本發(fā)明涉及藥材指標(biāo)性成分分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種近紅外光譜快速測定艾納香葉粉中左旋龍腦含量的方法。

背景技術(shù)：

艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC.)又名大風(fēng)艾，為菊科多年生草本植物，在我國廣泛分布于海南、貴州、廣西、云南等省區(qū)。艾納香葉片主要含揮發(fā)油(主要成分為左旋龍腦)，用作精制中藥艾片。具有抑菌、殺蟲、抗氧化、抗酪氨酸酶及抗腫瘤等多種藥理活性。艾納香揮發(fā)油已被成功應(yīng)用于“金喉健噴霧劑”、“咽立爽滴丸”等中成藥品種。因此，左旋龍腦是艾納香質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。

艾納香葉片中左旋龍腦含量目前主要采用氣相色譜(GC)法測定。如夏稷子等(中成藥，2011)、劉進(jìn)濤等(貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013)、王遠(yuǎn)輝等(現(xiàn)代食品科技，2014)、于福來等(中國現(xiàn)代中藥，2014)均采用氣相色譜法建立了艾納香葉片中左旋龍腦含量的測定方法，但所有的這些方法都存在操作相對繁瑣、試驗周期較長、需消耗化學(xué)試藥等缺點，因此有必要建立一種快速、簡單、無污染的測定方法。

近紅外光譜(NIR)主要是由C-H、N-H和O-H等含氫基團(tuán)的倍頻與組合頻的吸收譜帶組成。該譜區(qū)信號容易提取，信息量相對較豐富，絕大多數(shù)的物質(zhì)在近紅外區(qū)都有響應(yīng)。作為一種間接的分析技術(shù)其與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合可實現(xiàn)對樣品的快速、準(zhǔn)確、無損的定量分析。

目前尚未有關(guān)于應(yīng)用NIR技術(shù)定量測定艾納香葉粉中左旋龍腦含量的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種近紅外光譜快速測定艾納香葉粉中左旋龍腦含量的方法。該方法相比目前的氣相色譜(GC)測定法，具有快速、簡單、低成本、無污染等優(yōu)勢。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種近紅外光譜快速測定艾納香葉粉中左旋龍腦含量的方法，包括如下步驟：

S1.原始光譜數(shù)據(jù)的采集：收集特定批次艾納香葉樣品，預(yù)處理后采集近紅外光譜數(shù)據(jù)；

S2.參考值的測定：采用氣相色譜法測定艾納香葉粉中左旋龍腦含量；

S3.校正模型的建立：采用Kennard-Stone算法將所有艾納香葉粉樣品分為校正集和驗證集，將步驟S1采集的艾納香葉粉樣品的校正集近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，選擇最佳潛變量因子數(shù)，應(yīng)用組合的間隔偏最小二乘法(SiPLS)確定最佳的校正模型的波長范圍為4601～4894^-1，5504～6102cm^-1，建立左旋龍腦SiPLS模型；

S4.校正模型的驗證：利用驗證集樣品對校正模型進(jìn)行外部驗證，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ驮u價參數(shù)對校正模型進(jìn)行評價，計算預(yù)測值和真實值的相關(guān)性；

S5.未知樣品含量測定：利用驗證過的校正模型測定未知艾納香葉粉的左旋龍腦含量。

優(yōu)選地，步驟S1所述的近紅外光譜采用Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀，以旋轉(zhuǎn)積分球漫反射方式收集，掃描范圍4000～10000cm^-1，分辨率8cm^-1，掃描次數(shù)64次；以儀器內(nèi)部的空氣為背景記錄Log(1/R)，每個樣品掃描1次；所有光譜數(shù)據(jù)由Thermo Scientific Result軟件收集存檔。

優(yōu)選地，步驟S2所述的氣相色譜測定左旋龍腦含量的方法為：精密稱定艾納香葉片粉末(過20目篩)約2g，置于50mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯25mL，稱定重量，在40kHz的超聲條件下提取30min，放冷，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液待測。在以下色譜條件下進(jìn)行測定：HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(0.32mm×30m，0.25μm)；以80℃為起始溫度，保持2min，然后以5℃/min升溫至100℃，再以20℃/min升溫至200℃；進(jìn)樣口溫度為220℃；FID檢測器溫度為240℃；進(jìn)樣量0.6μL，分流比為9:1。每個樣品測定3次計算平均值；

優(yōu)選地，步驟S3所述最佳潛變量因子數(shù)是通過一交叉驗證法(LOO-CV)計算最少預(yù)測殘差平方和(PRESS)值來預(yù)測得到的。

優(yōu)選地，步驟S4所述校正模型評價依賴于校正均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證均方根誤差(RMSECV)、相關(guān)系數(shù)(R²)、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)等參數(shù)。

