本發(fā)明涉及電化學(xué)生物傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

電化學(xué)生物傳感器由于體積小、分析速度快、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)在發(fā)酵工藝、食品工程、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)、軍事及軍事醫(yī)學(xué)等方面已經(jīng)得到高度重視和廣泛應(yīng)用。它通常是基于由生物分子催化產(chǎn)生或消耗的電子的氧化還原反應(yīng)，在發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)在被檢測(cè)物、生物電催化活性分子和電極之間會(huì)發(fā)生電子的傳遞。由法拉第定律可知，氧化還原反應(yīng)的摩爾數(shù)與轉(zhuǎn)移的電量是呈正比的，因此可以通過測(cè)定電子轉(zhuǎn)移時(shí)產(chǎn)生的電流大小來測(cè)定被檢測(cè)物質(zhì)的濃度。由于酶的催化具有選擇性高，催化效率高等特性，可以采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺枰纳锘钚苑肿蛹右孕揎棽⒐潭ǖ诫姌O的表面，就可以用于分子識(shí)別，有選擇性的進(jìn)行測(cè)定。其中分子識(shí)別部分是電化學(xué)生物傳感的核心。

蛋白質(zhì)分子在生物體中大量存在，如大部分酶、部分激素、抗體、部分抗原、細(xì)胞色素C、血紅蛋白和肌紅蛋白、干擾素等?，F(xiàn)有的常用于蛋白質(zhì)分子的固定方法主要有吸附、交聯(lián)、共價(jià)鍵合、包埋等，固定材料有無機(jī)材料、高分子材料等，各種方法都有其適宜的使用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，但有一個(gè)相同點(diǎn)，就是都會(huì)犧牲掉一部分蛋白質(zhì)的活性。以生物電極為敏感元件的電化學(xué)生物傳感器是以電信號(hào)的傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)傳感功能的，其中生物界面膜的構(gòu)筑是制備電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵步驟。因此創(chuàng)新生物界面膜的構(gòu)筑方法以提高電化學(xué)生物傳感器測(cè)量的準(zhǔn)確度、靈敏度、穩(wěn)定性、選擇性等是科研工作者的主要目標(biāo)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、檢測(cè)限低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、選擇滲透性好的方法用以固定多酚氧化酶來制備酚傳感器的生物電極。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：將兩親型嵌段共聚物溶于溶劑中配成兩親型嵌段共聚物溶液，再將兩親型嵌段共聚物溶液滴涂于載有半干蛋白質(zhì)水溶液的電極表面，然后置于恒溫恒濕箱中，待溶劑和水揮發(fā)，得到酚傳感器的生物電極。

所述兩親型嵌段共聚物的分子量為5000～500000；所述兩親型嵌段共聚物中的親水段中含有可以在水溶液中電離或水解并帶有電荷的基團(tuán)；所述兩親型嵌段共聚物中的疏水鏈段為在水溶液中不易降解的疏水性聚合物鏈段；所述溶劑為易揮發(fā)且與水不互溶的有機(jī)溶劑。

由于兩親型嵌段共聚物的分子量必須達(dá)到一定值，否則自組裝的驅(qū)動(dòng)力不夠，因此本發(fā)明采用分子量為5000～500000。由于兩親型嵌段共聚物的親水段中含有可以在水溶液中電離或水解并帶有電荷的基團(tuán)，而蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，其所帶電荷可以通過水溶液的pH值來調(diào)節(jié)，這樣就可以使其與帶有電荷的兩親型嵌段共聚物發(fā)生靜電吸附以誘導(dǎo)生物分子的有序排列，因此其對(duì)蛋白質(zhì)分子的吸附能力可以大大提升。并且在高濕度的環(huán)境下，隨著鑄膜液中的有機(jī)溶劑揮發(fā)，表面溫度急劇下降，高濕度氛圍中的水蒸氣大量冷凝在電極表面。聚合物在親水/疏水的平衡作用下凝結(jié)在水滴表面，隨著揮發(fā)完畢，溫度回升，電極表面就自組裝形成了六角形的花樣。而粗糙表面利于蛋白質(zhì)分子的附著，而大小可控的孔徑也可使得電極的響應(yīng)具有更短的時(shí)間和更高的選擇性。因此用該電荷-親疏水雙驅(qū)動(dòng)自組裝法可構(gòu)筑性能優(yōu)良的生物活性膜和高穩(wěn)定、高靈敏度、高選擇性的電化學(xué)生物傳感器。

