本發(fā)明屬于靈芝質(zhì)量控制
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種赤靈芝對照品提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：靈芝在我國已有上千年的歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，靈芝固本培元，久食不老，輕身延年。然而，靈芝作為一種真菌類藥材，品種繁多，不同品種的靈芝化學(xué)成分差異巨大，即使同為赤靈芝，又分為很多亞種，靈芝的不同部位子實(shí)體與孢子粉成分也完全不同，菌絲體也與子實(shí)體在成分上有很大差異。中藥的功效是建立在其所含有的化學(xué)物質(zhì)的組成和含量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上的，如果化學(xué)組成和含量差異很大，那么其功效必然會產(chǎn)生很大的不確定性。同時，以化學(xué)組成和含量差異巨大的靈芝藥材為原料生產(chǎn)的靈芝產(chǎn)品也必然無法做到質(zhì)量穩(wěn)定可靠，療效確切。因此，對靈芝藥材和靈芝產(chǎn)品進(jìn)行鑒別和質(zhì)量評價非常重要。目前，靈芝藥材的有效成分為靈芝三萜和多糖。目前檢測靈芝三萜主要方法為紫外法，但該方法專屬性差無法區(qū)分靈芝三萜與甾醇。本領(lǐng)域內(nèi)有學(xué)者用液相色譜法，以靈芝中不同靈芝酸單體化合物對照品為參照，檢測靈芝藥材中靈芝三萜含量。這種方法的專屬性強(qiáng)，但由于靈芝三萜對照品過于稀有昂貴，并且單一一種靈芝酸單體化合物的含量無法代表靈芝中全部靈芝酸的含量。因此該方法難于應(yīng)用于生產(chǎn)和流通領(lǐng)域。開發(fā)一種可有效降低成本且有利于全面準(zhǔn)確評價赤靈芝優(yōu)劣的對照品非常有必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種赤靈芝提取物對照品及赤靈芝提取物對照品的制備方法，可有效解決赤靈芝質(zhì)量評價中對照品的成本高，且無法全面準(zhǔn)確評價赤靈芝優(yōu)劣的問題。本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：一種赤靈芝提取物對照品的制備方法，包括對赤靈芝進(jìn)行提取以獲得赤靈芝提取物的步驟，還包括將不同的赤靈芝提取物相互勾兌以獲得赤靈芝提取物對照品的步驟，所述赤靈芝提取物對照品中含有如下質(zhì)量百分含量的各組分：靈芝酸A為0.3％-0.5％，靈芝酸B為0.15％-0.4％，靈芝酸C2為0.3％-0.5％，靈芝酸G為0.25％-0.5％。優(yōu)選的，用于制備赤靈芝提取物對照品的赤靈芝原料藥材為至少兩種赤靈芝藥材。進(jìn)一步的，還包括對赤靈芝提取物對照品中的靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G的含量進(jìn)行標(biāo)定的步驟。優(yōu)選的，所述赤靈芝提取物的制備包括如下步驟：將赤靈芝粉碎，加入溶劑提取，對提取液進(jìn)行過濾，收集濾液；優(yōu)選的，所述提取采用加熱回流提取、超聲提取、微波提取、滲漉提取或閃式提取。優(yōu)選的，還包括對濾液進(jìn)行減壓濃縮、向濃縮物中加入輔料、繼續(xù)減壓濃縮至干的步驟；優(yōu)選的，所述輔料為糊精、微粉硅膠、淀粉、羧甲基纖維素中的至少一種；更優(yōu)選的，所述輔料和所述濃縮物的質(zhì)量比為0.5∶1～3∶1。優(yōu)選的，所述溶劑為甲醇、乙醇、體積濃度為70％以上的甲醇水溶液、或體積濃度70％以上的乙醇水溶液中的至少一種。其中最優(yōu)選為甲醇或體積濃度95％的乙醇水溶液。優(yōu)選的，還包括對用于制備赤靈芝提取物對照品的赤靈芝原料藥材進(jìn)行篩選的步驟，所述篩選步驟包括如下步驟：建立赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜，將待選靈芝藥材進(jìn)行液相色譜分析并將所獲得的圖譜與所述赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照，篩選出相似度大于90％的藥材；進(jìn)一步優(yōu)選的，將所述相似度大于90％的藥材進(jìn)行菌種鑒定，篩選確認(rèn)為赤靈芝的藥材；更進(jìn)一步優(yōu)選的，對篩選出的藥材進(jìn)行含量分析，篩選出靈芝酸A質(zhì)量含量大于0.02％、靈芝酸B質(zhì)量含量大于0.01％、靈芝酸C2質(zhì)量含量大于0.015％、靈芝酸G質(zhì)量含量大于0.015％的藥材。