優(yōu)選地，采用Kennard-Stone算法按2:1將S1測定的所有艾納香葉粉樣品劃分為校正集和驗證集；其中校正集72個，驗證集36個。

通過留一交叉驗證法(LOO-CV)計算最少預(yù)測殘差平方和(PRESS)值來預(yù)測最佳潛變量因子數(shù)為6。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明采用漫反射NIR方法建立了艾納香葉粉中左旋龍腦的定量測定模型。該校正模型在組合的間隔偏最小二乘法(SiPLS)的波長選擇基礎(chǔ)上通過PLS方法構(gòu)建，通過GC法測定的左旋龍腦值和NIR預(yù)測值之間表現(xiàn)出較好的一致性。根據(jù)模型的參數(shù)，NIR技術(shù)可實現(xiàn)對艾納香中左旋龍腦含量的檢測。相比目前的氣相色譜測定法，該方法具有快速、簡單、低成本、無污染等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為左旋龍腦對照品和供試品GC色譜圖，其中a為對照品，b為供試品；1為左旋龍腦，2為水楊酸甲酯。

圖2為不同來源艾納香NIR原始光譜圖。

圖3為不同光譜預(yù)處理下左旋龍腦PRESS圖。

圖4為2D+SG(9)預(yù)處理的左旋龍腦定量測定模型下采用SiPLS算法的建模區(qū)間選擇。

圖5為SiPLS模型下左旋龍腦實測值和預(yù)測值相關(guān)性。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1

本發(fā)明所用樣品共計109份，2013年收集于海南、貴州和廣西，由龐玉新研究員鑒定為艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC.)。

表1 不同來源艾納香樣品信息

本發(fā)明涉及的儀器、軟件和試藥為：NIR分析：Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)配有InGaAs檢測器、積分球漫反射采樣系統(tǒng)、Thermo Scientific Result操作軟件；應(yīng)用Unscrambler 9.7軟件(CAMO軟件，挪威)進(jìn)行光譜預(yù)處理和模型計算；SiPLS算法工具包由Norgaard等(http://www.models.life.ku.dk/iToolbox)提供；其他方法是在Norgaard等算法基礎(chǔ)上由發(fā)明人修改編寫完成。GC分析：安捷倫7890A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器(FID)，安捷倫G4513A 16位自動進(jìn)樣器，Sartarius CPA225D電子分析天平，KQ-500DB型超聲儀，左旋龍腦對照品(阿法埃莎化學(xué)有限公司，純度>98％)，水楊酸甲酯(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度＞99.5％)，乙酸乙酯等試劑均為國產(chǎn)分析純。

原始光譜的采集：艾納香粉末的NIR光譜采用Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀，以旋轉(zhuǎn)積分球漫反射方式收集，掃描范圍4000～10000cm^-1，分辨率8cm^-1，掃描次數(shù)64次。以儀器內(nèi)部的空氣為背景記錄Log(1/R)，每個樣品掃描1次。所有光譜數(shù)據(jù)由Thermo Scientific Result軟件收集并存檔。

參考方法的建立及樣品左旋龍腦含量統(tǒng)計：精密稱定艾納香葉片粉末(過20目篩)約2g，置于50mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯25mL，稱定重量，在40kHz的超聲條件下提取30min，放冷，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液待測。在以下色譜條件下進(jìn)行測定：HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(0.32mm×30m，0.25μm)；以80℃為起始溫度，保持2min，然后以5℃/min升溫至100℃，再以20℃/min升溫至200℃；進(jìn)樣口溫度為220℃；FID檢測器溫度為240℃；進(jìn)樣量0.6μL，分流比為9:1。每個樣品測定3次計算平均值。在樣品測定之前進(jìn)行方法學(xué)考察(表2)，其數(shù)據(jù)說明所建立的方法準(zhǔn)確、有效。圖1給出含有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的GC色譜圖，樣品左旋龍腦保留時間和標(biāo)準(zhǔn)品一致。從表3可看出，所有109份艾納香樣品左旋龍腦含量范圍在0～13.8mg/g之間，平均為5.20mg/g，海南產(chǎn)樣品左旋龍腦含量略高于貴州產(chǎn)。

表2 GC方法學(xué)參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 艾納香樣品左旋龍腦含量統(tǒng)計

NIR光譜特征和離群值選擇：所有的109份樣品的原始光譜如圖2所示。呈現(xiàn)出明顯的光譜疊加和基線漂移現(xiàn)象，其中在二級倍頻區(qū)(FCOT，7100～4900cm^-1)和組合頻區(qū)(CR，4900～4000cm^-1)呈現(xiàn)較大的波動。其中有一個樣品遠(yuǎn)離其他光譜，將其作為離群值并剔除。根據(jù)Kennard-Stone(KS)算法，按2:1將數(shù)據(jù)集劃分為校正集和驗證集，其中校正集72個，驗證集36個。