采用本發(fā)明方法制備出傳感器檢測(cè)限低、靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇滲透性好，適用性廣、制作簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)分子和載體材料用量少，適宜大規(guī)模批量生產(chǎn)。用同一固定材料可制備不同功能的生物傳感器，適合多種物質(zhì)的檢測(cè)，在醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域運(yùn)用廣泛。

另外，本發(fā)明所述帶有電荷的基團(tuán)為吡啶基。優(yōu)選的兩親型嵌段共聚物為聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶。聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶是一種聚電解質(zhì)型兩親性嵌段共聚物，其中聚苯乙烯鏈段為疏水鏈段，而聚4-乙烯基吡啶為親水鏈段且可以在一定條件下產(chǎn)生電離（pKa=9.2）；而多酚氧化酶的pI=4.7-5；因此在pH=6.0時(shí)PS-b-P4VP的親水鏈段帶正電，多酚氧化酶帶負(fù)電。在電荷親疏水雙驅(qū)動(dòng)自組裝過程中，兩者相互產(chǎn)生靜電作用，從而得到生物分子有序排列的生物界面。

本發(fā)明優(yōu)選的溶劑為氯仿。溶解度參數(shù)是衡量聚合物和溶劑是否能夠很好互溶的一個(gè)重要指標(biāo)，氯仿的揮發(fā)速度較快，且與水不互溶，是在電極上構(gòu)筑多孔膜的理想溶劑。水的溶解度參數(shù)（δ_H2O） = 47.3 J^1/2·cm^-3/2，δ_CHCl3 = 19.0 J^1/2·cm^-3/2。因而氯仿是PS-b-P4VP的良溶劑。

所述兩親型嵌段共聚物溶液中，兩親型嵌段共聚物占溶液質(zhì)量的0.05%。否則無規(guī)線團(tuán)易互相纏結(jié)，構(gòu)象轉(zhuǎn)換勢(shì)壘過大，自組裝難以進(jìn)行。

所述恒溫恒濕箱內(nèi)的溫度為25℃，濕度為80%RH。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在 15～40℃的溫度范圍之間，酶電極的響應(yīng)電流隨溫度升高而增大，在 40℃左右出現(xiàn)最大響應(yīng)電流，隨著溫度的繼續(xù)升高，響應(yīng)電流開始逐漸下降。但實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PPO 從 30～35℃開始就會(huì)很快變性。而且在實(shí)際應(yīng)用中25℃是最方便和最常見的，因此選擇25℃。實(shí)驗(yàn)對(duì)濕度的要求較高，濕度為80%RH時(shí)，在恒溫恒濕箱中干燥快，超過半小時(shí)即可。

所述蛋白質(zhì)的分子為多酚氧化酶。多酚氧化酶是一個(gè)四聚體，包含四個(gè)銅離子，由兩個(gè)芳香族化合物及氧相連。多酚氧化酶是一種可以形成兩種或兩種以上不同形式的均聚物的蛋白，它通常以單體，三聚體，四聚體，八聚體形式存在。多酚在氧的存在下，氧氣會(huì)分兩步催化鄰苯二酚的，先是將苯酚鄰位氧化，然后將鄰位雙酚氧化為鄰醌，在反應(yīng)過程中有電子轉(zhuǎn)移，固定化 PPO 所得到的生物傳感器在恒電位下可以將酚類物質(zhì)的濃度與電流信號(hào)相關(guān)聯(lián)。

