本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

光學(xué)橢偏生物傳感器是一種檢測和分析生物分子的技術(shù)，它是將多元蛋白芯片技術(shù)、微流道技術(shù)和高分辨率的橢偏光學(xué)顯微鏡成像技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而成的新型無標(biāo)記、高通量自動檢測技術(shù)，其不存在點(diǎn)樣質(zhì)量帶來的定量困難和基于標(biāo)記方法的限制等問題。

到目前為止，光學(xué)橢偏生物傳感器已被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括腫瘤標(biāo)志物的檢測、乙肝檢測、病毒檢測等。雖然光學(xué)橢偏生物傳感器已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，但是在小分子和低濃度目標(biāo)分子的探測中仍然存在靈敏度低的缺陷，因此被大大限制了使用范圍，這也是光學(xué)無標(biāo)記生物傳感器普遍存在的現(xiàn)象。

針對這個(gè)問題，一些方法和技術(shù)被用于提高光學(xué)橢偏生物傳感器的靈敏度。在目前的研究中，主要分為兩大類：

一類是對待測目標(biāo)分子進(jìn)行間接檢測，即對待測分子進(jìn)行標(biāo)記或者采用夾心法等方式來達(dá)到信號放大的目的，例如抗體信號放大，納米粒子和熒光標(biāo)記等方法。然而，利用抗抗體進(jìn)行信號放大，提高靈敏度有限，一般在一個(gè)量級左右；利用納米粒子或熒光標(biāo)記可顯著提高靈敏度，一般會使信號提高幾個(gè)數(shù)量級，但是標(biāo)記帶來的負(fù)面效應(yīng)是待測物尤其是針對蛋白質(zhì)的檢測，會使其活性降低，從而影響檢測的準(zhǔn)確性，并且上述方法步驟繁瑣使得操作非常復(fù)雜，對操作人員技術(shù)技能要求較高。

另一類是改善或構(gòu)建新原理光學(xué)橢偏生物傳感器對待測物進(jìn)行直接檢測。在過去的研究中，各種新型檢測基底已經(jīng)被研究用來提高無標(biāo)記光學(xué)生物傳感器的靈敏度，例如，利用多孔硅或納米粒子表面修飾等增加傳感器基底表面積，進(jìn)而增加待測物的數(shù)量，該方法只能將靈敏度提高幾倍，小于一個(gè)數(shù)量級。利用納米金屬材料特有的局部等離子體共振特性實(shí)現(xiàn)信號增強(qiáng)，在光學(xué)生物傳感器中被廣泛應(yīng)用，例如納米金屬膜、納米粒子、金屬納米結(jié)構(gòu)材料，金屬與無機(jī)材料構(gòu)建的納米復(fù)合結(jié)構(gòu)等等。上述工作實(shí)現(xiàn)信號增強(qiáng)的機(jī)理都是基于金屬納米粒子特殊的光學(xué)特性-局部表面等離子共振，局部表面等離子共振是入射光激發(fā)金屬納米粒子離子表面自由電子發(fā)生集體震蕩，當(dāng)入射光頻率與自由電子集體震蕩頻率相等時(shí)達(dá)到共振。局部等離子共振與金屬納米粒子的組成、尺寸、形狀、粒子間距和周圍介質(zhì)折射率等因素有關(guān)，并且對上述因素的微小變化極其敏感，因而可以用于光學(xué)檢測信號的增強(qiáng)。上述新型基底的制備方法主要采熱蒸鍍、磁控濺射、光刻、電沉積等方式，費(fèi)用昂貴，操作繁雜費(fèi)時(shí)，最重要的是，橢偏生物傳感器的高通量檢測應(yīng)用要求基底表面大面積均勻性(至少平方厘米量級)。而金屬膜層基底可實(shí)現(xiàn)大面積均勻，但靈敏度較低。已有的金屬納米結(jié)構(gòu)可獲得較高靈敏度，但無法實(shí)現(xiàn)大面積均勻性，達(dá)不到光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測基底多樣本檢測的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法，其包括：提供一基片；對基片進(jìn)行表面修飾；在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底；采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，對基片進(jìn)行表面修飾的具體方法包括：利用氨基硅烷或巰基硅烷的乙醇溶液對基片浸泡預(yù)定時(shí)間。

