)表面定向核酸功能化；（4）構(gòu)建刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體；（5）生物毒素對(duì)dna的預(yù)損傷；（6）刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體對(duì)dna損傷的檢測(cè)。具體步驟為：（1）金納米棒的合成按照專利《一種具有表面增強(qiáng)拉曼活性的自組裝材料的制備方法》（專利號(hào)：zl201010605799.9）的方法合成長(zhǎng)徑比約為3.0的金納米棒。簡(jiǎn)單的步驟如下：①晶種合成：28.0℃下取0.1ml的預(yù)先配置的2g/l的三水合四氯金酸加入到1ml的0.2m的十六烷基三甲基溴化銨溶液中，此時(shí)，溶液顏色由無色變成黃褐色。然后向上述混合體系中加入0.12ml的新配制的0.01m硼氫化鈉溶液快速攪拌2分鐘。溶液顏色即由黃褐色變?yōu)闇\棕色。將上述合成的晶種放入28.0℃的水浴鍋中靜置反應(yīng)30分鐘，使未完全參與晶種合成的硼氫化鈉消耗殆盡，（一是硼氫化鈉進(jìn)一步還原體系中未完全反應(yīng)的金離子而被消耗，二是在靜置反應(yīng)過程中硼氫化鈉由于水解導(dǎo)致其含量進(jìn)一步降低），制備的晶種要在合成后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步反應(yīng)。②金納米棒生長(zhǎng)過程：晶種合成完成以后，進(jìn)行金納米棒的生長(zhǎng)。5ml的2g/l的三水合四氯金酸加入到5ml0.2m的十六烷基三甲基溴化銨中后加入4ml的超純水，混勻。0.125ml的0.01m硝酸銀溶液加入到上述混合體系中，混勻，隨后將65μl的0.1m抗壞血酸溶液加入上述體系溶液，28.0℃下劇烈攪拌反應(yīng)2分鐘，溶液由褐色變成無色。最后，加入0.05ml的晶種溶液輕柔攪拌混勻20秒。28.0℃反應(yīng)2小時(shí)后溶液的顏色為土褐色。合成的金納米棒溶液經(jīng)過10000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，棄上清，采用0.005m的十六烷基三甲基溴化銨溶液將沉淀進(jìn)行重分散，清洗一次，最終將金納米棒溶液分散在與初始等體積的溶液中，室溫靜置保存，以便進(jìn)行下一步的表征及實(shí)驗(yàn)需求。（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成方法向5ml的金納米棒溶液中，加入50μm的碘化鈉，后加入10ml的0.05m的十六烷基三甲基溴化銨后，混勻，隨后加入500μl的0.2mm的硝酸銀溶液，混勻，再加入500μl的0.1m的抗壞血酸溶液，混勻，70℃孵育1h后，加入480μl的0.1m的鹽酸和440μl2mm的氯鉑酸，在70℃孵育反應(yīng)4h后，6500rpm離心10min，棄上清，采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散，待用；（3）刺狀型鉑包覆金納米棒表面定向核酸功能化①刺狀型鉑包覆金納米棒對(duì)其進(jìn)行端面封閉：取上述制備好的10nm的刺狀型鉑包覆金納米棒2ml，加入30μl的1mm的二硫蘇糖醇溶液，混勻，振搖反應(yīng)4h，采用6000rpm離心5min，棄上清，用2ml的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散金納米棒-二硫蘇糖醇的復(fù)合物，4℃保藏、備用；②刺狀型鉑包覆金納米棒側(cè)面定向修飾dna2：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復(fù)合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna2，混勻，25℃、振搖反應(yīng)8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna2的復(fù)合物，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用；③刺狀型鉑包覆金納米棒側(cè)面定向修飾dna3：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復(fù)合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna3，混勻，25℃、振搖反應(yīng)8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液對(duì)刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna3的復(fù)合物進(jìn)行分散，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用；（4）核酸功能化的刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備取50μl上述制備的dna2和dna3側(cè)面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進(jìn)行混合、漩渦混勻，加入0.5μl的10μmdna1、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應(yīng)，使得dna2和dna3分別修飾的刺狀鉑包裹的金納米棒形成側(cè)面組裝二聚體；表一dna損傷檢測(cè)所用的堿基序列編號(hào)序列(5’-3’)長(zhǎng)度dna1accggaggcccatcctcacc20dna2sh-ggcctccggt10dna3ggtgaggatg-sh10（5）生物毒素對(duì)dna的預(yù)損傷10μm的dna1和10、5、1、0.1、0.01μmol/l的黃曲霉毒素b1進(jìn)行混合，室溫反應(yīng)2.5h，將預(yù)損傷的dna1放置在4℃冰箱，備用；同時(shí)，對(duì)于黃曲霉毒素b1的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2按照黃曲霉毒素b1的步驟及相同的濃度，和dna1進(jìn)行孵育2.5h，將預(yù)損傷后的dna1放置在4℃冰箱，備用；（6）刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體對(duì)dna損傷的檢測(cè)采用圓二色光譜學(xué)信號(hào)對(duì)黃曲霉毒素b1及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素m1和黃曲霉毒素m2進(jìn)行檢測(cè)，繪制摩爾橢圓度～黃曲霉毒素b1、m1及m2的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：取50μl上述制備的dna2和dna3側(cè)面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進(jìn)行混合、漩渦混勻，加入經(jīng)過步驟5處理過的預(yù)損傷的dna1（0.5μl），漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應(yīng)，使得dna2及dna3分別修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒形成側(cè)面組裝結(jié)構(gòu)；由于加入的黃曲霉毒素b1或者其代謝產(chǎn)物m1及m2的濃度的不同，黃曲霉毒素和相應(yīng)的dna1中的鳥嘌呤形成黃曲霉毒素-鳥嘌呤的加合物，進(jìn)而使得dna2及dna3無法與dna1進(jìn)行特異性的核酸識(shí)別雜交，導(dǎo)致刺狀鉑包裹的金納米棒形成的二聚體的產(chǎn)率不同進(jìn)而引起等離子圓二色光譜學(xué)信號(hào)產(chǎn)生差異，利用圓二色光譜儀測(cè)定不同黃曲霉毒素濃度下的組裝產(chǎn)物的摩爾橢圓度，根據(jù)855nm波長(zhǎng)下測(cè)定的不同黃曲霉毒素濃度的摩爾橢圓度，繪制黃曲霉毒素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明的有益效果：我們通過研究發(fā)現(xiàn)，該等離子手性無機(jī)納米組裝體在可見光/近紅外區(qū)域的信號(hào)的強(qiáng)度和信號(hào)的光譜學(xué)位置與納米級(jí)組裝基元的元素、尺寸、構(gòu)型和其相應(yīng)的產(chǎn)率息息相關(guān)，充分說明了等離子手性光譜學(xué)信號(hào)可成功應(yīng)用于生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域。利用核酸進(jìn)行組裝形成刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體產(chǎn)生可見光/近紅外區(qū)域的圓二色光譜信號(hào)進(jìn)而用于生物毒素及其代謝物對(duì)dna損傷的檢測(cè)尚屬空白。附圖說明圖1合成的金納米棒的電鏡照片。圖2合成的金納米棒的紫外/可見光譜圖。圖3刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體的電鏡照片。圖4刺狀鉑包裹的金納米棒二聚體的圓二色光譜圖。圖5黃曲霉毒素b1的等離子圓二色光譜檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1制備刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體用于dna的損傷檢測(cè)（1）金納米棒的合成按照專利《一種具有表面增強(qiáng)拉曼活性的自組裝材料的制備方法》（專利號(hào)：zl201010605799.9）的方法合成長(zhǎng)徑比約為3.0的金納米棒。簡(jiǎn)單的步驟如下：①晶種合成：28.0℃下取0.1ml的預(yù)先配置的2g/l的三水合四氯金酸加入到1ml的0.2m的十六烷基三甲基溴化銨溶液中，此時(shí)，溶液顏色由無色變成黃褐色。然后向上述混合體系中加入0.12ml的新配制的0.01m硼氫化鈉溶液快速攪拌2min。溶液顏色即由黃褐色變?yōu)闇\棕色。將上述合成的晶種放入28.0℃的水浴鍋中靜置反應(yīng)30min，使未完全參與晶種合成的硼氫化鈉消耗殆盡，（一是硼氫化鈉進(jìn)一步還原體系中未完全反應(yīng)的金離子而被消耗，二是在靜置反應(yīng)過程中硼氫化鈉由于水解導(dǎo)致其含量進(jìn)一步降低），制備的晶種要在合成后4h內(nèi)進(jìn)行下一步反應(yīng)。②金納米棒生長(zhǎng)過程：晶種合成完成以后，進(jìn)行金納米棒的生長(zhǎng)。5ml的2g/l的三水合四氯金酸加入到5ml0.2m的十六烷基三甲基溴化銨中后加入4ml的超純水，混勻。0.125ml的0.01m硝酸銀溶液加入到上述混合體系中，混勻，隨后將65μl的0.1m抗壞血酸溶液加入上述體系溶液，28.0℃下劇烈攪拌反應(yīng)2min，溶液由褐色變成無色。最后，加入0.05ml的晶種溶液輕柔攪拌混勻20s。28.0℃反應(yīng)2h后溶液的顏色為土褐色。