附圖說明

圖1為改變多酚氧化酶的用量得到的感應(yīng)電流圖。

圖2為改變鑄膜液的用量得到的感應(yīng)電流圖。

圖3為改變pH得到的感應(yīng)電流圖。

圖4為改變掃描電壓得到的感應(yīng)電流圖。

圖5為溫度對(duì) PS-b-P4VP/PPO 響應(yīng)電流的影響。

圖6為溫度的倒數(shù)與電流密度的對(duì)數(shù)的關(guān)系圖。

圖7為響應(yīng)電流階梯曲線圖。

圖8為圖7的局部放大圖。

圖9為PS-b-P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的濃度校正曲線。

圖10為PS-b-P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的線性范圍圖。

圖11為PS-b-P4VP/PPO電極對(duì)不同酚類物質(zhì)的濃度校正曲線。

圖12為 PS-b-P4VP/PPO 電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性圖。

具體實(shí)施方式

一、制備生物電極：

1、采用聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶（PS-b-P4VP）兩親型聚合物與氯仿配制成濃度為0.05%的溶液。

2、將多酚氧化酶溶解在pH為6.0的1mM的磷酸緩沖溶液中。

3、將多酚氧化酶的溶液均勻的滴涂在鉑碳電極表面，待溶劑蒸發(fā)至快干后，再滴涂?jī)捎H型嵌段共聚物的氯仿溶液。

4、滴涂結(jié)束后，立即將電極置于溫度為25℃，濕度為80%RH的恒溫恒濕箱中。

5、待溶劑和水揮發(fā)，形成干燥表面，即制得生物電極，再將生物電極放在冰箱中冷藏，待用。

本例中，多酚氧化酶(1mg·mL^-1)的用量為6μg、PS-b-P4VP的體積為7μL。

傳感器使用的最佳條件是：測(cè)量溫度25℃、工作電位是-200mV、溶液pH為6.0。

二、制備傳感器：

將以上制成的生物電極制成傳感器，該生物傳感器響應(yīng)快、靈敏度高、線性范圍廣、檢測(cè)限低。其對(duì)兒茶酚的靈敏度314 mA·M^-1·cm^-2，線性檢測(cè)范圍為 0.12 ~ 30 μM，檢出限為 0.07 μM；固定化多酚氧化酶的酶催化反應(yīng)的表觀活化能是18 kJ/mol。該傳感器可以用于多種酚類的檢測(cè)，對(duì)不同酚的檢測(cè)靈敏度順序?yàn)椋罕椒?gt;兒茶酚>對(duì)氯苯酚>對(duì)甲苯酚，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

1、分別取質(zhì)量為3、4、5、6、7、8、9 μg 的 PPO（1 mg·mL^-1），滴于六支標(biāo)記為一到六的玻碳電極上，20min 后滴加 PS-b-P4VP 溶液（0.05 wt%），體積固定為7 μL，然后置于恒溫恒濕箱（25 ^oC and 80 % R.H.）中干燥。用以上六支電極在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作電位為–200 mV，溫度為 25 oC）測(cè)量對(duì) 10 μM 兒茶酚的響應(yīng)電流。取得如圖1所示的多酚氧化酶的用量與感應(yīng)電流的關(guān)系圖。

由圖1可見：當(dāng) PPO 的質(zhì)量從 3 變化到 6 時(shí)，酶電極的響應(yīng)電流明顯增大，而當(dāng)PPO 質(zhì)量從 6 變化到 9 時(shí)，酶電極的響應(yīng)電流減小。因此，多酚氧化酶適宜的用量為6μg。

2、分別取體積為4、5、6、7、8、9、10 μL的PS-b-P4VP氯仿溶液（0.05 wt %），滴加于 6 μg 的 PPO 上，置于恒溫恒濕箱中干燥。在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作電位為–200 mV，溫度為 25 oC）測(cè)量對(duì) 10 μM 兒茶酚的響應(yīng)電流。取得如圖2為所示的鑄膜液的用量與感應(yīng)電流的關(guān)系圖。

