本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)引起的一種急性傳染病，臨床主要特征為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困難等，在發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)兩耳皮膚發(fā)紺發(fā)紫，故又稱為“藍(lán)耳病”。本病于1996年在我國首次報(bào)道。

2006年我國南方部分省份出現(xiàn)養(yǎng)豬場暴發(fā)豬“高熱病”疫情，發(fā)病豬以“高熱”、“高發(fā)病率”和“高死亡率”為主要特征，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心田克恭等研究發(fā)現(xiàn)，豬“高熱病”的主要致病病原為nsp2缺失30個(gè)氨基酸的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異引起，后將其命名為“高致病性豬藍(lán)耳病”(highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome，hp-prrs)，其致病性大大增加，仔豬發(fā)病率可達(dá)100％、死亡率可達(dá)50％以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30％以上，育肥豬也可發(fā)病死亡。依據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)基因序列的不同可以將其分為歐洲型和美洲型兩種基因型，而依據(jù)其致病力的不同，又可將其中的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒分為經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒和高致病性豬藍(lán)耳病病毒兩種亞型，高致病性豬藍(lán)耳病病毒包括高致病性豬藍(lán)耳病病毒江西株(jxa1-r株)、高致病性豬藍(lán)耳病病毒湖南株(hun4-f112株)、高致病性豬藍(lán)耳病病毒天津株(tj株)。目前我國使用的高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗有江西株(jxa1-r株)和湖南株(hun4-f112株)、天津株(tj株)。疫苗的使用需要配備適合的檢測試劑盒才能進(jìn)行免疫效果評估。本研究關(guān)于豬藍(lán)耳病nsp2片段部分蛋白的制備，可運(yùn)用于豬藍(lán)耳病間接elisa抗體的檢測；建立了間接elisa的方法來檢測豬藍(lán)耳病毒抗體，為豬藍(lán)耳病免疫監(jiān)測提供了技術(shù)平臺(tái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便、特異性好的能夠區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法，為藍(lán)耳病免疫監(jiān)測和流行病學(xué)研究提供技術(shù)平臺(tái)，對prrs的防控有著重要的意義。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

1、引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明根據(jù)genbank已發(fā)表的prrsvnsp2基因序列，設(shè)計(jì)一對克隆引物(n1、n2)，見表1，擴(kuò)增包含prrsv-nsp2-n1n2基因的序列，大小為332bp，見表1，并插入salⅰ和bamhⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。

表1擴(kuò)增prrsv-nsp2-n1n2基因的引物核苷酸序列

表1中，下劃線部分為salⅰ和bamhⅰ雙酶切的酶切位點(diǎn)

2、目的基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過特異性引物擴(kuò)增克隆prrsvnsp2基因部分片段(n1n2)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet-32a-n1n2，見圖4。

3、目的蛋白的表達(dá)和純化

通過轉(zhuǎn)入重組菌e.colibl21(de3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過使用最佳的誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間和誘導(dǎo)劑的濃度，獲得重組融合蛋白pet-32a-n1n2，為可溶性蛋白，見圖9。經(jīng)his柱層析方法對表達(dá)的重組整合蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)sds-page電泳分析蛋白純度，見圖10。

4、重組蛋白的免疫反應(yīng)活性分析：western-blotting試驗(yàn)

經(jīng)western-blotting檢測重組蛋白能與6×his-tagantibodymousemonoclonal抗體特異性結(jié)合，見圖11。

5、區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法的建立

利用純化的pet-32a-n1n2蛋白，建立間接elisa檢測方法，確定pet-32a-n1n2蛋白抗原的包被濃度為0.075μg/孔，包被條件為4℃過夜；血清的稀釋度和反應(yīng)時(shí)間分別為1:200和37℃60min；封閉液(1％bsa)封閉時(shí)間為37℃60min；羊抗豬igg-hrp使用濃度1:5000和反應(yīng)時(shí)間為37℃60min；底物25℃避光反應(yīng)20min。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用rt-pcr和蛋白原核表達(dá)技術(shù)獲得純度較高且具有良好特異性和免疫原性的融合蛋白pet-32a-n1n2，以融合蛋白pet-32a-n1n2為包被抗原，建立檢測藍(lán)耳病血清抗體的間接elisa方法；

