本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種腫瘤診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

目前，腫瘤已是威脅人類健康的一種全球性疾病，研發(fā)高效地用于腫瘤早期、微小轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測(cè)藥物對(duì)于延長(zhǎng)患者的生存周期及生存質(zhì)量至關(guān)重要。

近年來(lái)，隨著腫瘤基因組學(xué)和分子藥理學(xué)的飛速發(fā)展，新型的腫瘤靶向藥物的研發(fā)取得了不錯(cuò)的研究成果，但是許多靶向藥物的適應(yīng)癥范圍有限，且價(jià)格昂貴，副作用也不是十分明確。cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型igg1單克隆抗體，分子靶點(diǎn)為表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)，其中文藥品名通稱為“愛(ài)必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物。該藥的抗腫瘤機(jī)制主要是其可以以高出內(nèi)源性配體5-10倍的親和力與表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)特異結(jié)合，可阻礙內(nèi)源egfr配體的結(jié)合，從而抑制受體功能，進(jìn)一步誘導(dǎo)egfr內(nèi)吞從而導(dǎo)致受體數(shù)量的下調(diào)，抑制細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞的入侵及轉(zhuǎn)移等等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤診斷試劑盒，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種腫瘤診斷試劑盒，其包括：

(1)活性成分cetuximab；

(2)能夠與cetuximab偶聯(lián)并保持cetuximab活性的熒光標(biāo)記物。

其中，所述的cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型igg1單克隆抗體，分子靶點(diǎn)為表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)，其中文藥品名通稱為“愛(ài)必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物，常規(guī)市售可得。

其中，所述的腫瘤包括各類良性腫瘤、惡性腫瘤，以及癌前病變組織。所述的腫瘤更優(yōu)選包括肺癌、結(jié)直腸癌以及食管癌中的一種或幾種。

其中，所述的熒光標(biāo)記物為本領(lǐng)域常規(guī)，只要其能夠與cetuximab偶聯(lián)并保持cetuximab的活性即可，優(yōu)選包括fitc(fluoresceinisothiocyanate，異硫氰酸熒光素)、irdye800、icg(吲哚菁綠)、花菁染料和cy類熒光染料中的一種或幾種。

其中的cy類熒光染料為本領(lǐng)域的常規(guī)試劑，包括cy7、cy5.5、cy3及其衍生物等，市售可得。

如本領(lǐng)域常規(guī)，所述的腫瘤診斷試劑盒還可以包括用于腫瘤診斷的各類常規(guī)試劑和/或儀器，如pbs緩沖液等。

為了增加產(chǎn)品使用的方便性，在本發(fā)明的一較佳實(shí)例中，將上述能夠與cetuximab偶聯(lián)并保持cetuximab活性的熒光標(biāo)記物與cetuximab配制成cetuximab-fitc溶液，所述腫瘤診斷試劑盒包括：

(1)2mg/ml的cetuximab-fitc；

(2)20mg/ml的磷酸二氫鈉、66mg/ml的磷酸氫二鈉和424mg/ml的氯化鈉。

本發(fā)明公開了cetuximab的一種新用途，通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)對(duì)cetuximab進(jìn)行一定熒光標(biāo)記后具有食管癌、結(jié)直腸癌以及肺癌等早期檢測(cè)的功效，實(shí)現(xiàn)舊藥新用。

附圖說(shuō)明

圖1顯示實(shí)施例1中流式細(xì)胞儀分析不同食管癌細(xì)胞系對(duì)cetuximab-fitc的攝取情況的結(jié)果；

圖2顯示實(shí)施例1中熒光顯微鏡觀察不同食管癌細(xì)胞系對(duì)cetuximab-fitc的攝取情況的結(jié)果；

圖3顯示實(shí)施例1中靜脈注射cetuximab-irdye800后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠活體熒光圖像的結(jié)果；