由圖2可見：當(dāng) PS-b-P4VP 的體積從 4 變化到 7 時(shí)，酶電極的響應(yīng)電流增大，而當(dāng) PS-b-P4VP 體積從 7 變化到 10 時(shí)，酶電極的靈敏度和響應(yīng)電流明顯減小。這可能是由于 PS-b-P4VP/PPO 復(fù)合膜的厚度較薄時(shí)，底物和產(chǎn)物之間可迅速進(jìn)行跨膜傳輸，PS-b-P4VP增加時(shí)對(duì) PPO 的作用增加，使得 PPO 排列更加規(guī)整。當(dāng)形成的 PS-b-P4VP/PPO 復(fù)合膜過厚時(shí)，增加了分子的擴(kuò)散阻礙，從而導(dǎo)致響應(yīng)電流的下降。因此選擇滴加在電極上的 PS-b -P4VP（0.05 wt %）的量為 7 μL。

3、將工作電位控制在–200 mV，溫度控制在 25 oC，在含 10 μM兒茶酚的 0.1 M不同 pH 值的PB 溶液中，測(cè)試酶電極的響應(yīng)電流與溶液 pH 值的關(guān)系。取得如圖3所示的pH與感應(yīng)電流的關(guān)系圖。

由圖3可見：在 pH 為 5.0 至 6.0 范圍內(nèi)，酶電極響應(yīng)電流隨著溶液pH值的增加而增大，在 pH = 6.0 處左右響應(yīng)電流出現(xiàn)最大值，隨著被測(cè)溶液 pH 值繼續(xù)增大，電極的響應(yīng)電流開始下降。因此，適宜的pH為6.0。

4、將溫度控制在25 oC，pH 控制在 6.0，當(dāng)電位從 -300 mV 至 -100 mV變化時(shí)，測(cè)試酶電極響應(yīng)電流與掃描電壓的關(guān)系。取得圖4所示的掃描電壓與感應(yīng)電流的關(guān)系圖。

由圖4可見：當(dāng)電位從 -300 mV 至 -100 mV變化時(shí)，酶電極的響應(yīng)電流緩慢上升，在–200 mV 時(shí)響應(yīng)電流出現(xiàn)最大值，當(dāng)工作電位進(jìn)一步加大時(shí)，酶電極響應(yīng)電流開始出現(xiàn)急速下降。因此適宜的工作電位為-200mV。

5、將電位控制在-200 mV，pH 控制在 6.0，改變溫度，測(cè)試酶電極響應(yīng)電流與溫度的關(guān)系。取得圖5的溫度對(duì) PS- b-P4VP/PPO 響應(yīng)電流的關(guān)系圖。

由圖5可見：在 15 oC 至 40 oC 的溫度范圍之間，酶電極的響應(yīng)電流隨溫度升高而增大，在 40 oC 左右出現(xiàn)最大響應(yīng)電流，隨著溫度的繼續(xù)升高，響應(yīng)電流開始逐漸下降。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) PPO 從 30?35 °C 開始就會(huì)很快變性。而且在實(shí)際應(yīng)用中 25 °C 是最方便和最常見的，因此選用25 °C作為實(shí)驗(yàn)溫度。

6、將圖5中的溫度轉(zhuǎn)化為開爾文溫度，并取倒數(shù)；將圖5得到的電流密度取對(duì)數(shù)，作圖。取得圖6的溫度的倒數(shù)與電流密度的對(duì)數(shù)的關(guān)系圖。

由圖6可見：根據(jù)阿倫尼烏斯方程lnk= -E_a/RT + lnA ，其中k 是反應(yīng)速率常數(shù)，E_a是反應(yīng)活化能，R 是氣體常數(shù)，T 是開爾文溫度，A 是阿倫尼烏斯常數(shù)。由于反應(yīng)的量等效于電子轉(zhuǎn)移的數(shù)量，因此k 與響應(yīng)電流成正比。可用 lnj 代替lnk ，這樣 lnj ~ T^-1的斜率就是 -E_a/ R，截距就是 lnA 。可知斜率為 -E_a/R = -2.19×10³ K 計(jì)算得出E_a = 18 kJ·mol^-1。