進(jìn)一步地，利用氨基硅烷或巰基硅烷的乙醇溶液對基片浸泡預(yù)定時(shí)間之前，對基片進(jìn)行表面修飾的具體方法還包括：利用去離子水清洗基片；將清洗后的基片置于濃硫酸和雙氧水按預(yù)定體積比混合的混合溶液中浸泡預(yù)定時(shí)間；依次利用去離子水、乙醇清洗經(jīng)浸泡后的基片；利用氨基硅烷或巰基硅烷的乙醇溶液對基片浸泡預(yù)定時(shí)間之后，對基片進(jìn)行表面修飾的具體方法還包括：依次利用無水乙醇、去離子水清洗基片；利用氮?dú)獯蹈苫?/p>

進(jìn)一步地，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：將經(jīng)表面修飾后的基片按照預(yù)定數(shù)量浸入金屬納米粒子水溶液中反應(yīng)預(yù)定時(shí)間，使基片的表面上自組裝形成單層金屬納米粒子膜層；對所述單層金屬納米粒子膜層進(jìn)行表面修飾后，再浸入金屬納米粒子水溶液中反應(yīng)預(yù)定時(shí)間，使所述基片的表面上自組裝形成雙層金屬納米粒子膜層；如此重復(fù)，以在所述基片表面上自組裝形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層。

進(jìn)一步地，在下一次將經(jīng)表面修飾后的基片侵入金屬納米粒子水溶液中反應(yīng)預(yù)定時(shí)間之前，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法還包括：清洗并吹干基片；將基片浸入富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的水溶液中反應(yīng)預(yù)定時(shí)間；再次清洗并吹干基片。

進(jìn)一步地，所述金屬納米粒子膜層采用金或者銀或者鉑形成。

進(jìn)一步地，所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子為水溶性殼聚糖或水溶性聚賴氨酸。

進(jìn)一步地，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用含有Anti-CA19-9或者Anti-HAS或者Anti-PSA的磷酸鹽緩沖溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)預(yù)定時(shí)間，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，采用含有Anti-CA19-9或者Anti-HAS或者Anti-PSA的磷酸鹽緩沖溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)預(yù)定時(shí)間，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：清洗并吹干所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，所述基片為單晶硅基片或者表面覆蓋有二氧化硅膜層的單晶硅基片。

本發(fā)明還提供了一種利用上述的制備方法制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

本發(fā)明的有益效果：根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，其比表面積大，生物分子容易結(jié)合上去，且結(jié)合的生物分子數(shù)量多，同時(shí)橢偏光學(xué)與金納米粒子耦合，利用金納米粒子的局部等離子體共振效應(yīng)，從而極大的提高了生物分子檢測過程中對目標(biāo)分子的檢測靈敏度，可以用于直接對目標(biāo)小分子或者低濃度分子的檢測，極大的提高了待檢測分子的準(zhǔn)確性。

附圖說明

通過結(jié)合附圖進(jìn)行的以下描述，本發(fā)明的實(shí)施例的上述和其它方面、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚，附圖中：

圖1是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例的制備方法制備的金納米粒子單膜層修飾的生物傳感器檢測基底的掃描電子顯微鏡圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖4是根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明的第四實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明的第四實(shí)施例的制備方法制備的金納米粒子單膜層修飾的生物傳感器檢測基底的掃描電子顯微鏡圖；

圖7是根據(jù)本發(fā)明的第五實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖8是根據(jù)本發(fā)明的第六實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖；

圖9是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例、第四實(shí)施例的制備方法制備出的光學(xué)橢偏傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器以及傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器檢測腫瘤標(biāo)志物CA19-9的結(jié)果圖；

圖10是根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施例、第五實(shí)施例的制備方法制備出的光學(xué)橢偏傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器以及傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器檢測人血清白蛋白HSA的結(jié)果圖；

圖11是根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例、第六實(shí)施例的制備方法制備出的光學(xué)橢偏傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器以及傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器檢測腫瘤標(biāo)志物PSA的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下，將參照附圖來詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。然而，可以以許多不同的形式來實(shí)施本發(fā)明，并且本發(fā)明不應(yīng)該被解釋為限制于這里闡述的具體實(shí)施例。相反，提供這些實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的各種實(shí)施例和適合于特定預(yù)期應(yīng)用的各種修改。

<第一實(shí)施例>

圖1是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖1，在步驟S110中，提供一基片。這里，該基片為單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如，基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S120中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)。其中，在氨基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，氨基硅烷的體積百分比濃度為5％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的另一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約30分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的氨基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫詡溆谩?/p>

