本發(fā)明涉及紙芯片技術(shù)、熒光檢測技術(shù)，更具體地說是基于適配體對目標物的特異性結(jié)合特性構(gòu)建了一個用于凝血酶檢測的簡單、靈敏的紙基熒光傳感器。

背景技術(shù)：

凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,在止血、血管生成和腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的診斷等分子生物學(xué)中有著重要作用。由于其在生物學(xué)的重要性,凝血酶的檢測分析包含各種技術(shù)比如比色、表面增強拉曼光譜和表面等離子體共振等。各種基于電化學(xué)、光致電、電化學(xué)發(fā)光和其他分析的適體傳感器已廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測。與傳統(tǒng)的分子識別體系相比,寡核苷酸適配子因合成簡單，便于標記，較強的穩(wěn)定性，廣泛的實用性等優(yōu)點具有很強的競爭力。

為了提高凝血酶檢測的靈敏度，貴金屬復(fù)合納米材料因其比表面積大、生物相容性好等優(yōu)勢在科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域引起了很大的關(guān)注。長有這種貴金屬復(fù)合納米材料的紙芯片，不僅增加了紙芯片的比表面積，而且有效降低了紙的背景熒光，因而廣泛應(yīng)用于各種類型的生物傳感器中。近幾年，量子點因其制備過程簡單，生物相容性好，激發(fā)光譜較寬，對稱性高的發(fā)射光譜，具有抗漂白性等優(yōu)點。使其被廣泛地用作生物標記材料。用量子點代替有機熒光標記材料，可以大大減少成本，提高檢測地靈敏度。同時選用生物相容性非常好地多孔氧化鋅作為載體，大孔結(jié)構(gòu)大大提高了該體系中量子點的負載量，從而進一步提高檢測靈敏度。

自2007年以來，紙基傳感器因其低成本，大比表面積，易折疊、處理、成型，生物相容性好等特點被應(yīng)用于臨床診斷的研究。我們利用紙的可折疊性將其折成理想的構(gòu)象，并且利用紙纖維的毛細管現(xiàn)象，水可以自發(fā)流動避免了泵的引入起到真正意義上的裝置簡化。通過對紙芯片的合理設(shè)計和裁剪，結(jié)合適配體和凝血酶的特異性結(jié)合構(gòu)建了一個簡單、靈敏的紙基熒光傳感器。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是充分利用紙的可折疊性和毛細管現(xiàn)象及AuPt合金納米粒子的優(yōu)良性能制備一種新型的紙基熒光分析器件，并結(jié)合適配體的特異性識別功能實現(xiàn)方便快捷地高靈敏檢測凝血酶。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：

（1）在計算機上設(shè)計如附圖1所示的紙芯片疏水蠟打印圖案；

（2）將步驟（1）中設(shè)計的打印圖案通過蠟打印機打印在已裁剪為A4大小的色譜紙上，然后將帶有蠟圖案的A4色譜紙通過加熱到125oC的平板加熱器加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；

（3）在步驟（2）中得到的色譜紙的工作區(qū)域進行功能化，生長AuPt雙金屬后進行適配體1的修飾，滴加50μL待檢測的凝血酶，反應(yīng)45 min后用磷酸緩沖溶液清洗后用牛血清白蛋白封鎖非活性位點；

（4）在步驟（2）中得到的色譜紙的孵化區(qū)域滴40μL合成好的QDs@ZnO熒光標記物和 60μL的1 μM適配體2，進行熒光標記和適配體2的反應(yīng)；

（5）將紙芯片沿著折疊線折疊，連有適配體2的熒光標記物QDS@ZnO在紙纖維的毛細作用力下通過流體到達工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用磷酸緩沖溶液洗滌：

（6）將步驟（5）中紙芯片工作區(qū)放入熒光設(shè)備中，在340 nm的激發(fā)波長下進行熒光測定，繪制熒光強度與凝血酶的濃度關(guān)系，實現(xiàn)對凝血酶的精確檢測。

本發(fā)明所述的對紙芯片的親水區(qū)域功能化的步驟為：對色譜紙的工作區(qū)域進行功能化地具體步驟為：用移液槍量取100 μL 金納米粒子滴于親水的工作區(qū)域，然后在室溫下自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗滌，室溫下干燥靜置；將1.0 mL 1wt% 氯金酸水溶液和2.5 mL 1% 氯鉑酸溶液快速混勻，移液槍量取60 μL混合液滴加到工作區(qū)域，然后用移液槍迅速量取40 μL新鮮配制的1wt%檸檬酸鈉水溶液滴到工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用二次水沖洗，然后用移液槍量取100μL 1 μM 適配體1滴于工作區(qū)域孵化1 h, 用pH為 7.4 磷酸緩沖溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封鎖非活性位點。