合成的金納米棒溶液經(jīng)過10000rpm離心10min，棄上清，采用0.005m的十六烷基三甲基溴化銨溶液將沉淀進(jìn)行重分散，清洗一次，最終將金納米棒溶液分散在與初始等體積的溶液中，室溫靜置保存，以便進(jìn)行下一步的表征及實(shí)驗(yàn)需求。（2）刺狀型鉑包覆金納米棒的合成方法向5ml的金納米棒溶液中，加入50μm的碘化鈉，后加入10ml的0.05m的十六烷基三甲基溴化銨后，混勻，隨后加入500μl的0.2mm的硝酸銀溶液，混勻，再加入500μl的0.1m的抗壞血酸溶液，混勻，70℃孵育1h后，加入480μl的0.1m的鹽酸和440μl2mm的氯鉑酸，在70℃孵育反應(yīng)4h后，6500rpm離心10min，棄上清，采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散，待用。（3）刺狀型鉑包覆金納米棒表面定向核酸功能化①刺狀型鉑包覆金納米棒對(duì)其進(jìn)行端面封閉：取上述制備好的10nm的刺狀型鉑包覆金納米棒2ml，加入30μl的1mm的二硫蘇糖醇溶液，混勻，振搖反應(yīng)4小時(shí)，采用6000rpm離心5min，棄上清，用2ml的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散金納米棒-二硫蘇糖醇的復(fù)合物，4℃保藏、備用。②刺狀型鉑包覆金納米棒側(cè)面定向修飾dna2：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇的復(fù)合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna2，混勻，25℃、振搖反應(yīng)8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液分散刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna2的復(fù)合物，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用。③刺狀型鉑包覆金納米棒側(cè)面定向修飾dna3：取上述處理過的刺狀型鉑包覆金納米棒和二硫蘇糖醇的復(fù)合物的溶液300μl加入3μl的10μm的巰基修飾的dna3，混勻，25℃。振搖反應(yīng)8h，6000rpm離心5min，去上清，用300μl的5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液對(duì)刺狀型鉑包覆金納米棒-二硫蘇糖醇-dna3的復(fù)合物進(jìn)行分散，并且采用5mm的十六烷基三甲基溴化銨溶液清洗一次，4℃保藏、備用。（4）核酸功能化的刺狀鉑包裹的金納米棒手性二聚體的制備取50μl上述制備的dna2和dna3側(cè)面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進(jìn)行混合、漩渦混勻，加入0.5μl的10μmdna1、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應(yīng)，使得dna2和dna3分別修飾的刺狀鉑包裹的金納米棒形成側(cè)面組裝二聚體。表一dna損傷檢測(cè)所用的堿基序列編號(hào)序列(5’-3’)長(zhǎng)度dna1accggaggcccatcctcacc20dna2sh-ggcctccggt10dna3ggtgaggatg-sh10（5）生物毒素對(duì)dna的預(yù)損傷10μm的dna1和10、5、1、0.1、0.01μmol/l的黃曲霉毒素b1進(jìn)行混合，室溫反應(yīng)2.5h，將預(yù)損傷的dna放置在4℃冰箱，備用。同時(shí)，對(duì)于黃曲霉毒素b1的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2按照黃曲霉毒素b1的步驟及相同的濃度，和dna1進(jìn)行孵育2.5h，將預(yù)損傷后的dna放置在4℃冰箱，備用。（6）鉑包裹的刺狀金納米棒手性二聚體對(duì)dna損傷的檢測(cè)；采用圓二色光譜學(xué)信號(hào)對(duì)黃曲霉毒素b1及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素m1及黃曲霉毒素m2進(jìn)行檢測(cè)，繪制摩爾橢圓度～黃曲霉毒素b1、m1及m2的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：取50μl上述制備的dna2及dna3側(cè)面定向修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒進(jìn)行混合、漩渦混勻，加入經(jīng)過步驟5處理過的預(yù)損傷的dna1（0.5μl）、漩渦混勻，室溫孵育8h后，借助核酸特異性雜交反應(yīng)，使得dna2及dna3分別修飾的鉑包裹的刺狀金納米棒形成側(cè)面組裝結(jié)構(gòu)。由于加入的黃曲霉毒素b1或者其代謝產(chǎn)物m1及m2的濃度的不同，黃曲霉毒素和相應(yīng)的dna1中的鳥嘌呤形成黃曲霉毒素-鳥嘌呤的加合物，進(jìn)而使得dna2及dna3無法與dna1進(jìn)行特異性的核酸識(shí)別雜交，導(dǎo)致鉑包裹的刺狀金納米棒形成的二聚體的產(chǎn)率不同進(jìn)而引起等離子圓二色光譜學(xué)信號(hào)產(chǎn)生差異。利用圓二色光譜儀測(cè)定不同黃曲霉毒素濃度下的組裝產(chǎn)物的摩爾橢圓度，根據(jù)855nm波長(zhǎng)下測(cè)定的不同黃曲霉毒素濃度的摩爾橢圓度，繪制黃曲霉毒素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)前第1頁12