在步驟S130中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約18小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?，以形成生物傳感器檢測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為10nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為兩層或更多層。

在步驟S140中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約30分鐘，即采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約30分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約30分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例的制備方法制備的金納米粒子單膜層修飾的生物傳感器檢測基底的掃描電子顯微鏡圖。

參照圖2，可以看出，金納米粒子尺寸均勻，在硅基片表面呈單分散排部。

<第二實(shí)施例>

圖3是根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖3，在步驟S210中，提供一基片。這里，該基片為表面覆蓋有厚度約為2nm的二氧化硅膜層的單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如該基片也可以為表面覆蓋有厚度約為2nm的二氧化硅膜層的其他合適材料的基片，或者，基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S220中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)。其中，在巰基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，巰基硅烷的體積百分比濃度為10％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約40分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的巰基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫?，以備用?/p>

在步驟S230中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約12小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈桑孕纬缮飩鞲衅鳈z測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為5nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為兩層或更多層。

在步驟S240中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約20分鐘，即采用含有Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約20分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約20分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

<第三實(shí)施例>

圖4是根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖4，在步驟S310中，提供一基片。這里，該基片為表面覆蓋有厚度約為3nm的二氧化硅膜層的單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如該基片也可以為表面覆蓋有厚度約為2nm的二氧化硅膜層的其他合適材料的基片，或者，基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S320中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)。其中，在氨基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，氨基硅烷的體積百分比濃度為10％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約20分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的氨基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫詡溆谩?/p>

在步驟S330中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約24小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?，以形成生物傳感器檢測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為15nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為兩層或更多層。

在步驟S340中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約40分鐘，即采用含有Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約40分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-HSA(其為人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約40分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

<第四實(shí)施例>

圖5是根據(jù)本發(fā)明的第四實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖5，在步驟S410中，提供一基片。這里，該基片為單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如，基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S420中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)。其中，在氨基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，氨基硅烷的體積百分比濃度為5％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約30分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入氨基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約2小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的氨基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫?，以備用?/p>

在步驟S430中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約20小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；接著，利用氮?dú)獯蹈?；接著，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約24小時(shí)，使表面形成一層金納米粒子膜層的基片的表面自組裝形成第二層金納米粒子膜層；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?，以形成具有兩層金納米粒子膜層生物傳感器檢測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為12nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為一層或更多層；其中，重復(fù)上述金納米離子膜層的形成過程，可以形成更多層金納米粒子膜層。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施例，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約24小時(shí)之前，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法還包括：首先，將表面形成一層金納米粒子膜的基片浸入富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的水溶液中反應(yīng)約8小時(shí)；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?。這里，所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子為水溶性殼聚糖；并且所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的濃度為5mg/mL，但本發(fā)明均不限制于此。

在步驟S440中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約40分鐘，即采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約40分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-CA19-9(其為腫瘤標(biāo)志物CA19-9的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約40分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的第四實(shí)施例的制備方法制備的金納米粒子雙膜層修飾的生物傳感器檢測基底的掃描電子顯微鏡圖。

參照圖6，可以看出，金納米粒子雙膜層中的金納米粒子在硅基片表面上自組裝均勻，符合橢偏成像生物傳感器多樣本檢測的要求，且與金納米粒子單層膜對比，金納米粒子雙膜層中的金納米粒子之間的距離更小。

<第五實(shí)施例>

圖7是根據(jù)本發(fā)明的第五實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖7，在步驟S510中，提供一基片。這里，該基片為單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如，基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S520中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)。其中，在巰基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，巰基硅烷的體積百分比濃度為2％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約20分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約3小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的巰基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫詡溆谩?/p>

在步驟S530中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約24小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；接著，利用氮?dú)獯蹈桑唤又?，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約12小時(shí)，使表面形成一層金納米粒子膜層的基片的表面自組裝形成第二層金納米粒子膜層；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?，以形成具有兩層金納米粒子膜層生物傳感器檢測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為15nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為一層或更多層；其中，重復(fù)上述金納米離子膜層的形成過程，可以形成更多層金納米粒子膜層。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施例，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約12小時(shí)之前，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法還包括：首先，將表面形成一層金納米粒子膜的基片浸入富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的水溶液中反應(yīng)約4小時(shí)；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?。這里，所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子為聚賴氨酸；并且所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的濃度為20mg/mL，但本發(fā)明均不限制于此。

在步驟S540中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用含有Anti-HSA(人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約20分鐘，即采用含有Anti-HSA(人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約20分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-HSA(人血清白蛋白HSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約20分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

<第六實(shí)施例>

圖8是根據(jù)本發(fā)明的第六實(shí)施例的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的制備方法的流程圖。

參照圖8，在步驟S610中，提供一基片。這里，該基片為表面覆蓋厚度約1nm的二氧化硅膜層的單晶硅基片，但本發(fā)明并不限制于此，例如該基片也可以為表面覆蓋有厚度約為2nm的二氧化硅膜層的其他合適材料的基片，或者基片還可以是由金等金屬材料制成。

在步驟S620中，對基片進(jìn)行表面修飾。

這里，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法包括：將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)。其中，在巰基硅烷的乙醇溶液中，優(yōu)選地，巰基硅烷的體積百分比濃度為10％，但本發(fā)明并不限制于此。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)之前，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，用去離子水清洗基片；接著，將清洗后的基片置于濃硫酸與雙氧水按約3：1的體積比混合的混合溶液中浸泡約40分鐘，使基片表面帶羥基基團(tuán)；接著，取出基片并用去離子水清洗，以去除基片表面多余的濃硫酸和雙氧水分子；然后，用乙醇清洗基片，以去除基片表面的水分子。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，在將基片浸入巰基硅烷的乙醇溶液中反應(yīng)約1小時(shí)之后，對基片進(jìn)行表面的修飾的具體方法還包括：首先，取出基片用無水乙醇清洗，以去除基片表面多余的巰基硅烷分子；接著，用去離子水清洗基片；最后，利用氮?dú)獯蹈苫?，以備用?/p>

在步驟S630中，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層，以形成生物傳感器檢測基底。

這里，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法包括：首先，將經(jīng)表面修飾后的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約12小時(shí)，使基片的表面自組裝形成一層金納米粒子膜層；接著，將自組裝形成金納米粒子膜層的基片取出并清洗；接著，利用氮?dú)獯蹈?；接著，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約18小時(shí)，使表面形成一層金納米粒子膜層的基片的表面自組裝形成第二層金納米粒子膜層；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈桑孕纬删哂袃蓪咏鸺{米粒子膜層生物傳感器檢測基底。此處，所述金納米粒子為粒徑約為5nm的納米金。在本發(fā)明中，并不對形成納米粒子水溶液的金屬納米粒子的種類作具體的限定。并且，在本發(fā)明中，也不對形成的金納米粒子膜層的層數(shù)量作限定，例如也可以為一層或更多層；其中，重復(fù)上述金納米離子膜層的形成過程，可以形成更多層金納米粒子膜層。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施例，再次將表面形成一層金納米粒子膜層的基片浸入金納米粒子水溶液中反應(yīng)約18小時(shí)之前，在經(jīng)表面修飾后的基片的表面上形成預(yù)定數(shù)量層金屬納米粒子膜層的具體方法還包括：首先，將表面形成一層金納米粒子膜的基片浸入富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的水溶液中反應(yīng)約6小時(shí)；接著，取出基片并清洗；最后，利用氮?dú)獯蹈?。這里，所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子為水溶性殼聚糖；并且所述富含氨基基團(tuán)的水溶性分子的濃度為10mg/mL，但本發(fā)明均不限制于此。

在步驟S640中，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

這里，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法包括：采用含有Anti-PSA(腫瘤標(biāo)志物PSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約30分鐘，即采用含有Anti-PSA(腫瘤標(biāo)志物PSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)約30分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，采用含有Anti-PSA(腫瘤標(biāo)志物PSA的抗體)的PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)孵育所述生物傳感器檢測基底約30分鐘，以得到局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器之后，采用待檢測抗原的抗體溶液對所述生物傳感器檢測基底進(jìn)行反應(yīng)的方法還包括：首先，清洗所述局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，以去除其表面未反應(yīng)的抗體分子；接著，利用氮?dú)獯蹈伤鼍植康入x子體光學(xué)橢偏生物傳感器。

需要說明的是，上述各實(shí)施例以金納米粒子膜層作為一種金屬納米粒子膜層的示例，但本發(fā)明并不限制于此，例如還可以是銀納米粒子膜層、鉑納米粒子膜層等。

此外，上述提到的Anti-CA19-9或者Anti-HAS或者Anti-PSA只是舉例說明，該方法適用所有基于特異性結(jié)合的生化分子檢測，包括蛋白、核酸、適配體、分子化合物等等。

