本發(fā)明涉及組織染色處理技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種采用偏振光顯微鏡觀察膠原纖維的染色方法。

背景技術(shù)：

膠原纖維廣泛分布于各個(gè)臟器內(nèi)，是含量最多的一種纖維，現(xiàn)有技術(shù)中已知的膠原纖維有四種類型（i、ii、iii、iv），這四種類型的膠原纖維對(duì)于研究病變的發(fā)生機(jī)理和演變有一定的意義，雖然免疫組織化學(xué)染色和分子病理學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，但特殊染色方法在病理學(xué)診斷中的應(yīng)用仍無(wú)法替代；目前常用的膠原纖維特殊染色方法包括masson染色、vangieson染色、he染色、苦味酸-天狼星紅染色方法等，在光鏡下，用masson染色、vangieson染色不能分辨不同類型的膠原纖維，難以在組織切片上完成對(duì)各型膠原纖維的分布、結(jié)構(gòu)及含量的觀察和檢測(cè)；且這類染色的步驟繁瑣，不易操作；應(yīng)用苦味酸-天狼星紅染色方法并結(jié)合偏光顯微鏡觀察膠原纖維，可提高分辨率；結(jié)合圖像分析技術(shù)，可以對(duì)不同類型的膠原纖維進(jìn)行定位和定量分析，即可分析膠原纖維的類型、分布、排列及含量，便于判斷組織纖維化的程度，這種方法較普通光鏡觀察具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

現(xiàn)有技術(shù)中利用常規(guī)的苦味酸-天狼星紅染色，在偏振光鏡下，膠原纖維著色較弱，效果不佳，且切片染色后常用乙醇脫水，容易使得黃色襯染背景減弱，導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)不清晰，影響觀察這對(duì)組織的正確觀察和病變分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種偏振光顯微鏡觀察膠原纖維的染色方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述方法在以非疾病診斷目的的判斷組織纖維化程度中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種采用偏振光顯微鏡觀察膠原纖維的染色方法，包括以下步驟：

s1.苦味酸-天狼星紅染色：將70℃～90℃下的飽和苦味酸-天狼星紅染液滴加入經(jīng)脫蠟至水處理過(guò)的組織切片上進(jìn)行染色；

s2.酸洗：用濃度為1～10%w/v的弱酸溶液浸洗組織切片；

s3.水浸洗，烘干，固定即可。

s1中70℃～90℃下的飽和苦味酸-天狼星紅染液是指70～90℃下在苦味酸-天狼星紅水溶液中，苦味酸的溶解度達(dá)最大且不再發(fā)生改變。

室溫下飽和的苦味酸溶液的制備：2.46g苦味酸溶于200ml蒸餾水中，加熱助溶，冷卻至室溫后，溶液底部有結(jié)晶析出，取上層清液備用，即得室溫下飽和的苦味酸溶液。

本發(fā)明所述70℃～90℃下飽和苦味酸-天狼星紅染液的制備：取0.1g苦味酸加入至1ml天狼星紅染液中，70℃～90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上層溶液備用，即得70℃～90℃下飽和苦味酸-天狼星紅染液。

現(xiàn)有技術(shù)已知：苦味酸的溶解度隨著溫度的升高而不斷增加，苦味酸在不同溫度的水中溶解度數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

本發(fā)明選擇使用70℃～90℃下飽和的苦味酸-天狼星紅染液，加熱后的苦味酸對(duì)組織的滲透作用加強(qiáng)，使得襯染背景更加鮮艷，加熱后的天狼星紅染液對(duì)膠原纖維的吸附也更牢，著色清晰；另外，苦味酸在70℃～90℃的苦味酸-天狼星紅染液中處于飽和狀態(tài)，選擇將70℃～90℃的苦味酸-天狼星紅染液滴加入組織切片上，由于組織切片處于常溫，這樣，進(jìn)入組織切片的苦味酸-天狼星紅染液溫度逐漸降低，使得苦味酸從組織切片內(nèi)的苦味酸-天狼星紅染液中逐漸析出，且存在于組織切片內(nèi)形成苦味酸結(jié)晶，待染色結(jié)束后，弱酸溶液溶解析出的苦味酸結(jié)晶，且不容易洗掉黃色襯染背景，從而保證膠原纖維著色佳，黃色襯染背景明顯，膠原纖維清晰。

前期研究表明70℃以下水浴后的苦味酸-天狼星紅染液對(duì)肝組織染色效果不佳，70℃以上水浴染液對(duì)肝組織染色效果較好，且苦味酸在70℃水浴后的苦味酸-天狼星紅染液中的濃度是組織切片出現(xiàn)苦味酸晶體析出的臨界點(diǎn)，故苦味酸-天狼星紅染液的溫度最好控制在70℃～90℃，避免過(guò)高溫水浴染液造成大量苦味酸晶體析出而增加后面晶體洗脫步驟時(shí)間。