本發(fā)明所述的QDs@ZnO的制備步驟為：稱取0.3 g 炭黑溶于60 mL 6 M硝酸中，超聲2 h后在120 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點;稱取3.5 g可溶性淀粉溶于80 mL 沸水中，在85 oC下攪拌5 min后加入6 mmol 六水合硝酸鋅，通過逐滴加入氫氧化鈉將溶液pH調(diào)至8-9后繼續(xù)加熱30 min，然后將獲得的沉淀離心、洗滌并在500 oC下焙燒2 h獲得多孔氧化鋅，稱取0.6 g獲得的多孔氧化鋅溶于0.1 mM 的對巰基苯胺溶液中攪拌4 h；移液槍量取500μL合成好的量子點與2 mL 功能化的氧化鋅混合后在10 mg·mL^-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和20 mg·mL^-1的 N-羥基丁二酰亞胺作用下反應(yīng)30 min，離心，洗滌后溶于3 mL磷酸緩沖溶液中。

本發(fā)明的有益效果

（1）熒光探針的合成方法簡單，生物相容性好。

（2）利用適配體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)的抗原抗體識別方法。

（3）本發(fā)明所述的方法檢測成本低廉、操作簡單、靈敏度高。

附圖1：紙芯片的尺寸和形狀。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施。

實施例1：紙基適體熒光傳感器用于凝血酶檢測，其特征是包括以下步驟：

（1）在計算機上設(shè)計如附圖1所示的紙芯片疏水蠟打印圖案；

（2）將步驟（1）中設(shè)計的打印圖案通過蠟打印機打印在已裁剪為A4大小的色譜紙上，然后將帶有蠟圖案的A4色譜紙通過加熱到125oC的平板加熱器加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；

（3）在步驟（2）中得到的色譜紙的工作區(qū)域進行功能化，用移液槍量取100 μL 金納米粒子滴于親水的工作區(qū)域，然后在室溫下自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗滌，室溫下干燥靜置；將1.0 mL 1wt% 氯金酸水溶液和2.5 mL 1% 氯鉑酸快速混勻，移液槍量取60 μL混合液滴加到工作區(qū)域，然后用移液槍迅速量取40 μL新鮮配制的1wt%檸檬酸鈉水溶液滴到工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用二次水沖洗，然后用移液槍量取100μL 1 μM 適配體1滴于工作區(qū)域孵化1 h, 用pH為 7.4 磷酸緩沖溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封鎖非活性位點；

（4）在步驟（2）中得到的色譜紙的孵化區(qū)域進行一下操作；用移液槍量取100 μL 金納米粒子滴于親水的工作區(qū)域，然后在室溫下自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗滌，室溫下干燥靜置；將1.0 mL 1wt% 氯金酸水溶液和2.5 mL 1% 氯鉑酸快速混勻，移液槍量取60 μL混合液滴加到工作區(qū)域，然后用移液槍迅速量取40 μL新鮮配制的1wt%檸檬酸鈉水溶液滴到工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用二次水沖洗，然后用移液槍量取100μL 1 μM 適配體1滴于工作區(qū)域孵化1 h, 用pH為 7.4 磷酸緩沖溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封鎖非活性位點；

（5）將紙芯片沿著折疊線折疊，連有適配體2的熒光標記物QDS@ZnO在紙纖維的毛細作用力下通過流體到達工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用磷酸緩沖溶液洗滌；具體步驟為：稱取0.3 g 炭黑溶于60 mL 6 M硝酸中，超聲2 h后在120 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點;稱取3.5 g可溶性淀粉溶于80 mL 沸水中，在85 oC下攪拌5 min后加入6 mmol 六水合硝酸鋅，通過逐滴加入氫氧化鈉將溶液pH調(diào)至8-9后繼續(xù)加熱30 min，然后將獲得的沉淀離心、洗滌并在500 oC下焙燒2 h獲得多孔氧化鋅，稱取0.6 g獲得的多孔氧化鋅溶于0.1 mM 的對巰基苯胺溶液中攪拌4 h；移液槍量取500μL合成好的量子點與2 mL 功能化的氧化鋅混合后在10 mg·mL^-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和20 mg·mL^-1的 N-羥基丁二酰亞胺作用下反應(yīng)30 min，離心，洗滌后溶于3 mL磷酸緩沖溶液中；

（6）將步驟（5）中紙芯片工作區(qū)放入熒光設(shè)備中，在340 nm的激發(fā)波長下進行熒光測定，繪制熒光強度與凝血酶的濃度關(guān)系，實現(xiàn)對凝血酶的精確檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 濟南大學(xué)

<120> 一種用于凝血酶檢測的紙基適體熒光傳感器的構(gòu)建

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

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<400> 2

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