作為一種具體實(shí)施方式，所述赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜按照如下步驟建立：將來自不同產(chǎn)地的靈芝藥材進(jìn)行薄層圖譜鑒別，并與赤靈芝對照藥材的薄層圖譜進(jìn)行對比，選出與赤靈芝對照藥材的薄層圖譜在相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)的藥材為優(yōu)選藥材；將優(yōu)選藥材通過液相色譜分析獲得指紋圖譜，并將所得指紋圖譜輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進(jìn)行指紋圖譜分析并生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜。作為一種優(yōu)選方案，所述液相色譜的色譜條件包括：色譜柱選擇反相色譜柱，流動相包括流動相A和流動相B，流動相A為三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一種與甲醇、乙腈中的至少一種的混合溶液，流動相B為三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一種的水溶液；優(yōu)選的，所述流動相A為0.05～0.15％(質(zhì)量)三氟乙酸乙腈溶液，流動相B為0.05～0.15％(質(zhì)量)三氟乙酸水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選的，流動相的梯度洗脫程序?yàn)椋篈+B＝100％(體積)，在0-35min，流動相A維持在20-30％(體積)，流動相B維持在70-80％(體積)；在35-90min，流動相A維持在60-70％(體積)，流動相B維持在30-40％(體積)；在90-120min，流動相A維持在100％(體積)，流動相B維持在0％(體積)。作為一種優(yōu)選方案，所述薄層圖譜鑒別按照如下參數(shù)進(jìn)行：薄層板為硅膠薄層板，展開劑為體積比12～17∶12～17∶0.5～1.5∶0.1的甲苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸，顯色劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％-50％硫酸乙醇溶液。本發(fā)明第二方面提供一種赤靈芝提取物對照品，包括如下質(zhì)量百分含量的各組分：靈芝酸A為0.3％-0.5％，靈芝酸B為0.15％-0.4％，靈芝酸C2為0.3％-0.5％，靈芝酸G為0.25％-0.5％。；和/或，所述赤靈芝提取物對照品采用如上文所述的制備方法制得。上文所述的赤靈芝提取物對照品可應(yīng)用于赤靈芝藥材的質(zhì)量評價及含有赤靈芝成分產(chǎn)品的質(zhì)量評價方面的應(yīng)用本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下有益效果：本發(fā)明制備了一種赤靈芝提取物對照品作為赤靈芝質(zhì)量評價的對照物。本發(fā)明提供的赤靈芝提取物對照品在以下方面具有顯著優(yōu)越性：1、與靈芝三萜化學(xué)對照品相比1)與使用單一化合物(或幾種化合物的組合)為對照品比，使用本發(fā)明的赤靈芝提取物對照品來鑒別藥材，可以在薄層色譜和液相色譜上呈現(xiàn)更加豐富的圖譜信息，便于不同靈芝品種間的鑒別。2)現(xiàn)有的靈芝三萜化學(xué)對照品提取純化工藝復(fù)雜，成本高昂，難于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣。而本發(fā)明的赤靈芝提取物對照品制備工藝簡單，重復(fù)性好，能夠滿足定性、定量檢測靈芝中靈芝酸的要求。3)使用該赤靈芝提取物對照品可以實(shí)現(xiàn)用一個赤靈芝提取物對照品同時對赤靈芝樣本中的多個靈芝酸化合物含量進(jìn)行標(biāo)定。而使用靈芝三萜化學(xué)對照品則每次只能標(biāo)定赤靈芝樣本中的一個靈芝酸成分。因此，使用赤靈芝提取物對照品大大節(jié)省了檢測的時間和成本。2、與對照藥材相比：1)使用本發(fā)明的提取物對照品鑒別藥材具有更好的穩(wěn)定性和更強(qiáng)的通用性。對照藥材會受到自然環(huán)境的影響產(chǎn)生較大的批次差異，而提取物對照品由于可以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的調(diào)控和原料的勾兌，并且經(jīng)過進(jìn)一步嚴(yán)格標(biāo)定，可以更好的保證批次間的均一性。2)除此之外，提取物對照品在使用時不需要復(fù)雜前處理，溶解后可以直接使用。比對照藥材使用簡潔方便。3)對照藥材只能用于赤靈芝藥材或赤靈芝產(chǎn)品的定性鑒別，不能用于赤靈芝藥材中靈芝三萜的定量測定。而赤靈芝提取物對照品既可以用于赤靈芝藥材或赤靈芝產(chǎn)品的定性鑒別，也可以用于赤靈芝藥材中靈芝三萜的定量測定。綜上所述，赤靈芝提取物對照品可以同時實(shí)現(xiàn)靈芝對照藥材和靈芝化學(xué)對照品的功能，并且可以實(shí)現(xiàn)一個赤靈芝提取物對照品對多種靈芝成分的同時標(biāo)定，使用方便，成本低。