本發(fā)明所述染色觀察方法中，還可以同時(shí)使用蘇木素對(duì)膠原纖維的細(xì)胞核進(jìn)行染色，由于蘇木素染色液中含有乙醇，乙醇的使用會(huì)減弱黃色襯染背景，因此，需要在進(jìn)行苦味酸-天狼星紅染色前，先進(jìn)行蘇木素染色；因此，本發(fā)明上述染色方法中，s1中，在采用飽和苦味酸-天狼星紅染液對(duì)組織切片上進(jìn)行染色之前，先采用蘇木素對(duì)組織切片進(jìn)行染色。

本發(fā)明s2所述弱酸選自可以溶解苦味酸，且不容易洗掉黃色襯染背景的弱酸即可，優(yōu)選地，s2所述弱酸選自乙酸或者檸檬酸，弱酸溶液的濃度控制在1～10%w/v，從而保證能夠洗掉組織切片內(nèi)的苦味酸結(jié)晶，同時(shí)避免過(guò)高濃度的弱酸溶液減弱天狼星紅對(duì)組織切片的染色。

優(yōu)選地，當(dāng)組織切片內(nèi)出現(xiàn)少量苦味酸結(jié)晶時(shí)，s2所述弱酸溶液的浸洗頻率為：浸洗1～2次，每次20～30s；當(dāng)組織切片內(nèi)出現(xiàn)大量結(jié)晶時(shí)，弱酸溶液的浸洗次數(shù)以使組織切片內(nèi)的苦味酸結(jié)晶消失為準(zhǔn)。

本發(fā)明所述方法染色后的膠原纖維清晰，且在偏振光顯微鏡下能夠分析膠原纖維的類型、分布、排列及含量，便于判斷組織纖維化的程度，因此，本發(fā)明還保護(hù)所述染色觀察方法在不是以疾病診斷作為目的的判斷組織纖維化程度中的應(yīng)用，如實(shí)驗(yàn)室制備膠原纖維觀察樣本等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種采用偏振光顯微鏡觀察膠原纖維的染色方法，是先用在70℃～90℃的飽和苦味酸-天狼星紅染液進(jìn)行染色，然后用弱酸溶液浸洗組織切片，最后按常規(guī)對(duì)組織切片進(jìn)行浸洗，烘干，固定即可；加熱后的苦味酸對(duì)組織的滲透作用加強(qiáng)，使得襯染背景更加鮮艷，加熱后的天狼星紅染液對(duì)膠原纖維的吸附也更牢，著色清晰；弱酸溶液可以洗掉組織切片內(nèi)析出的苦味酸結(jié)晶，且不容易洗掉黃色襯染背景，從而保證膠原纖維著色佳，黃色襯染背景明顯，膠原纖維清晰。

利用本發(fā)明所述染色方法重復(fù)性好，膠原纖維著色明顯，纖維結(jié)構(gòu)清晰，是介于淡黃色和淡綠色之間的雙折光性纖細(xì)條形和星點(diǎn)狀的類熒光物質(zhì)；該方法有利于對(duì)不同類型的膠原纖維進(jìn)行定位和定量分析，便于判斷組織纖維化程度。

附圖說(shuō)明

圖1為滴加70℃和90℃的飽和苦味酸-天狼星紅染液在組織切片上，苦味酸的結(jié)晶析出情況。

圖2為42天正常小鼠肝臟切片和42天肝硬化小鼠肝臟切片經(jīng)實(shí)施例3所述染色方法染色后在不同顯微鏡下的觀察圖像；圖2e為42天正常小鼠肝臟切片的普通光鏡下圖像（40倍）；圖2g為42天肝硬化小鼠肝臟切片的普通光鏡下圖像（40倍）；圖2f為42天正常小鼠肝臟切片的偏振光顯微鏡下圖像；圖2h為42天肝硬化小鼠肝臟切片的偏振光顯微鏡下圖像。

圖3為70℃水浴的飽和苦味酸-天狼星紅染液染色后的組織切片的普通光鏡圖（40倍）。

圖4為42天正常小鼠肝臟切片和42天肝硬化小鼠肝臟切片經(jīng)常規(guī)苦味酸-天狼星紅染色后在不同顯微鏡下的觀察圖像；其中，圖4a為42天正常小鼠肝臟切片的普通光鏡下圖像（40倍）；圖4c為42天肝硬化小鼠肝臟切片的普通光鏡下圖像（40倍）；圖4b為42天正常小鼠肝臟切片的偏振光顯微鏡下圖像；圖4d為42天肝硬化小鼠肝臟切片的偏振光顯微鏡下圖像。

圖5為滴加30℃和50℃的飽和苦味酸-天狼星紅染液在組織切片上，苦味酸的結(jié)晶析出情況。

圖6為30℃水浴的飽和苦味酸-天狼星紅染液染色后的組織切片的普通光鏡圖（40倍）。

圖7為50℃水浴的飽和苦味酸-天狼星紅染液染色后的組織切片的普通光鏡圖（40倍）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段（實(shí)施例中用到的偏振光顯微鏡為德國(guó)徠卡dmi8+dfc7000t顯微鏡）。

