本發(fā)明屬于顯微成像領(lǐng)域，具體地，涉及一種可尋址的樣品板以及該樣品板在單細(xì)胞顯微成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

迄今為止，人們對(duì)金屬抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)理研究還不夠深入。而且分子水平上研究的藥物與生物靶分子的相互作用機(jī)理并不能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。因此藥物在細(xì)胞內(nèi)的空間分布的研究對(duì)深入理解抗腫瘤藥物的作用機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化它們的分子設(shè)計(jì)具有非常重要的意義，這也是藥物研發(fā)領(lǐng)域所面臨的最具挑戰(zhàn)性的課題之一。

目前，研究藥物在細(xì)胞內(nèi)分布的主要方法有熒光標(biāo)記成像法和質(zhì)譜成像法。熒光標(biāo)記法具有特異性好，熒光效率高，樣品消耗量小等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)要求藥物本身含有在特定波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的基團(tuán)或者需要在藥物分子上添加熒光基團(tuán)；而這樣會(huì)使藥物合成過(guò)程變得更復(fù)雜，添加的熒光基團(tuán)有可能會(huì)改變藥物的生物活性，在細(xì)胞的復(fù)雜環(huán)境內(nèi)容易發(fā)生熒光淬滅等。二次離子質(zhì)譜法靈敏度高、空間分辨率高，并且可以在一次數(shù)據(jù)采集中得到物質(zhì)的化學(xué)信息和空間分布信息。但是細(xì)胞環(huán)境復(fù)雜，基底信號(hào)強(qiáng)，有時(shí)難以找到特異性的質(zhì)譜片段。對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行熒光形貌成像分析(不需要標(biāo)記藥物分子)和針對(duì)藥物分子的質(zhì)譜成像分析可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)形貌成像與化學(xué)成分成像直觀對(duì)應(yīng)，更清楚地了解藥物在細(xì)胞中的分布，將能夠?yàn)樯钊胙芯克幬锏淖饔脵C(jī)制提供有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝過(guò)程的研究具有很重要的意義。

但是，在進(jìn)行熒光形貌成像和質(zhì)譜成分成像聯(lián)用分析時(shí)，一般很難實(shí)現(xiàn) 對(duì)納米尺度下同一微區(qū)、甚至同一個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行分析，導(dǎo)致形貌分析和成分分析的結(jié)果不能一一對(duì)應(yīng)，削弱了聯(lián)用分析的科學(xué)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服目前形貌成像和成分成像聯(lián)用分析時(shí)存在的單細(xì)胞定位困難的技術(shù)難題，提供一種可以簡(jiǎn)單快捷地在大面積內(nèi)尋找指定細(xì)胞的可尋址的樣品板及該樣品板在單細(xì)胞顯微成像中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種可尋址的樣品板，該樣品板上刻有N個(gè)n×m的陣列，所述陣列中的單元格的大小為100μm²-4×10⁴μm²。

第二方面，本發(fā)明提供了一種單細(xì)胞顯微成像的方法，該方法包括：將細(xì)胞固定在第一方面所述的樣品板上，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，將同一單元格中的細(xì)胞分別進(jìn)行熒光成像分析和質(zhì)譜成像分析。

第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的樣品板在單細(xì)胞顯微成像中的應(yīng)用。

將本發(fā)明的可尋址的樣品板應(yīng)用于單細(xì)胞顯微成像分析時(shí)，有利于在大面積范圍內(nèi)準(zhǔn)確清晰地定位同一個(gè)細(xì)胞，降低了多種分析儀器聯(lián)用時(shí)定位單細(xì)胞的難度。此外，本發(fā)明的樣品板不會(huì)妨礙細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，因此不會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為按照實(shí)施例1的方法制得的可尋址的硅片樣品板激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝的圖片(圖1A)和二次離子質(zhì)譜儀上的攝像機(jī)拍攝的圖片(圖1B)；

圖2為實(shí)施例所用釕化合物1(圖2A)和釕化合物2(圖2B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

圖3為實(shí)施例3中二次離子質(zhì)譜(SIMS)成像分析檢測(cè)到的釕化合物2(m/z 598，C₂₆H₂₈ClFN₅O₂Ru⁺)標(biāo)準(zhǔn)樣品及在細(xì)胞膜表面的質(zhì)譜圖(圖3A)和細(xì)胞核內(nèi)釕元素(m/z 102，¹⁰²Ru⁺)的質(zhì)譜圖(圖3B)；

圖4為按照實(shí)施例2的方法制得的樣品板上化合物1孵育的MCF-7細(xì)胞細(xì)胞膜紅色熒光染料DiI染色熒光圖、m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，細(xì)胞膜組分磷脂酰膽堿分子片段)空間分布圖、m/z 240(C₈H₁₄N₂Ru⁺)空間分布圖和三者的疊加圖；細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料Hoechst33342染色熒光圖、m/z 81(C₅H₅O⁺，脫氧核糖分子片段)空間分布圖、m/z 102(釕元素，¹⁰²Ru⁺)空間分布圖和三者的疊加圖；