2、該方法適用于大規(guī)模檢測藍(lán)耳病血清抗體，為區(qū)分prrsv野毒株與天津株疫苗株的抗體檢測提供了一種特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、快速便捷的方法，為豬藍(lán)耳病免疫抗體水平檢測、疫情監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)平臺(tái)。

附圖說明

圖1為n1n2基因rt-pcr擴(kuò)增結(jié)果圖

圖中：m：dnamarkerdl2000，1：prrsvnsp2的n1n2基因pcr產(chǎn)物。

圖2為質(zhì)粒pmd18-t-n1n2的pcr擴(kuò)增結(jié)果圖

圖中：m：dnamarkerdl2000；1：質(zhì)粒pmd18-n1n2的pcr產(chǎn)物。

圖3為質(zhì)粒pmd18-t-n1n2的酶切結(jié)果圖

圖中：m：dnamarkerdl2000；1：質(zhì)粒pmd18-n1n2的酶切產(chǎn)物。

圖4為重組質(zhì)粒pet-32a-n1n2鑒定結(jié)果圖

圖中：m：dnamarkerdl2000，1：pet-32a-n1n2質(zhì)粒pcr產(chǎn)物。

圖5為重組質(zhì)粒測序結(jié)果圖。

圖6為重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析圖

圖中：m：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1：誘導(dǎo)pet-32a-n1n2/bl21；2：未誘導(dǎo)pet-32a-n1n2/bl21；3：誘導(dǎo)pet-32a/bl21空載體。

圖7為重組菌pet-32a-n1n2/bl21誘導(dǎo)1-8h表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析圖

圖中：m：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；1-8：1-8hpet-32a-n1n2/bl21表達(dá)產(chǎn)物。

圖8為重組菌pet-32a-n1n2/bl21不同iptg濃度誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析圖

圖中：m：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1-6：分別為0.2mm、0.4mm、0.8mm、1.2mm、1.6mm、2.0mm的iptg濃度誘導(dǎo)pet-32a-n1n2/bl21表達(dá)。

圖9為pet-32a-n1n2重組蛋白可溶性分析圖

圖中：m：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；1：pet-32a-n1n2超聲裂解上清；2：pet-32a-n1n2超聲裂解沉淀。

圖10為純化pet-32a-n1n2重組蛋白sds-page分析圖

圖中：m：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；1-6：純化pet-32a-n1n2重組蛋白。

圖11為pet-32a-n1n2重組蛋白的westernblot檢測圖

圖中：m：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-6：pet-32a-n1n2重組蛋白。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍和應(yīng)用范圍：

一、區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法的建立

本發(fā)明根據(jù)genbank已發(fā)表的prrsvnsp2基因序列，設(shè)計(jì)一對克隆引物(n1、n2)，擴(kuò)增包含prrsv-nsp2-n1n2基因的序列，大小為332bp，并插入salⅰ和bamhⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。對目的片段和原核表達(dá)載體pet-32a同時(shí)雙酶切，連接后得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet-32a-n1n2。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞e.colibl21(de3)中，獲得陽性重組大腸桿菌bl21(de3)，將陽性重組大腸桿菌bl21(de3)接種于amp/lb培養(yǎng)基中進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)，iptg濃度為1mm條件下，誘導(dǎo)4小時(shí)后，收集樣品。經(jīng)sds-page電泳和westernblot檢測，證實(shí)了所表達(dá)的重組蛋白大小相符具有免疫反應(yīng)活性，且無交叉反應(yīng)。通過對其特異性、敏感性及工作條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法。

實(shí)施例1

引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank已發(fā)表的prrsvnsp2基因序列，設(shè)計(jì)一對克隆引物(n1、n2)擴(kuò)增包含prrsv-nsp2-n1n2基因的序列，大小為332bp，見圖1，并插入salⅰ和bamhⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。引物序列送大連寶生物工程公司合成。

表1擴(kuò)增prrsv-nsp2-n1n2基因的引物核苷酸序列

表1中，下劃線部分為salⅰ和bamhⅰ雙酶切的酶切位點(diǎn)