是一種更加符合國際標(biāo)準(zhǔn)的對照品。附圖說明圖1是樣品1-樣品18的薄層色譜圖；圖2是樣品19-樣品30的薄層色譜圖；圖3是樣品31-樣品39的薄層色譜圖；圖4是樣品40-樣品45的薄層色譜圖；圖5是樣品46-樣品50的薄層色譜圖；圖6是30-50號靈芝藥材的液相色譜指紋圖譜分析圖；圖7是赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜；圖8是用赤靈芝提取物對照品薄層鑒別不同品種靈芝；圖9是赤靈芝藥材含量測定圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種赤靈芝提取物對照品，該赤靈芝提取物對照品的制備主要包括如下步驟：對赤靈芝進(jìn)行提取以獲得赤靈芝提取物的步驟，將不同的赤靈芝提取物相互勾兌以獲得赤靈芝提取物對照品的步驟，勾兌的目的之一是為了讓赤靈芝提取物對照品達(dá)到如下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即，含有如下質(zhì)量百分含量的各組分：靈芝酸A為0.3％-0.5％，靈芝酸B為0.15％-0.4％，靈芝酸C2為0.3％-0.5％，靈芝酸G為0.25％-0.5％。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是本申請發(fā)明人對不同產(chǎn)地多批次的赤靈芝藥材進(jìn)行質(zhì)量研究后并結(jié)合提取工藝和檢測方法，綜合評價得出的結(jié)果。當(dāng)赤靈芝提取物對照品符合該標(biāo)準(zhǔn)時，赤靈芝提取物對照品中的各項(xiàng)主要成分能夠體現(xiàn)赤靈芝藥材有效成分的特征，并且用于液相色譜及薄層色譜檢驗(yàn)時，其各組份的分離度能夠滿足定性定量測定的要求。所述勾兌為將不同批次提取或兩種以上赤靈芝藥材的赤靈芝提取物進(jìn)行勾兌。赤靈芝提取物可以是一種赤靈芝藥材或兩種以上赤靈芝藥材提取所得；較為優(yōu)選的方案是，采用兩種以上赤靈芝藥材來制備，從而可以使制得的提取對照品的條帶更豐富，不同成分的含量也更加均勻，從而得到更為優(yōu)質(zhì)的提取物對照品。本發(fā)明提供一種赤靈芝提取物對照品，其制備還進(jìn)一步包括對其中的靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G的含量進(jìn)行標(biāo)定的步驟。赤靈芝提取物的制備優(yōu)選按照包括如下步驟的方法進(jìn)行：將赤靈芝粉碎，加入溶劑提取，對提取液進(jìn)行過濾，收集濾液。優(yōu)選的，所述提取采用加熱回流提取、超聲提取、微波提取、滲漉提取或閃式提取，更為優(yōu)選的，所述提取采用加熱回流提取或超聲提取。優(yōu)選的，還包括對濾液進(jìn)行減壓濃縮的步驟；進(jìn)一步優(yōu)選的，還包括向濃縮物中加入輔料并繼續(xù)減壓濃縮至干的步驟。進(jìn)一步優(yōu)選的，輔料為糊精、微粉硅膠、淀粉、羧甲基纖維素中的至少一種，更為優(yōu)選的，輔料采用微粉硅膠，由于微粉硅膠不溶于水和有機(jī)溶劑，不會對對照品用于后續(xù)檢測帶來干擾；優(yōu)選的，輔料和濃縮物的質(zhì)量比為0.5∶1～3∶1，具體添加量根據(jù)濃縮物的質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整，使最終的提取物對照品的質(zhì)量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)即可。提取所用的溶劑優(yōu)選為甲醇、乙醇中的至少一種，溶劑的濃度范圍優(yōu)選為70～100％，較為優(yōu)選85-95％，最優(yōu)選為95％乙醇和純甲醇。作為一種優(yōu)選方案，對于用來制備赤靈芝提取物對照品的赤靈芝原料藥材進(jìn)行篩選，優(yōu)選采用經(jīng)過篩選的赤靈芝作為原料藥材。經(jīng)菌種鑒定為赤靈芝的藥材均可用來制備赤靈芝提取物對照品；但，作為一種優(yōu)選方案，對用來制備赤靈芝提取物對照品的赤靈芝藥材優(yōu)選采用包括如下步驟的方法來篩選：建立赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜，將待選赤靈芝藥材進(jìn)行液相色譜分析并將所獲得的的圖譜與所述赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照，篩選出相似度大于90％的藥材。進(jìn)一步的，篩選步驟還可以包括，對相似度大于90％的藥材進(jìn)行菌種鑒定，篩選出確定為赤靈芝的藥材。更進(jìn)一步的，優(yōu)選對篩選所得的藥材進(jìn)行含量分析，篩選出靈芝酸A質(zhì)量含量大于0.02％、靈芝酸B質(zhì)量含量大于0.01％、靈芝酸C2質(zhì)量含量大于0.015％、靈芝酸G質(zhì)量含量大于0.015％的藥材。