實(shí)施例1

組織來(lái)源于42天正常與慢性纖維化小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星紅染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星紅染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上層溶液備用。

染色方法：（1）將組織固定于10%甲醛溶液，病理常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋；（2）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水得組織切片；（3）在組織切片上滴加90℃水浴的苦味酸-天狼猩紅染液染30min；（4）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（5）流水稍微浸洗，去除組織切片表面染色液；（6）溫箱烘干，中性樹(shù)脂封片固定；（7）在普通光鏡與偏振光顯微鏡下觀察。

實(shí)施例2

組織來(lái)源于42天正常與慢性纖維化小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星紅染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星紅染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上層溶液備用。

染色方法：（1）將組織固定于10%甲醛溶液，病理常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋；（2）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水得組織切片；（3）在組織切片上滴加70℃水浴的苦味酸-天狼猩紅染液染30min；（4）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（5）流水稍微浸洗，去除組織切片表面染色液；（6）溫箱烘干，中性樹(shù)脂封片固定；（7）在普通光鏡與偏振光顯微鏡下觀察。

實(shí)施例3

組織來(lái)源于42天正常與慢性纖維化小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星紅染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星紅染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上層溶液備用。

染色方法：（1）將組織固定于10%甲醛溶液，病理常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋；（2）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水得組織切片；（3）蘇木素染液染6min，流水稍微沖洗組織切片；（4）在組織切片上滴加90℃水浴的苦味酸-天狼猩紅染液染30min；（5）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（6）流水稍微浸洗，去除組織切片表面染色液；（7）溫箱烘干，中性樹(shù)脂封片固定。

染色后將組織切片分別在普通光鏡與偏振光顯微鏡下觀察，90℃水浴的飽和苦味酸-天狼星紅染液滴入組織切片上后，組織切片內(nèi)有較多晶體吸出（圖1），普通光學(xué)顯微鏡結(jié)果如圖2：膠原纖維著色清晰，黃色襯染背景明顯（圖2e和圖2g），膠原纖維折光性強(qiáng)，線條清晰，結(jié)構(gòu)明顯（圖2f和圖2h）。

實(shí)施例4

組織來(lái)源于42天正常與慢性纖維化小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星紅染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星紅染液中，70℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上層溶液備用。

染色方法：（1）將組織固定于10%甲醛溶液，病理常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋；（2）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水得組織切片；（3）蘇木素染液染6min，流水稍微沖洗組織切片；（4）在組織切片上滴加70℃水浴的苦味酸-天狼猩紅染液染30min；（5）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（6）流水稍微浸洗，去除組織切片表面染色液；（7）溫箱烘干，中性樹(shù)脂封片固定。

染色后將組織切片分別在普通光鏡觀察，同樣表現(xiàn)為膠原纖維著色清晰，黃色襯染背景明顯（圖3）。

實(shí)施例5

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，唯一不同的是：本實(shí)施例在步驟（5）浸洗時(shí)用的是10%w/v乙酸溶液。

實(shí)施例6

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，唯一不同的是，本實(shí)施例在步驟（5）浸洗時(shí)用的是1%w/v檸檬酸溶液。

實(shí)施例7

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，唯一不同的是：本實(shí)施例在步驟（5）浸洗時(shí)用的是10%w/v檸檬酸溶液。

對(duì)比例1

組織來(lái)源于42天正常與慢性纖維化小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛固定。

常規(guī)苦味酸-天狼星紅染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星紅染液中，加熱助溶，冷卻至室溫后取上清液備用。

常規(guī)苦味酸-天狼星紅染色：（1）將組織固定于10%甲醛溶液，病理常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋；（2）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水得組織切片；（3）常規(guī)苦味酸-天狼星紅染液染組織切片60min，（4）流水稍微浸洗，去除組織切片表面染色液；（5）蘇木素染液復(fù)染6min，（6）流水沖洗10min，（7）溫箱烘干，中性樹(shù)脂封片固定。

將染色后的組織切片分別置于普通光鏡和偏振光鏡下觀察，結(jié)果如圖4：膠原纖維著色不清晰，襯染背景不明顯（圖4a和圖4c），且偏振光鏡下膠原纖維結(jié)構(gòu)模糊不清（圖4b和圖4d）。

對(duì)比例2

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，唯一不同的是：本對(duì)比例是在步驟（4）中滴加30℃水浴的飽和苦味酸-天狼星紅染液，結(jié)果表明：組織切片內(nèi)沒(méi)有苦味酸結(jié)晶析出，且膠原纖維著色較弱（如圖5和圖6）。

對(duì)比例3

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，唯一不同的是：本對(duì)比例是在步驟（4）中滴加50℃的飽和苦味酸-天狼星紅染液，結(jié)果表明：組織切片內(nèi)沒(méi)有苦味酸結(jié)晶析出，且膠原纖維著色較弱（如圖5和圖7）。