實(shí)施例2

prrsv-nsp2-n1n2基因克隆

2.1prrsv病毒rna的抽提

按照總rna抽提試劑盒說明書(北京天根公司)步驟進(jìn)行操作，提取prrsv病毒抗原的rna。步驟如下：①取200μlprrsv病毒抗原，加入300μl裂解液rl和10μl蛋白酶k，振蕩混勻放56℃水浴鍋處理15分鐘；②加入250μl無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中(吸附柱套在收集管中)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；③棄掉收集管中的廢液，向吸附柱中加入350μl的去蛋白液rw1，再12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；④棄掉收集管中的廢液，向吸附柱中加入配制好的dnaseⅰ工作液80μl，靜置15分鐘，加入350μl的去蛋白液，再12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；⑤棄掉收集管中廢液，向吸附柱中加入500μl的漂洗液rw，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；⑥棄掉收集管中的廢液，再向吸附柱中加入500μl的漂洗液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；⑦棄掉收集管中的廢液，再12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，把吸附柱取出置于新的rnase-free離心管中，打開蓋子晾干；⑧向吸附柱中加入35μlddh2o，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管中為rna溶液。

2.2病毒rnart-pcr反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄(rt)體系：

補(bǔ)ddh2o至25μl，進(jìn)行rt程序：42℃60min、95℃5min，取出用于pcr或者-20℃保存。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)體系：

加ddh2o至25μl，進(jìn)行pcr程序：94℃5min；94℃45s、56℃45s、72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min,4℃保存。產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳。

2.3pcr產(chǎn)物純化回收

pcr產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠dna純化試劑盒說明書(takara公司)步驟進(jìn)行操作。步驟如下：①pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1.0％-1.5％凝膠)，在紫外燈下切下目的基因片段，放離心管中；②根據(jù)膠塊的重量，加入4個(gè)凝膠體積量的buffergm膠塊溶解液，放置42℃水浴鍋中，期間振蕩混勻，使膠塊充分融化；③轉(zhuǎn)入spincolumn中(spincolumn先置于collectiontube中)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，將濾液再加入spincolumn中離心一次；④棄去濾液，向spincolumn中加入700μl的bufferwb，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；⑤棄去濾液，向spincolumn中加入700μl的bufferwb，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；⑥棄去濾液，將spincolumn放到新的離心管中，靜置2分鐘晾干，向spincolumn膜中央加入35ul去離子水，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管中為純化的dna。

2.4克隆載體pmd18-t-n1n2的構(gòu)建

克隆載體構(gòu)建體系：

pmd18-t載體(50ng/μl)1l

solutionⅰ5μl

pcr純化回收產(chǎn)物4μl

共10μl體系，4℃連接過夜，得到重組dna進(jìn)行下一步的

轉(zhuǎn)化。

2.5重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

具體步驟：①-80℃冰箱里取出e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞(100μl/管)，置于冰盒上待溶化；②將連接得到的重組dna加入50ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕混勻，冰浴30min。③將感受態(tài)細(xì)胞放入42℃的水浴鍋中，作用90s。④從水浴鍋中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴3min，加入預(yù)熱的soc培養(yǎng)基500μl，37℃，200r/min，培養(yǎng)45min-1h。⑤輕混勻感受態(tài)細(xì)胞，取100μl涂布于amp/lb培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)16h。

2.6重組質(zhì)粒提取

將白色菌落接種于5mlamp/lb液體培養(yǎng)基中，37℃，2000r/min，培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒小提中量試劑盒(tianpuremidiplasmidkit)步驟提取質(zhì)粒：①向收集管里的吸附柱中加入500μl平衡液bl，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，倒掉廢液；②把菌液倒入離心管中約2ml離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄掉上清；③向離心管中加入250μl溶液p1，使用移液槍懸浮細(xì)菌沉淀；④向離心管中加入250μl溶液p2，輕柔上下翻轉(zhuǎn)6-8次使細(xì)菌充分裂解；⑤向離心管中加入350μl溶液p3，立即輕柔上下翻轉(zhuǎn)6-8次，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘；⑥將上清轉(zhuǎn)入吸附柱中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄掉廢液；⑦向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄掉廢液，重復(fù)漂洗一次；⑧將吸附柱放回收集管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘；⑨將吸附柱放到一個(gè)滅菌的離心管中，向吸附柱膜中央加入50μl洗脫緩沖液eb，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，得到質(zhì)粒dna溶液。