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是本申請發(fā)明人對不同產(chǎn)地多批次的赤靈芝藥材進(jìn)行質(zhì)量研究后，綜合評價得出的結(jié)果。當(dāng)赤靈芝藥材符合該標(biāo)準(zhǔn)時，用該赤靈芝藥材所制備的提取物對照品更易符合赤靈芝提取物對照品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。作為一種具體實(shí)施方式，對于上文中赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立可以按照如下步驟進(jìn)行：將所收集的來自不同產(chǎn)地的靈芝藥材進(jìn)行薄層圖譜鑒別，并與赤靈芝對照藥材的薄層圖譜進(jìn)行對比，選出與赤靈芝對照藥材的薄層圖譜在相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)的藥材為優(yōu)選藥材；將優(yōu)選藥材通過液相色譜分析獲得指紋圖譜，并將所得指紋圖譜輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)進(jìn)行指紋圖譜分析并生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜。為了使赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜具有代表性，用于生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜的赤靈芝藥材樣本應(yīng)能代表市場上赤靈芝類產(chǎn)品的質(zhì)量，在下文的具體實(shí)施例中，具體是從50個靈芝樣本中選取了20例赤靈芝樣本用于生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜，但不表示更多或更少的樣本生成的標(biāo)準(zhǔn)圖譜就不具有代表性。作為優(yōu)選的，為了讓靈芝酸A、B、C2、G都得到較好分離，進(jìn)行液相色譜分析時所采用的色譜條件優(yōu)選包括：色譜柱優(yōu)選反相色譜柱，更優(yōu)選為C18ODS反相色譜柱。優(yōu)選的，流動相包括流動相A和流動相B，流動相A為三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一種與甲醇、乙腈中的至少一種的混合溶液，流動相B為三氟乙酸、甲酸、乙酸、磷酸中的至少一種的水溶液；更優(yōu)選的，所述流動相A為0.05～0.15％(質(zhì)量)三氟乙酸乙腈溶液，流動相B為0.05～0.15％(質(zhì)量)三氟乙酸水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選的，流動相的梯度洗脫程序?yàn)椋阂韵掳俜直染鶠轶w積百分比，A+B＝100％，在0-35min，流動相A維持在20-30％，流動相B維持在70-80％；在35-90min，流動相A維持在60-70％，流動相B維持在30-40％；在90-120min，流動相A維持在100％，流動相B維持在0％。進(jìn)一步優(yōu)選的，薄層圖譜鑒別按照如下參數(shù)進(jìn)行：薄層板采用硅膠薄層板，展開劑為體積比12～17∶12～17∶0.5～1.5∶0.1的甲苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸，顯色劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％-50％硫酸乙醇溶液。采用優(yōu)選的薄層圖譜鑒別條件，相比于中國藥典的薄層圖譜鑒別方法，可以出現(xiàn)更多條帶，可以明顯看出不同靈芝間的區(qū)別，從而更好的鑒別靈芝藥材。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明：實(shí)施例1赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立1.1、實(shí)驗(yàn)概述：對收集的50種來自不同產(chǎn)地的靈芝藥材(分別編號為1-50號)進(jìn)行薄層圖譜鑒別，篩選出其薄層色譜與赤靈芝對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)的靈芝藥材，共計(jì)20種。對該20種赤靈芝用液相色譜法進(jìn)行指紋圖譜分析，將所得圖譜輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜(見圖7)1.2、50種靈芝藥材薄層色譜鑒別1.2.1、50種靈芝藥材的樣品制備稱取2g靈芝藥材，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。