光譜預(yù)處理:圖2表明平均光譜重疊嚴(yán)重，并伴有隨機(jī)噪音、基線漂移等干擾因素，需要用合理的光譜預(yù)處理方法消除各種噪聲和干擾因素，以提取近紅外光譜中待測對象的特征信息。本發(fā)明比較定量模型幾種光譜預(yù)處理各種方法的效果，如SNV、SG平滑、MSC以及SG結(jié)合光譜導(dǎo)數(shù)。表4為不同光譜預(yù)處理方法下左旋龍腦PLS模型的主要參數(shù)，根據(jù)交叉驗證的結(jié)果選擇合適的光譜預(yù)處理方法。以導(dǎo)數(shù)結(jié)合SG平滑法預(yù)處理光譜，左旋龍腦PLS模型的RMSEC和RMSECV最小，R²接近1。結(jié)果與圖3一致，表明通過導(dǎo)數(shù)結(jié)合SG平滑預(yù)處理光譜左旋龍腦模型較好。

表4 不同光譜預(yù)處理方法下左旋龍腦PLS模型的主要參數(shù)

注：Raw：原始光譜；MSC：多元散射校正法；SNV：標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量；SG：Savitzky–Golay平滑；1D：一階導(dǎo)數(shù)；2D：二階導(dǎo)數(shù)；RMSEC：校正均方根誤差；RMSECV：交叉驗證均方根誤差；R²：相關(guān)系數(shù)

最佳潛變量因子的確定：通過留一交叉驗證法(LOO-CV)計算最少PRESS值來預(yù)測最佳潛變量因子數(shù)。通常PRESS圖上第一個最小值被用作確定為最佳潛變量因子數(shù)。圖3為不同預(yù)處理下的潛變量因子和PRESS值。隨著潛變量因子數(shù)量增加，PERSS值變小。與其他預(yù)處理方法比較，導(dǎo)數(shù)組合SG平滑具明顯的優(yōu)勢，其PRESS值急劇下降至8個潛變量因子。而其他預(yù)處理方法不能夠有效的從疊加光譜的分離到有用的信息。

校正模型建模區(qū)間的選擇：應(yīng)用組合的間隔偏最小二乘法(SiPLS)選擇校正模型的波長范圍，將光譜集分為不同的區(qū)間，根據(jù)最小的均方根誤差(RMSE)確定最佳子區(qū)間及其組合。SiPLS算法的參數(shù)需要優(yōu)化包括子區(qū)數(shù)量和組合。發(fā)明人先前報道SiPLS算法的最佳參數(shù)為20個子區(qū)和3個子區(qū)的組合。因此，本發(fā)明通過6個潛變量因子的3，6和7三個子區(qū)組合建立最佳的左旋龍腦預(yù)測模型，即波長分布在4601～4894^-1，5504～6102cm^-1(如圖4所示)。

校正模型的建立和驗證：最佳模型評價依賴于RMSEC，RMSECV，預(yù)測均方差)RMSEP，R²等參數(shù)。表5所示，以二階導(dǎo)數(shù)結(jié)合SG平滑(2D+SG(9))的光譜預(yù)處理的左旋龍腦SiPLS模型最好。通過驗證集36份樣品對校正模型進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)驗證集的四分位RMSEP_0.25，RMSEP_0.50，RMSEP_0.75，RMSEP_1.0，分別為0.0532mg/g，0.0635mg/g，0.0629mg/g和0.0779mg/g，比較接近。驗證集的R²為0.9069(見圖5)。以上結(jié)果表明，左旋龍腦的SiPLS模型具較好的預(yù)測性。同時，圖5給出SiPLS模型下左旋龍腦實測值和預(yù)測值相關(guān)性，從圖可知預(yù)測值和實測值非常接近，呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性。

表5 不同光譜預(yù)處理方法下建立左旋龍腦SiPLS模型的主要參數(shù)

注：Raw：原始光譜；MSC：多元散射校正法；SNV：標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量；SG：Savitzky–Golay平滑；1D：一階導(dǎo)數(shù)；2D：二階導(dǎo)數(shù)；RMSEC：校正均方根誤差；RMSECV：交叉驗證均方根誤差；R2：相關(guān)系數(shù)

本發(fā)明采用漫反射NIR方法建立了艾納香中左旋龍腦的定量測定模型。該校正模型在組合的間隔偏最小二乘法(SiPLS)的波長選擇基礎(chǔ)上通過PLS方法構(gòu)建。通過GC法測定的左旋龍腦值和NIR預(yù)測值之間表現(xiàn)出較好的一致性。根據(jù)模型的參數(shù)，NIR技術(shù)可實現(xiàn)對艾納香中左旋龍腦含量的檢測。該方法具有快速、簡單、低成本、無污染等優(yōu)勢。