2.7重組質(zhì)粒鑒定

pcr鑒定：cdna模板變?yōu)橹亟M質(zhì)粒1μl，2×taqbuffer12.5ul，上下游引物各0.5ul，加ddh2o至25μl，進(jìn)行pcr反應(yīng)，得到的產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，見圖2。

雙酶切鑒定：按照10μl的雙酶切反應(yīng)體系(10×k緩沖液1μl，質(zhì)粒dna5μl，內(nèi)切酶salⅰ、bamhⅰ各0.5μl，ddh2o3μl)，4℃過夜，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，見圖3。

測序鑒定：將經(jīng)過pcr和雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒，送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定，見圖4。

實(shí)施例3

n1n2基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

3.1pmd18-t-n1n2質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒的雙酶切

酶切體系(50μl)：10×buffer5μl，模板(pcr純化產(chǎn)物/表達(dá)載體質(zhì)粒)25μl，salⅰ和bamhⅰ內(nèi)切酶分別2.5μl，ddh2o15μl。4℃過夜。取酶切產(chǎn)物5μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，按照pcr產(chǎn)物純化回收步驟對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

3.2目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建

連體體系(10μl)：10×t4連接酶緩沖液1μl，t4連接酶1μl，目的基因酶切回收產(chǎn)物5μl，表達(dá)載體pet-32a酶切回收產(chǎn)物3μl。4℃連接過夜，再按照2.2.1.2中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟將連接物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞e.colibl21(de3)中，涂布amp/lb培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。

3.3重組質(zhì)粒pet-32a-n1n2提取

按照2.6中重組質(zhì)粒提取步驟進(jìn)行，得到重組表達(dá)質(zhì)粒dna溶液。

3.4重組質(zhì)粒pet-32a-n1n2鑒定

對重組質(zhì)粒pet-32a-n1n2雙酶切鑒定，選用內(nèi)切酶salⅰ、bamhⅰ，其余步驟相同，見圖4。

實(shí)施例4

重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

4.1重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

取陽性重組質(zhì)粒pet-32a-n1n2的菌液進(jìn)行復(fù)蘇，取10μl菌液加入到5mlamp/lb培養(yǎng)基中，37℃200r/min，培養(yǎng)過夜。分別取復(fù)蘇菌液500μl加入到兩管10mlamp/lb培養(yǎng)液中，37℃200r/min，斜搖培養(yǎng)待菌液od值在0.4-0.6之間，其中一管加入終濃度為1mm的iptg誘導(dǎo)菌液表達(dá)蛋白，另外一管為不加iptg空白對照，繼續(xù)37℃200r/min，直搖培養(yǎng)4h。樣品處理：分別收集誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌液各1ml，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄掉上清；用100μlpbs重懸細(xì)菌沉淀，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄掉上清；重復(fù)3次，棄掉上清液；加入pbs30μl，4×buffer10μl，重懸細(xì)菌沉淀；沸水浴煮7分鐘。得到的樣品進(jìn)行sds-page電泳和westernblot檢測重組菌蛋白表達(dá)情況。

4.2sds-page電泳

具體操作：①配制電泳緩沖液和5×樣品緩沖液；②洗清玻璃，晾干后安裝在制膠器上，用蒸餾水檢查無漏液；③制sds-page凝膠，先配制15％分離膠用移液槍吸入玻璃板間約7ml，加入2ml蒸餾水壓平膠面，待膠凝后倒掉膠面上的水，再加入配制好的5％積層膠約離邊緣0.5cm處，緩慢地插上梳子避免產(chǎn)生氣泡，等待膠凝；④將膠移入電泳槽內(nèi)，倒入電泳緩沖液漫過加樣孔，輕輕拔掉梳子；5)處理好的蛋白樣品30μl，5×buffer10μl混勻后，煮沸7分鐘，取10μl加入加樣孔中，同時(shí)設(shè)預(yù)染蛋白marker作標(biāo)準(zhǔn)對照；⑥接通正負(fù)極電源，先80v約60分鐘，帶染料剛過積層膠后，再使用120v直至染料到達(dá)膠底部約120分鐘；⑦染色，按照考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液(北京索萊寶公司)步驟操作，將膠加入考馬斯亮藍(lán)快速染色液浸沒凝膠，置搖床搖動(dòng)4h，倒掉染色液再加入漂洗液，置搖床搖動(dòng)2h，換上去離子水即可完成，觀察結(jié)果并掃描，見圖6。