即得。赤靈芝對照藥材購自中檢所。1.2.2、薄層鑒別色譜條件：1.2.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對50靈芝藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，薄層圖譜見圖1至圖5。由薄層圖譜可以得出1-30號樣本的薄層圖譜與赤靈芝對照藥材薄層圖譜不一致，31-50號樣本的薄層圖譜與赤靈芝對照藥材薄層圖譜一致。因此，選取31-50號樣本作為生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜的樣本。圖1-圖5中，標(biāo)號所代表的樣品分別為：1.河北黑芝、2.吉林紫芝1、3.吉林紫芝2、4.吉林紫芝3、5.大連靈芝1、6.大連靈芝2、7.南昆山黑芝1、8.南昆山黑芝2、9.南昆山黑芝3、10.云南野生紫芝1、11.云南野生紫芝2、12.福建黑芝、13.四川黑芝、14.江西黑芝1、15.江西黑芝2、16.湖北野生紫芝、17.安徽野生紫芝、18.海南樹舌靈芝、19.云南蜂窩靈芝20.云南血紅栓菌芝、21.美國大片、22.云南黑芝1、23.西藏黑芝、24.湖北黑芝1、25.湖北黑芝2、26.湖北黑芝3、27.云南黑芝2、28.云南野生黑芝1、29.云南野生黑芝2、30.山東川芝、31.吉林赤靈芝1、32.吉林赤靈芝2、33.浙江赤靈芝1、34.浙江赤靈芝2、35.山西赤靈芝1、36.山西赤靈芝2、37.福建赤靈芝、38.云南赤靈芝1、39.云南赤靈芝2、40.海南赤靈芝、41.吉林赤靈芝、42.山東赤靈芝、43.浙江麗水赤靈芝、44.安徽赤靈芝1、45.安徽赤靈芝2、46.吉林龍井赤靈芝1、47.吉林龍井赤靈芝2、48.山東赤靈芝1、49.山東赤靈芝2、50.山東赤靈芝3。1.3、生成赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜1.3.1、20種赤靈芝藥材的樣品制備稱取2g赤靈芝藥材，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。1.3.2、液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫步驟時間(min)0.1％三氟乙酸乙腈(％)0.1％三氟乙酸水(％)1026742352674390653541201000流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl1.3.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將30-50號赤靈芝樣本的液相色譜指紋圖譜輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)，分析結(jié)果如圖6所示，生成的赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖7所示。實(shí)施例2用于赤靈芝提取物對照品制備的赤靈芝原料的優(yōu)選2.1、實(shí)驗(yàn)概述用于赤靈芝提取物對照品制備的赤靈芝原料需滿足以下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：(1)藥材用液相色譜法分析其圖譜與赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜相對照，相似度應(yīng)大于90％(使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版)(2)靈芝酸A含量為大于0.02％，靈芝酸B含量為大于0.01％，靈芝酸C2含量為大于0.015％，靈芝酸G含量為大于0.015％。根據(jù)上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從6種赤靈芝樣本中優(yōu)選原料藥材，方法如下：2.2、原料藥材液相圖譜與赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度比較2.2.1、6種赤靈芝樣品的制備稱取2g赤靈芝藥材，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。2.2.2、液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl2.2.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：6種赤靈芝藥材的液相色譜圖譜與赤靈芝標(biāo)準(zhǔn)圖譜相對照，相似度結(jié)果如下表1所示。1-2號樣本相似度小于90％，因此不能作為赤靈芝提取物對照品的原料。