圖5為按照實(shí)施例3的方法制得的樣品板上化合物2孵育MCF-7細(xì)胞細(xì)胞膜紅色熒光染料DiI染色熒光圖、m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，細(xì)胞膜組分磷脂酰膽堿分子片段)空間分布圖、m/z 598(C₂₆H₂₈ClFN₅O₂Ru⁺)空間分布圖和三者的疊加圖；細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料Hoechst33342染色熒光圖、m/z 81(C₅H₅O⁺、脫氧核糖分子片段)空間分布圖、m/z 102(釕元素，¹⁰²Ru⁺)空間分布圖和三者的疊加圖；

圖6為按照實(shí)施例5的方法制得的樣品板上化合物1孵育的HeLa細(xì)胞顯微鏡明場(chǎng)圖、m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，細(xì)胞膜組分磷脂酰膽堿分子片段)空間分布圖及兩者的疊加圖；細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料Hoechst33342染色熒光圖、m/z 81(C₅H₅O⁺，脫氧核糖分子片段)空間分布圖及兩者的疊加圖；

圖7為根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的樣品板示意圖。

附圖標(biāo)記說(shuō)明

u 單元格

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

如圖7所示，本發(fā)明提供的可尋址的樣品板上刻有N個(gè)n×m的陣列，所述陣列中的單元格u的大小為100μm²-4×10⁴μm²。

優(yōu)選地，N＝1-10且各個(gè)陣列相應(yīng)標(biāo)記有不同的編號(hào)(例如，A、B、C、D…或I、II、III、IV…)。對(duì)相鄰陣列之間的間距沒(méi)有特別的限制，可以為0.3-1mm。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，n＝4-20、m＝4-20且每個(gè)單元格u對(duì)應(yīng)有不同的編號(hào)(如圖7所示，單元格的編號(hào)可以設(shè)置在各個(gè)陣列的側(cè)邊)。n和m可以為相同或不同的整數(shù)，但優(yōu)選n＝m。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述單元格u為尺寸為10×10μm²-200×200μm²的正方形和/或直徑為10-200μm的圓形，更優(yōu)選為所述正方形。對(duì)所述單元格u之間的間距沒(méi)有特別的要求，可以為0-100μm。

本發(fā)明中，所述樣品板的尺寸可以根據(jù)實(shí)際所進(jìn)行的分析進(jìn)行選擇，優(yōu)選為0.5×0.5cm²-3×3cm²。對(duì)所述樣品板的厚度沒(méi)有特別的限制，只要滿足顯微鏡成像的要求即可，例如，對(duì)于透光材料(如玻璃)，厚度一般小于170μm；而對(duì)于不透光材料(如硅片)，厚度沒(méi)有要求。

本發(fā)明中，為了進(jìn)一步保證細(xì)胞的正常貼壁和生長(zhǎng)，所述樣品板上的刻線的寬度優(yōu)選為1-10μm，深度優(yōu)選為1-10μm。寬度和深度可以相同或不同。

本發(fā)明中，所述樣品板可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的材質(zhì)制得，優(yōu)選情況 下，所述樣品板的材質(zhì)為單晶硅或玻璃。

根據(jù)本發(fā)明的一種特別優(yōu)選實(shí)施方式，1cm²的硅片樣品板上刻有4個(gè)4×4的陣列，其中單元格的大小為200×200μm²(正方形)。

本發(fā)明的樣品板可以通過(guò)EBL電子束曝光技術(shù)寫出版上圖形，腐蝕鉻膜制成鉻模版。再用鉻模版進(jìn)行紫外曝光，做出有圖形的光刻膠掩膜。最后在掩膜的保護(hù)下對(duì)基板(如單晶硅或玻璃)進(jìn)行ICP刻蝕后得到帶刻度的樣品板。光刻蝕和ICP刻蝕的具體操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。

本發(fā)明提供的單細(xì)胞顯微成像的方法包括：將細(xì)胞固定在上述樣品板上，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，將同一單元格中的細(xì)胞分別進(jìn)行熒光成像分析和質(zhì)譜成像分析。所述熒光成像分析可以為常規(guī)的熒光形貌成像分析，優(yōu)選為激光掃描共聚焦熒光成像分析。所述質(zhì)譜成像分析可以為常規(guī)的質(zhì)譜成分成像分析，優(yōu)選為二次離子質(zhì)譜成像分析。

根據(jù)本發(fā)明，對(duì)細(xì)胞在樣品板上的密度沒(méi)有特別的要求，優(yōu)選地，細(xì)胞在所述樣品板上的密度優(yōu)選為10⁴-10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²。