4.3westernblot檢測

具體步驟：①剪1張pvdf膜和6張厚濾紙，先將pvdf膜放入盛有甲醇的平皿中，置搖床上搖蕩浸泡3分鐘，再取出pvdf膜連同濾紙一起放入1×半干轉(zhuǎn)膜液中搖蕩浸泡15分鐘；②sds-page膠取出后，切掉上面的積層膠，將膠放入1×半干轉(zhuǎn)膜液中，在半干轉(zhuǎn)移槽上面依次疊放3層厚濾紙、pvdf膜、sds-page膠和3層厚濾紙，并且各層均需要使用玻璃棒滾動(dòng)擠出氣泡；③蓋上蓋子，調(diào)節(jié)電壓20v45分鐘，結(jié)束后取出pvdf膜做好標(biāo)記；④用麗春紅預(yù)染，觀察有無條帶，再用蒸餾水或tbst洗掉；⑤用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜，用tbst洗膜三次，在搖床上搖動(dòng)洗膜，每次5分鐘；⑥用一抗37℃孵育60分鐘，tbst搖動(dòng)洗膜三次，每次5分鐘；⑦使用辣根酶標(biāo)二抗37℃孵育60分鐘，tbst搖動(dòng)洗膜三次，每次5分鐘；⑧使用dab辣根過氧化物酶顯色試劑盒，顯色觀察結(jié)果并掃描，見圖11。

4.4重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化

對重組菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和iptg濃度進(jìn)行了優(yōu)化，按照重組菌誘導(dǎo)表達(dá)步驟進(jìn)行。其中對時(shí)間的優(yōu)化，加入1mmiptg誘導(dǎo)菌液表達(dá)，在8h內(nèi)每隔一小時(shí)收集1ml菌液，樣品處理后進(jìn)行sds-page電泳比較不同時(shí)間的蛋白表達(dá)量，見圖7。由于誘導(dǎo)8h表達(dá)產(chǎn)物的條帶最濃，所以選擇的誘導(dǎo)時(shí)間是8h；對iptg濃度的優(yōu)化，在最佳時(shí)間上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)分別加入終濃度為0.2mm，0.4mm，0.8mm，1.2mm，1.6mm，2.0mm的iptg，樣品處理后進(jìn)行sds-page電泳比較不同iptg濃度下蛋白表達(dá)量，見圖8，由于iptg終濃度為1.2mm時(shí)表達(dá)產(chǎn)物的條帶最濃，所以選擇的iptg濃度是1.2mm。

4.5重組菌表達(dá)形式的確定

在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下，取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液100ml，10000g離心10分鐘，棄掉上清；用pbs洗滌細(xì)菌沉淀，重復(fù)洗滌三次；加入10mlpbs重懸細(xì)菌沉淀，反復(fù)凍融三次后，在冰浴中超聲裂解細(xì)菌，超聲1s，間歇3s振幅30％，超聲25分鐘；10000g離心10分鐘分別收集沉淀和上清，樣品處理后進(jìn)行sds-page電泳分析重組菌表達(dá)蛋白的形式。若表達(dá)的蛋白存在上清中，為可溶性蛋白；存在沉淀中，則為包涵體的形式，見圖9。

實(shí)施例5

重組蛋白pet-32a-n1n2的純化

5.1his·bind柱層析純化

①柱子里加入2ml樹脂，待保存液降至樹脂表面；②依次加入3ml去離子水，5ml1×chargerbuffer，3ml1×bindingbuffer來平衡柱子；③加入處理好的樣品，收集洗脫液，做好標(biāo)記；④依次加入10ml1×bindingbuffer，6ml1×washingbuffer,6ml1×elutionbuffer，并分別收集液體，elutionbuffer洗脫下來的則為純化的pet-32a-n1n2重組蛋白，取樣進(jìn)行sds-page電泳檢測重組蛋白純化情況，見圖10。

5.2純化pet-32a-n1n2重組蛋白的濃縮

將超濾離心管加入超純水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，加入適量將鑒定過的重組蛋白液，當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮，直至獲得需濃度蛋白(200μl-500μl)。離心過程中需注意是否發(fā)生蛋白沉淀而堵塞濾膜。取出濃縮好的蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用200μl槍頭輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。整個(gè)過程冰浴操作，注意不要損壞超濾膜。