3-6號樣本相似度大于90％，經(jīng)送至中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行菌種鑒定，均確定為赤靈芝。表1樣品相似度赤靈芝186.9％赤靈芝288.5％赤靈芝392.5％赤靈芝495.2％赤靈芝591.2％赤靈芝694.3％2.3、原料藥材靈芝三萜含量測定2.3.1、化學(xué)試劑：靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司2.3.2、實(shí)驗(yàn)方法：4種赤靈芝樣品的制備和液相色譜方法同上。靈芝酸對照品實(shí)驗(yàn)樣品的制備如下：分別稱取靈芝酸A、B、C2、G對照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。過0.22μm微孔濾膜，即得。2.3.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：3-6號樣品的靈芝三萜含量測定結(jié)果如下表2所示，從表2中數(shù)據(jù)得出：3號樣本靈芝酸B含量小于標(biāo)準(zhǔn)，4號樣本靈芝酸C2含量小于標(biāo)準(zhǔn)。5-6號樣本靈芝酸含量符合標(biāo)準(zhǔn)，因此，選取5號和6號樣本作為制備赤靈芝提取物對照品的原料藥材。表2實(shí)施例3赤靈芝提取物對照品制備3.1、實(shí)驗(yàn)概述赤靈芝提取物制備所用溶劑為甲醇，提取方式為加熱回流。3.2、實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例2中優(yōu)選出的2種赤靈芝藥材分別制備成赤靈芝提取物，制備方法如下：稱取赤靈芝藥材2kg粉碎，加入8倍量的甲醇16L，加熱回流提取兩次，每次1小時(液體沸騰開始計(jì)時)，濾過，收集濾液，在65℃下減壓濃縮至5L，各加入輔料微粉硅膠120g，繼續(xù)濃縮至干，得到赤靈芝提取物各200g，分別編號為1號赤靈芝提取物、2號赤靈芝提取物。稱取1號赤靈芝提取物200g，2號赤靈芝提取物200g，混合均勻，加入甲醇4L，攪拌使充分溶解混勻，濃縮至干，得到勾兌后赤靈芝提取物。實(shí)施例4.赤靈芝提取物對照品制備4.1實(shí)驗(yàn)概述赤靈芝提取物制備所用溶劑為甲醇，提取方式為超聲提取4.2實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例2中優(yōu)選出的2種赤靈芝藥材分別制備成赤靈芝提取物，制備方法如下：稱取赤靈芝藥材2kg粉碎，加入8倍量的甲醇16L，超聲提取兩次，每次1小時，濾過，收集濾液，在65℃下減壓濃縮至5L，各加入輔料微粉硅膠120g，繼續(xù)濃縮至干，得到赤靈芝提取物各200g，分別編號為1號赤靈芝提取物、2號赤靈芝提取物。稱取1號赤靈芝提取物200g、2號赤靈芝提取物200g，混合均勻，加入甲醇4L，攪拌使充分溶解混勻，濃縮至干，得到勾兌后赤靈芝提取物。實(shí)施例5.赤靈芝提取物對照品制備5.1實(shí)驗(yàn)概述赤靈芝提取物制備所用溶劑為95％乙醇，提取方式為加熱回流5.2實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例2中優(yōu)選出的2種赤靈芝藥材分別制備成赤靈芝提取物，制備方法如下：稱取赤靈芝藥材2kg粉碎，加入8倍量的95％乙醇16L，加熱回流提取兩次，每次1小時(液體沸騰開始計(jì)時)，濾過，收集濾液，在65℃下減壓濃縮至5L，各加入輔料微粉120g硅膠，繼續(xù)濃縮至干，得到赤靈芝提取物各200g，分別編號為1號赤靈芝提取物、2號赤靈芝提取物。稱取1號赤靈芝提取物200g、2號赤靈芝提取物200g，混合均勻，加入95％乙醇4L，攪拌使充分溶解混勻，濃縮至干，得到勾兌后赤靈芝提取物。實(shí)施例6.赤靈芝提取物對照品制備6.1實(shí)驗(yàn)概述赤靈芝提取物制備所用溶劑為95％乙醇，提取方式為超聲提取6.2實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例2中優(yōu)選出的2種赤靈芝藥材分別制備成赤靈芝提取物，制備方法如下：稱取赤靈芝藥材2kg粉碎，加入8倍量的95％乙醇16L，超聲提取兩次，每次1小時，濾過，收集濾液，在65℃下減壓濃縮至5L，各加入輔料微粉120g硅膠，繼續(xù)濃縮至干，得到赤靈芝提取物各200g，分別編號為1號赤靈芝提取物、2號赤靈芝提取物。稱取1號赤靈芝提取物200g、2號赤靈芝提取物200g，混合均勻，加入95％乙醇4L，攪拌使充分溶解混勻，濃縮至干，得到勾兌后赤靈芝提取物。實(shí)施例7標(biāo)定赤靈芝提取物對照品7.1.實(shí)驗(yàn)概述以靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G為對照品，用液相色譜法標(biāo)定赤靈芝提取物對照品中靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G的含量。