分別采用第一實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、第四實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器和傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器對目標(biāo)分子腫瘤標(biāo)志物CA19-9(所用分子量：47KD)進(jìn)行檢測。具體過程為：將各傳感器用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(BSA溶液)孵育30分鐘進(jìn)行封閉，然后用PBS溶液徹底清洗去除各傳感器表面未反應(yīng)的BSA溶液，接著將清洗后的傳感器用待檢測目標(biāo)分子CA19-9溶液孵育30分鐘進(jìn)行特異性反應(yīng)，之后清洗并氮?dú)獯蹈筛鱾鞲衅?，之后利用各光學(xué)橢偏傳感器進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果如圖9所示，圖中GNPs-1代表第一實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，GNPs-2代表第四實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，NH2代表傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器，CHO代表傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器，虛線以上為有效監(jiān)測信號。從圖9中可以看出，第一實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為0.1U/mL，第四實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為0.01U/mL，而傳統(tǒng)的光學(xué)橢偏成像傳感器(表面帶氨基基團(tuán)和表面帶醛基基團(tuán))的檢測極限為10U/mL。

分別采用第二實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、第五實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏傳感器和傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏生物傳感器對目標(biāo)分子人血清白蛋白HSA(所用分子量：6.7KD)進(jìn)行檢測。具體過程為：將各傳感器用BSA溶液孵育30分鐘進(jìn)行封閉，然后用PBS溶液徹底清洗去除各傳感器表面未反應(yīng)的BSA溶液，接著將清洗后的各傳感器用待檢測目標(biāo)分子HSA溶液孵育30分鐘進(jìn)行特異性反應(yīng)，之后清洗并氮?dú)獯蹈筛鱾鞲衅?，之后利用各光學(xué)橢偏傳感器進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果如圖10所示，圖中GNPs-1代表第二實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，GNPs-2代表第五實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，NH2代表傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏生物傳感器，CHO代表傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏生物傳感器，虛線以上為有效監(jiān)測信號。從圖10中可以看出，第二實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為10ng/mL，第五實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為1ng/mL，而傳統(tǒng)的光學(xué)橢偏成像傳感器(表面帶氨基基團(tuán)和表面帶醛基基團(tuán))的檢測極限為1μg/mL。

分別采用第三實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、第六實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器、傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏成像傳感器和傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏生物傳感器對目標(biāo)分子腫瘤標(biāo)志物PSA(所用分子量：3.4KD)進(jìn)行檢測。具體過程為：將各傳感器用BSA溶液孵育30分鐘進(jìn)行封閉，然后用PBS溶液徹底清洗去除各傳感器表面未反應(yīng)的BSA溶液，接著將清洗后的各傳感器用待檢測目標(biāo)分子PSA溶液孵育30分鐘進(jìn)行特異性反應(yīng)，清洗并氮?dú)獯蹈筛鱾鞲衅?，之后利用各光學(xué)橢偏生物傳感器進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果如圖11所示，圖中GNPs-1代表第三實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，GNPs-2代表第六實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，NH2代表傳統(tǒng)的表面帶氨基基團(tuán)的光學(xué)橢偏生物傳感器，CHO代表傳統(tǒng)的表面帶醛基基團(tuán)的光學(xué)橢偏成像傳感器，虛線以上為有效監(jiān)測信號。從圖11中可以看出，第三實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為4ng/mL，第六實(shí)施例制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器的檢測極限為0.4ng/mL，而傳統(tǒng)的光學(xué)橢偏成像傳感器(表面帶氨基基團(tuán)和表面帶醛基基團(tuán))的檢測極限為400ng/mL。

綜上所述，根據(jù)本發(fā)明的各實(shí)施例的制備方法制備的局部等離子體光學(xué)橢偏生物傳感器，其比表面積大，生物分子容易結(jié)合上去，且結(jié)合的生物分子數(shù)量多，同時(shí)橢偏光學(xué)與金納米粒子耦合，利用金納米粒子的局部等離子體共振效應(yīng)，從而極大的提高了生物分子檢測過程中對目標(biāo)分子的檢測靈敏度，可以用于直接對目標(biāo)小分子或者低濃度分子的檢測，極大的提高了待檢測分子的準(zhǔn)確性。

雖然已經(jīng)參照特定實(shí)施例示出并描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解：在不脫離由權(quán)利要求及其等同物限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可在此進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種變化。