7、在pH值為6.0的磷酸緩沖溶液中在一個(gè)恒定的電位（–200 mV vs. SCE）下測(cè)試了 PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的催化能力。在快速攪拌下，每隔 100 s，往 10 mL的 PB 溶液中滴加一定量的兒茶酚，得到階梯曲線。取得圖7的響應(yīng)電流階梯曲線圖。

由圖7可見：兒茶酚的濃度較低時(shí)酶電極的響應(yīng)電流隨溶液濃度的增大而增加，并且兩者之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，這為用該電極來測(cè)量較低濃度的兒茶酚提供了可能性。

圖8為圖7的局部放大圖。

8、由圖7讀出每個(gè)濃度下兒茶酚對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流。見圖9的PS- b-P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的濃度校正曲線。

9、圖10為PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的線性范圍圖。是圖 9的線性部分。

由圖10可見：斜率為 22，結(jié)合玻碳電極的面積，計(jì)算得出 PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的靈敏度為 314 mA·M^-1·cm^-2。根據(jù)信噪比S /N = 3，階梯曲線的噪音為 1 × 10^-9 A，信號(hào)達(dá)到 3 倍于噪音時(shí)，S 為 3 × 10^-9 A，檢出限為 0.07 μM。同時(shí)可以看出 PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)兒茶酚的線性范圍為 0.12 ~ 30 μM（R = 0.995）。

10、圖11為PS-b -P4VP/PPO電極對(duì)不同酚類物質(zhì)的濃度校正曲線，其中：a）兒茶酚、b）對(duì)甲苯酚、c）苯酚、d）對(duì)氯苯酚。是在多酚氧化酶(1mg·mL^-1)的用量為6μg、PS-b-P4VP的體積為7μL、控制電位在-200mV、pH為6.0、溫度為25 °C時(shí)改變酚類物質(zhì)得到的。

由圖11可見：

（1）該電極對(duì)其他三種酚類化合物均有響應(yīng)，濃度電流曲線的趨勢(shì)與對(duì)兒茶酚的響應(yīng)相類似，即當(dāng)?shù)孜餄舛仍谳^小的范圍內(nèi)變化時(shí)，響應(yīng)電流值隨底物濃度的升高而呈線性增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^一定值逐步變大時(shí)，響應(yīng)電流則漸漸呈現(xiàn)出平緩趨勢(shì)。

（2）由圖11也可得到不同酚類物質(zhì)的線性范圍圖，從而得到各自酚類所對(duì)應(yīng)的斜率，結(jié)合玻碳電極的面積，計(jì)算得出 PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)不同酚類物質(zhì)的靈敏度。根據(jù)信噪比，階梯曲線的噪音，可以得到不同酚類物質(zhì)的檢出限。讀出飽和電流，然后通過達(dá)到飽和電流一半時(shí)對(duì)應(yīng)的兒茶酚濃度來計(jì)算米氏常數(shù)。匯總得到表1。

表1 PS-b -P4VP/PPO 電極對(duì)不同酚類的電催化性能

由上表可見：PS-b -P4VP/PPO生物電極對(duì)不同酚的檢測(cè)靈敏度順序?yàn)椋罕椒?gt;兒茶酚>對(duì)氯苯酚>對(duì)甲苯酚。

11、制備六根相同的多孔 PS-b -P4VP/PPO 電極，測(cè)定它們?cè)讪C200 mV vs. SCE 下對(duì) 10 μM 兒茶酚的響應(yīng)電流，六根電極的響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.43%；將電極儲(chǔ)存在 4°C 的冰箱中，每隔幾天，在室溫下測(cè)量電極在–200 mV vs. SCE 下對(duì) 10 μM 兒茶酚的響應(yīng)電流。取得圖12的 PS-b -P4VP/PPO 電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性圖。

由圖12可見：30天后電極的響應(yīng)電流（i ）仍能保持初始電流（i₀）（0.24 μA）的87.3%。這些結(jié)果表明，通過電荷-親疏水雙驅(qū)動(dòng)自組裝法構(gòu)筑的PS-b -P4VP/PPO 電極具有令人滿意的重復(fù)性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。