7.2.試劑靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；實(shí)施例3制備的赤靈芝提取物對照品。7.2.1.赤靈芝提取物對照品及靈芝酸對照品的樣品制備稱取0.2g赤靈芝提取物對照品，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。分別稱取靈芝酸A、B、C2、G對照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。過0.22μm微孔濾膜，即得。7.2.2.液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl7.2.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用靈芝酸化學(xué)對照品標(biāo)定赤靈芝提取物對照品中的靈芝酸含量，含量數(shù)據(jù)如下表3所示。該方法中靈芝酸A、B、C2、G的分離度均大于0.9，理論塔板數(shù)均大于6000，RSD均小于1％，因此該方法可以用于標(biāo)定赤靈芝提取物對照品。用靈芝酸化學(xué)對照品標(biāo)定赤靈芝提取物對照品含量，赤靈芝提取物對照品的靈芝酸A、B、C2、G含量為：靈芝酸A：0.4108％，靈芝酸B：0.2286％，靈芝酸C2：0.3402％，靈芝酸G：0.3168％。該赤靈芝提取物對照品符合赤靈芝提取物對照品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(靈芝酸A為0.3％-0.5％，靈芝酸B為0.15％-0.4％，靈芝酸C2為0.3％-0.5％，靈芝酸G為0.25％-0.5％)。表3實(shí)施例8赤靈芝提取物對照品穩(wěn)定性8.1.實(shí)驗(yàn)概述用加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對赤靈芝提取物對照品進(jìn)行加速穩(wěn)定性考察。8.2.加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法將制備好的赤靈芝提取物對照品置于：溫度：40℃，濕度：90％±5％條件下，放置0、1、2、3、6個月，在0、1、2、3、6個月取出赤靈芝提取物對照品，用液相色譜法測定赤靈芝提取物對照品中靈芝酸含量。8.3.試劑靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)0-6個月樣品8.3.1.赤靈芝提取物對照品的樣品制備稱取0.2g赤靈芝提取物對照品，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。分別稱取靈芝酸A、B、C2、G對照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。過0.22μm微孔濾膜，即得。8.3.2.液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫步驟時間(min)0.1％三氟乙酸乙腈(％)0.1％三氟乙酸水(％)1026742352674390653541201000流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl8.3.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表4，加速穩(wěn)定性0-6個月赤靈芝提取物對照品中靈芝酸A、B、c2、G的RSD值小于1％，重復(fù)性好。因此該赤靈芝提取物對照品的保質(zhì)期暫定24個月。表4具體為實(shí)施例3制得的對照品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，實(shí)施例4-6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例3基本相似，不再贅述。表4：赤靈芝提取物對照品加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)實(shí)施例9赤靈芝提取物薄層鑒別不同品種靈芝9.1.實(shí)驗(yàn)概述用赤靈芝提取物對照品及薄層色譜方法鑒別靈芝品種，鑒別方法如下：9.2.實(shí)驗(yàn)樣品的制備稱取0.2g赤靈芝提取物對照品(實(shí)施例3產(chǎn)品)，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。稱取2g赤靈芝藥材及靈芝孢子粉，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。即得。9.2.1.