圖4顯示實(shí)施例1中靜脈注射cetuximab-irdye800后檢測(cè)其對(duì)微小病灶的檢測(cè)能力的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)當(dāng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型igg1單克隆抗體，分子靶點(diǎn)為表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)，其中文藥品名通稱為“愛(ài)必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物。該藥的抗腫瘤機(jī)制主要是其可以以高出內(nèi)源性配體5-10倍的親和力與表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)特異結(jié)合，可阻礙內(nèi)源egfr配體的結(jié)合，從而抑制受體功能，進(jìn)一步誘導(dǎo)egfr內(nèi)吞從而導(dǎo)致受體數(shù)量的下調(diào)，抑制細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞的入侵及轉(zhuǎn)移等等。但是，截止目前，本領(lǐng)域尚沒(méi)有關(guān)于將cetuximab作為腫瘤篩查或診斷藥物應(yīng)用的報(bào)道。

本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)整合癌癥組學(xué)cosmicversion72數(shù)據(jù)庫(kù)的癌癥基因譜cancergenecensus以及蛋白質(zhì)相互作用stringversion10數(shù)據(jù)庫(kù)和drugbankversion4.2中fda批準(zhǔn)的藥物數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的候選重定位藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了篩查實(shí)驗(yàn)，篩選出新的抗腫瘤藥物。做腫瘤細(xì)胞系篩選的候選腫瘤抑制藥物如下：

cetuximab,trasruzumab,lidocaine,gefitinib,erlotinib,lapatinib,panitumumab,vandetanib,afatinib,osimertinib,nacitumumab,bevacizumab,minocyxline,gliclazide,carvedilol,ranibizumab,vandetanib,dalteparin,aflibercept.

在研究的過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，對(duì)cetuximab進(jìn)行一定熒光標(biāo)記后具有食管癌、結(jié)直腸癌以及肺癌等早期檢測(cè)的功效，可以實(shí)現(xiàn)舊藥新用，遂欲申請(qǐng)專利進(jìn)行保護(hù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案不局限于以下所列舉的具體實(shí)施方式，可以是各種實(shí)施方式之間的任意組合。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的儀器、材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為可從常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

下述實(shí)施例中待測(cè)藥物的活性成分為cetuximab(即西妥昔單抗，中文藥品名通稱為“愛(ài)必妥”)，其化學(xué)式為：c6484h10042n1732o2023s36，其重鏈為qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdyntpftsrlsinkdnsksqvffkmnslqsndtaiyycaraltyydyefaywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(如序列表中seqidno.1所示)，其輕鏈為dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqnnnwpttfgagtklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(如序列表中seqidno.2所示)；其為drugbank產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為db00002。

下述實(shí)施例中的人食管癌細(xì)胞系te-1、人食管鱗癌細(xì)胞系kyse30的出處如下：

te-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，資源編號(hào)為3131c0001000700089；

kyse30購(gòu)自上海科佰生物有限公司，貨號(hào)為cbp60457。

下述實(shí)施例中的動(dòng)物出處如下：

balb/c裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

下述實(shí)施例中的主要儀器及耗材的來(lái)源如下：

12-well白色底透細(xì)胞培養(yǎng)板(costar產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為no.3513)；

fetalbovineserum(gibco產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為10099141)；

100mm培養(yǎng)皿(corning產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為430167)；

rpmi-1640medium(gibco產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為a1049101)；

dmso(sigma產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為no.d4540)；

流式細(xì)胞儀(bd產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為accuric6，usa)；

熒光倒置顯微鏡(leica，dmi3000b，german)；

高檢測(cè)靈敏度的光學(xué)成像系統(tǒng)(perkinelmer，ivisspectrum，usa)。

實(shí)施例1cetuximab的靶向性及特異性檢測(cè)