實(shí)施例6

純化重組蛋白的鑒定

將純化濃縮的重組蛋白進(jìn)行sds-page電泳，用1:15006×his-tagantibodymousemonoclonal做westernblot試驗(yàn)，對純化的重組蛋白進(jìn)行鑒定，酶標(biāo)二抗使用羊抗豬igg-hrp，見圖11。

實(shí)施例7

區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法的建立

7.1間接elisa檢測方法：

①包被：包被純化的pet-32a-n1n2重組蛋白，0.075μg/孔，4℃過夜；

②洗板：pbst(ph7.4)洗板五次用紙巾拍干；

③封閉：加入封閉液(1％bsa),100μl/孔，37℃封閉60min，同上洗板拍干；

④加樣：加入待檢樣品、陰陽對照及空白對照，50μl/孔，37℃孵育60min，同上洗板拍干；

⑤加二抗：加入羊抗豬igg-hrp，50μl/孔，37℃孵育60min，同上洗板拍干；

⑥顯色：加入tmb底物，50μl/孔，25℃避光20min；

⑦終止：加入硫酸終止液，50μl/孔；

⑧測值：酶標(biāo)儀測定od450值。

7.2間接elisa反應(yīng)條件的優(yōu)化

7.2.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

7.2.1.1最佳抗原包被濃度的確定

酶標(biāo)板包被純化的pet-32a-n1n2重組蛋白，用pbst稀釋至0.15μg/孔、0.1μg/孔、0.075μg/孔、0.025μg/孔，進(jìn)行間接elisa，測定od值，計(jì)算各p/n值，結(jié)果如表2所示。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.075ug/孔時(shí)，樣品的p值接近于1，且p/n值最大(p/n＞2.5)。所以選擇0.075ug/孔為最適抗原包被量。

表2pet-32a-n1n2重組蛋白抗原最佳包被濃度的確定

7.2.1.2血清稀釋度的確定

包被純化的pet-32a-n1n2蛋白0.075μg/孔；豬陽性血清用pbst分別作1:100、1：200、1：300、1：400、1：500倍稀釋，進(jìn)行間接elisa，測定od值，計(jì)算各p/n值，結(jié)果如表3所示。當(dāng)血清稀釋倍數(shù)為1：200時(shí)，樣品的p值接近于1，且p/n值最大(p/n＞2.5)，所以選擇1:200為最佳血清稀釋度。

表3血清最佳稀釋度的確定

7.2.2酶標(biāo)抗體濃度

對酶標(biāo)抗體羊抗豬igg–hrp分別作1：2000、1：5000、1：8000、1：10000倍稀釋，進(jìn)行間接elisa，測定od450值，計(jì)算各p/n值，結(jié)果如表4所示。當(dāng)選酶標(biāo)二抗1:5000倍稀釋時(shí)，陽性od450值接近于1.0。因此，酶標(biāo)抗體最佳工作濃度1:5000。

表4酶標(biāo)抗體最佳工作濃度

7.2.3封閉液選擇

以0.075μg/孔的最佳濃度包被抗原，分別采用1％bsa、1％酪蛋白和5％脫脂奶粉作為封閉液，選擇天津株陽性免疫豬血清和prrs抗體陰性血清各4份進(jìn)行間接elisa，取平均值，測定od450值，計(jì)算各p/n值，結(jié)果如表5所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，1％bsa的封閉效果最好，1％酪蛋白陰性值較高，5％脫脂奶粉p值較低、n值較高，因此選擇1％bsa作為封閉液。

表5最佳封閉液的選擇

7.2.4封閉時(shí)間的確定

37℃分別封閉30min、60min、120min，進(jìn)行間接elisa，結(jié)果如表6所示。結(jié)果顯示：封閉60min時(shí)p/n值最大封閉效果最好，因此封閉時(shí)間確定為60min。

表6封閉時(shí)間的確定

7.2.5待檢血清最適作用時(shí)間

將待檢血清分別作用30min、60min、120min進(jìn)行間接elisa，結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示：待檢血清反應(yīng)60min和120min接近，綜合考慮待檢血清作用時(shí)間確定為60min。