薄層色譜條件：9.2.2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果薄層色譜檢測的圖譜見圖8，從圖中可以看出2號和3號樣本其薄層色譜與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，圖譜譜型一致，因此確認(rèn)樣本2號和3號是赤靈芝。從圖中可以看出4號至7號樣本其薄層色譜與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，沒有顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，圖譜譜型不一致，因此確認(rèn)樣本4號至7號不是赤靈芝藥材。因此，使用赤靈芝提取物對照品為對照物在薄層色譜檢測上可以區(qū)分不同品種靈芝。圖8中各標(biāo)號分別表示：1.赤靈芝提取物對照品、2.赤靈芝1、3.赤靈芝2、4.扛四靈芝、5.樹舌靈芝、6.紫芝、7.靈芝孢子粉。實(shí)施例10用赤靈芝提取物對照品和靈芝酸化學(xué)對照品標(biāo)定同一赤靈芝藥材靈芝酸含量10.1.實(shí)驗(yàn)概述用赤靈芝提取物對照品和靈芝酸化學(xué)對照品及用液相色譜方法標(biāo)定同一種赤靈芝藥材，其方法如下：10.2.試劑赤靈芝提取物對照品(實(shí)施例3產(chǎn)品)，赤靈芝藥材，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸G均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司10.2.1.樣品制備稱取2g赤靈芝藥材，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。稱取0.2g赤靈芝提取物對照品用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。分別稱取靈芝酸A、B、C2、G對照品5mg，用甲醇溶解定容至5ml容量瓶中。過0.22μm微孔濾膜，即得。10.2.2.液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫步驟時間(min)0.1％三氟乙酸乙腈(％)0.1％三氟乙酸水(％)1026742352674390653541201000流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl10.2.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用赤靈芝提取物對照品標(biāo)定赤靈芝藥材中靈芝酸的含量與用靈芝酸化學(xué)對照品標(biāo)定赤靈芝藥材中靈芝酸的含量的數(shù)據(jù)見表5。從表5數(shù)據(jù)可以看出：用兩種標(biāo)定方法標(biāo)定赤靈芝藥材中的靈芝酸含量其含量相差均小于2％，RSD值均小于1％，分離度均大于0.9，理論塔板數(shù)均大于6000。因此可以用赤靈芝提取物對照品替代靈芝酸化學(xué)對照品作為對照物檢測赤靈芝中的靈芝酸含量。表5：兩種不同標(biāo)定方式標(biāo)定靈芝酸含量的數(shù)據(jù)實(shí)施例11用赤靈芝提取物對照品測定赤靈芝藥材靈芝酸含量11.1.實(shí)驗(yàn)概述用赤靈芝提取物對照品及液相色譜法測定赤靈芝藥材中靈芝酸含量，方法如下：11.2.樣品制備稱取2g藥材，加入30ml甲醇超聲(150w，44khz)30min，過濾，濾渣加入30ml甲醇超聲30min，過濾，濾紙用少量甲醇潤洗，水浴蒸干濾液，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。稱取0.2g赤靈芝提取物對照品(實(shí)施例3產(chǎn)品)，用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中。樣品過0.22μm微孔濾膜，即得。11.2.1.液相色譜條件色譜柱：TSKgelODS-80Tm(5μm150*4.6mm)流動相：按下表比例，梯度洗脫流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：256nm進(jìn)樣量：10μl11.2.2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用赤靈芝提取物對照品測定赤靈芝藥材中靈芝酸含量的數(shù)據(jù)見表6及圖9，圖9中橫坐標(biāo)為藥材編號，縱坐標(biāo)為靈芝酸含量。從表6可以看出：測定的13個樣本中赤靈芝藥材中編號為3號和11號的樣本靈芝酸含量遠(yuǎn)高于其他樣本，含量超過4mg/g，編號為1、2、4、5-8號的樣本靈芝酸含量相對較低，不超過1mg/g，其他樣本的靈芝酸含量在1mg/g-3mg/g之間。因此可以明顯看出：用赤靈芝提取物可以辨別出赤靈芝藥材質(zhì)量的好壞。表6：用赤靈芝提取物對照品測定赤靈芝藥材中靈芝酸含量以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3