一、待測(cè)孔板的制備

1、細(xì)胞鋪板

a)配制各細(xì)胞所需的完全培養(yǎng)基。

具體地，基本培養(yǎng)基rpmi或dmem占80％-90％，胎牛血清占10％-20％，按1％的體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100u/ml和100μg/ml。

b)實(shí)驗(yàn)開始前，確認(rèn)標(biāo)記在100mm培養(yǎng)皿上的細(xì)胞系的名字、培養(yǎng)基以及傳代時(shí)間、代次等信息，確保實(shí)驗(yàn)無(wú)誤。

c)利用無(wú)菌吸管吸取細(xì)胞培養(yǎng)基。

d)用3-5ml的無(wú)菌pbs溶液潤(rùn)洗細(xì)胞表層，再用無(wú)菌吸管吸出pbs廢液。

e)向培養(yǎng)基中加入1ml0.25％(w/v)含0.04％(w/v)edta的胰酶溶液用于消化細(xì)胞，輕輕混勻，使溶液覆蓋住細(xì)胞表層，在顯微鏡下觀察，等細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿底部且細(xì)胞連接較松散時(shí)加入5-10ml完全培養(yǎng)基并進(jìn)行吹打。

f)將細(xì)胞分離成單個(gè)后，將此細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml無(wú)菌離心管中，800rpm離心5min。

g)利用無(wú)菌吸管吸出上清培養(yǎng)基，并加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻，

h)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度并接種到12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔。

2、待測(cè)藥物cetuximab-fitc的配制和加藥

1)cetuximab-fitc的制備

將cetuximab分散到ph為8.5的pbs中，并按照摩爾比1:1～1:3的比例加入fitc，在35℃的條件下反應(yīng)2h。cetuximab-fitc復(fù)合物用pd10脫鹽柱進(jìn)行分離純化。其具體濃度及連接效率通過(guò)hplc進(jìn)行分析。

2)取上述配制好的1mg/ml的待測(cè)藥物cetuximab-fitc用培養(yǎng)基分別稀釋到5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，其中5，10，20，50，100μg/ml的藥物用于流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，50，100，200μg/ml的藥物用于熒光倒置顯微鏡的觀察。不加任何藥物的孔作為對(duì)照孔。每個(gè)濃度設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔。

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)待測(cè)藥物的靶向性和特異性

1)利用無(wú)菌吸管將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸除。

2)步驟1中配制好的待測(cè)藥物加入到12孔培養(yǎng)板中，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

3)利用無(wú)菌吸管吸出培養(yǎng)基廢液，并加入1-2ml無(wú)菌pbs/孔清洗細(xì)胞表層，再用無(wú)菌吸管吸出pbs廢液。

4)向培養(yǎng)板中加入0.2ml0.25％(w/v)含0.04％(w/v)edta的胰酶溶液用于消化細(xì)胞，輕輕混勻，使溶液覆蓋住細(xì)胞表層，在顯微鏡下觀察，等細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿底部且細(xì)胞連接較松散時(shí)加入1-2ml完全培養(yǎng)基并進(jìn)行吹打。

5)將上述細(xì)胞懸液分別置于1.5ml離心管中，800rpm離心5min，并用無(wú)菌pbs洗滌2-3次。

6)用0.5ml無(wú)菌pbs重懸細(xì)胞沉淀，吹打均勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出，腫瘤細(xì)胞te-1(圖1a)和kyse30(圖1b)對(duì)待測(cè)藥物具有很好的攝取且隨著藥物濃度增加其細(xì)胞攝取量也逐漸增加，為了更直觀地顯示這種關(guān)系，我們以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖(圖1c)，從圖中可以看出待測(cè)藥物的攝取不僅僅與濃度有關(guān)，且在不同細(xì)胞間存在很大差異，其攝取量與細(xì)胞表面egfr的表達(dá)水平成正相關(guān)(egfr水平te-1<kyse30)。

4、熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)待測(cè)藥物的攝取情況

1)利用無(wú)菌吸管將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸除。

2)步驟1中配制好的待測(cè)藥物加入到12孔培養(yǎng)板中，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

3)利用無(wú)菌吸管吸出培養(yǎng)基廢液，并加入1-2ml無(wú)菌pbs/孔清洗細(xì)胞表層2-3次，再用無(wú)菌吸管吸出pbs廢液。

4)將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡中進(jìn)行觀察。

結(jié)果如圖2所示，從結(jié)果圖中可以看出與流式細(xì)胞儀的結(jié)果保持了高度的一致性。

二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)待測(cè)藥物的在體靶向性和精確性

1、荷瘤小鼠模型的建立

取kyse30腫瘤細(xì)胞，800轉(zhuǎn)離心5min，再用無(wú)菌pbs洗滌腫瘤細(xì)胞3次，并做適當(dāng)稀釋，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)制成濃度為6×10⁷個(gè)/ml的腫瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠背部偏左后肢皮下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.1ml。