表7待檢血清作用時(shí)間的確定

7.2.6底物顯色時(shí)間

以10min、20min和30min作為間接elisa的底物顯色時(shí)間，見表8。對比發(fā)現(xiàn)20min時(shí)達(dá)到最佳值，隨后緩慢下降，選擇20min為最佳底物顯色時(shí)間。

表8最佳顯色時(shí)間的確定

7.2.7間接elisa陰陽臨界值的確定

挑選50份prrsv陰性血清，運(yùn)用已確定的最適間接elisa條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表9所示。計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差sd值，分別為0.2285和0.0705，臨界值為即0.4401。所以判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣品0d450>0.4401，且p/n>2.5，判定為陽性，否則為陰性。

表9間接elisa陰陽臨界值的確定

7.2.8特異性試驗(yàn)結(jié)果

挑選豬瘟病毒(hcv)，豬偽狂犬病毒(prv)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)tj株、野毒株抗體陽性血清和prrsv抗體陰性血清作為待檢血清間接elisa交叉檢測。檢測結(jié)果如表10所示，表明建立的間接elisa方法特異性強(qiáng)，與豬繁殖與呼吸綜合征jx株抗體陽性沒有交叉反應(yīng)。

表10特異性試驗(yàn)結(jié)果

7.2.9符合性檢驗(yàn)結(jié)果

利用建立的間接elisa方法檢測138份prrsv陽性血清和50份prrsv陰性血清，見表11，計(jì)算其符合率。均為陽性樣品為138，陰性為50，符合率100％。

表11prrsv陰陽性血清符合率檢測的符合率

7.2.10重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

4份不同效價(jià)的血清和2份陰性血清進(jìn)行間接elisa，每份血清進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，選擇同一次純化的蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)、不同次的純化蛋白進(jìn)行批間重復(fù)。結(jié)果見表12、表13，數(shù)據(jù)顯示：板內(nèi)和板間重復(fù)的變異系數(shù)cv值均小于15％，表明建立的單抗間接elisa重復(fù)性較好。

表12批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表13批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

二、應(yīng)用

應(yīng)用建立的elisa方法檢測豬場的豬血清。

1、利用建立的間接elisa方法和idexx試劑盒檢測只用prrsvtj株疫苗免疫的1個(gè)廣西重點(diǎn)種豬場的豬血清96份，由于prrsvtj株疫苗不含n1n2基因，所以兩種方法符合率僅為1.06％，表明與idexx試劑盒檢測比較，pet-32a-n1n2蛋白對本發(fā)明方法有更強(qiáng)的特異性和免疫原性，同時(shí)也表明免疫效果好，且未受到野毒感染，見表14。

表14i-elisa檢測prrsvtj株免疫種豬場

2、利用建立的間接elisa方法和idexx試劑盒檢測只用prrsjx疫苗免疫的1個(gè)廣西重點(diǎn)種豬場的豬血清143份，均陽性為131份，均陰性為0份，兩種方法符合率為91.6％，表明免疫效果好，其中12份可能感染了prrsvtj株野毒，見表15。

表15i-elisa檢測prrsvjx株免疫種豬場

3、利用建立的間接elisa方法和idexx試劑盒檢測只用prrsvtj株疫苗免疫的1個(gè)小型豬場的豬血清30份。其中均陽性23份，均陰性2份，推斷均陽性的23份血清有野毒株感染，均陰性的未免疫成功，剩余的5份血清則是免疫成功且未受到野毒株感染，見表16。

表16i-elisa檢測prrsvtj株免疫小型豬場

4、利用建立的間接elisa方法和idexx試劑盒檢測prrsv沒有疫苗免疫的1個(gè)小型豬場的豬血清30份。兩種方法均陽性為27份，均陰性為0，推測豬場可能受到了兩種類型野毒株的感染，見表17。

表17i-elisa檢測未免疫小型豬場

核苷酸序列表

<110>廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

<120>區(qū)分豬藍(lán)耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗體間接elisa檢測方法

<130>gx-1710044jyc

<160>2

<210>1

<211>29

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

acgcgtcgacaagatcacacgcccaaaat29

<210>2

<211>32

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

cgcggatccttatgcgaggtaacatcacaaac32