接種完成后，逐日觀察接種部位有無(wú)感染，腫瘤生長(zhǎng)后有無(wú)自然消退，用游標(biāo)卡尺，每3天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑a和短徑b，并計(jì)算腫瘤體積，即v＝(a×b²)/2，每3天稱量小鼠體重和腫瘤并記錄，繪制曲線。

2、靶向性驗(yàn)證

先制備cetuximab-irdye800溶液：將irdye800分散到ph7.4的pbs中，并加入10倍摩爾量的edc和nhs，活化反應(yīng)10-20min，之后加入一定量的cetuximab(其摩爾量是染料的1/3～1倍)，在35℃的條件下反應(yīng)2h。cetuximab-irdye800復(fù)合物用pd10脫鹽柱進(jìn)行分離純化。其具體濃度及連接效率通過(guò)hplc進(jìn)行分析。

待腫瘤體積達(dá)～100mm³時(shí)，靜脈注射1mg/ml的cetuximab-irdye800溶液0.1ml，用高檢測(cè)靈敏度的光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)的熒光分布情況。

結(jié)果如圖3所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)待測(cè)藥物在腫瘤部位的富集在24h時(shí)達(dá)到峰值，時(shí)間繼續(xù)增加雖腫瘤部位熒光強(qiáng)度減弱，但與周圍組織的區(qū)分度越來(lái)越明顯，說(shuō)明待測(cè)藥物具有很好的腫瘤靶向性。

3、精確性驗(yàn)證

在同一小鼠上接種兩個(gè)腫瘤，一大一小，大腫瘤的直徑約12mm，小腫瘤的直徑<2mm,靜脈注射1mg/ml的cetuximab-irdye800溶液0.1ml，用高檢測(cè)靈敏度的光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)的熒光分布情況。

結(jié)果如圖4所示，圖4中，左側(cè)顯示注射前觀察結(jié)果，右邊顯示注射后24小時(shí)觀察結(jié)果(實(shí)際上在注射后6小時(shí)即能顯示腫瘤位置，24小時(shí)時(shí)顯示更為精確)，圖4中不僅僅大腫瘤能夠顯現(xiàn)，<2mm的小腫瘤也能明確顯現(xiàn)出來(lái)，說(shuō)明了待測(cè)藥物具有很好的精確性。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明cetuximab與染料的復(fù)合物無(wú)論在細(xì)胞水平還是動(dòng)物水平都體現(xiàn)了很好的靶向性，而且可以檢測(cè)到直徑小于2mm的腫瘤，在腫瘤早期診斷中具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所

<120>一種腫瘤診斷試劑盒

<130>ib168671

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>449

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cetuximab重鏈

<400>1

glnvalglnleulysglnserglyproglyleuvalglnprosergln

151015

serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr

202530

glyvalhistrpvalargglnserproglylysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethr

505560

serargleuserileasnlysaspasnserlysserglnvalphephe

65707580

lysmetasnserleuglnserasnaspthralailetyrtyrcysala

859095

argalaleuthrtyrtyrasptyrgluphealatyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalseralaalaserthrlysglyproservalphe

115120125

proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu

130135140

glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp

145150155160

asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu

165170175

glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser

180185190

serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro

195200205

serasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys

210215220

thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro

225230235240

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

245250255

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

260265270

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

275280285

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

290295300

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

305310315320

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys

325330335

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

340345350

leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr

355360365

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

370375380

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

385390395400

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

405410415

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

420425430

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

435440445

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<210>2

<211>214

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cetuximab輕鏈

<400>2

aspileleuleuthrglnserprovalileleuservalserprogly

151015

gluargvalserphesercysargalaserglnserileglythrasn

202530

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354045

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