根據(jù)本發(fā)明，對(duì)所述細(xì)胞沒(méi)有特別的要求，可以為各種類型的正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞(通常直徑小于100μm)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為直徑在20-80μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，固定細(xì)胞的方法可以為：將用胰酶消化后的細(xì)胞與樣品板接觸，靜置培養(yǎng)一段時(shí)間即可(溫度為37℃，5％CO₂，時(shí)間為24h)。

根據(jù)本發(fā)明，對(duì)所述熒光染料沒(méi)有特別的限制，可以為能夠指示細(xì)胞和亞細(xì)胞器形貌的熒光染料。優(yōu)選地，所述熒光染料為能夠特異性指示亞細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的熒光染料。更優(yōu)選地，所述熒光染料為細(xì)胞膜紅色熒光染料DiI和細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料Hoechst 33342。

根據(jù)本發(fā)明，對(duì)所述二次離子質(zhì)譜成像分析中離子的選擇沒(méi)有特別的要 求，只要能夠特征性地指示亞細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)即可，優(yōu)選情況下，所述二次離子為m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，細(xì)胞膜組分磷脂酰膽堿分子片段)及m/z81(C₅H₅O⁺，脫氧核糖分子片段)。

為了方便操作，本發(fā)明的方法還可以包括將標(biāo)記后的樣品進(jìn)行冷凍干燥?？梢圆捎靡旱賰?，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)保持活細(xì)胞狀態(tài)時(shí)的分布，繼而通過(guò)冷凍干燥機(jī)去除水分。

本發(fā)明中，所述熒光成像分析和質(zhì)譜成像分析(如激光掃描共聚焦熒光成像分析和二次離子質(zhì)譜成像分析)的具體操作步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。

本發(fā)明還提供了上述本發(fā)明的樣品板在單細(xì)胞顯微成像中的應(yīng)用。

以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

以下實(shí)施例中，人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞所用培養(yǎng)基的組成是：DMEM(高糖)中添加抗生素(100U/mL的青霉素和100mg/mL的鏈霉素)和10％的胎牛血清(FBS)，其中，DMEM和FBS均購(gòu)自HyClone公司；NH₄COOCH₃緩沖液150mM(pH 7.4)；消化細(xì)胞使用的胰酶(含0.25％的EDTA)購(gòu)自Gibco公司，其貨號(hào)為15050-065；雙面剖光的硅片(1×1cm²)購(gòu)自北京中科科儀股份有限公司，硅片上圖形模版由EBL電子束曝光技術(shù)(德國(guó)SUSS-MA6)光刻而成，ICP硅刻蝕使用英國(guó)牛津公司的ICP180；細(xì)胞膜紅色熒光染料DiI購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料Hoechst33342購(gòu)自Sigma公司。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的可尋址的樣品板的制備與表征。

(1)鉻模版的制備

用EBL電子束曝光技術(shù)寫出如圖7所示的板上圖形(A、B、C、D、1、2、3、4，4×4陣列，每個(gè)單元格的大小為50×50μm²)，腐蝕鉻膜制成鉻模版。

(2)樣品板的制備

用上述步驟(1)得到的模版進(jìn)行紫外曝光，做出有圖形的光刻膠掩膜。在掩膜的保護(hù)下對(duì)1×1cm²雙面剖光的硅片進(jìn)行ICP硅刻蝕，刻蝕所需要的寬度和深度均為3μm。用5mL丙酮超聲清洗三次，氮?dú)獯蹈傻玫綐悠钒濉?/p>

(3)樣品板的表征

在顯微鏡(×100)下觀察得到的樣品板，圖像與圖7基本相同。

實(shí)施例2

本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明實(shí)施例1制得的樣品板用于SIMS-Confocal聯(lián)用成像研究釕化合物1(結(jié)構(gòu)式如圖2A所示)在MCF-7細(xì)胞內(nèi)空間分布的方法。

(1)MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)與凍干

將樣品板置于激光共聚焦用的細(xì)胞培養(yǎng)皿底部中央，消化好的MCF-7細(xì)胞以10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²濃度于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，加入含有100μM釕化合物1的培養(yǎng)基后再孵育24h，除去培養(yǎng)基，用含有1μg/mL的Hoechst 33342的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中孵育10min。除去該培養(yǎng)基，再用含有5μM細(xì)胞膜紅色熒光染料的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min。除去培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)濃度為150mM的NH₄COOCH₃(pH 7.4)緩沖液洗滌三次，每次30s。將樣品板快速放入液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中(-60℃)冷凍干燥12h，并逐漸升至室溫，得到待檢樣品板。

(2)激光掃描共聚焦熒光成像分析

將制備的待檢樣品板的細(xì)胞貼壁面朝下，置于激光共聚焦用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將該培養(yǎng)皿移至倒置熒光顯微鏡(FV1000-IX81，OLYMPUS)上，用 汞燈或Hoechst 33342激發(fā)光405nm的反射光尋找樣品板上的微刻度標(biāo)記及相應(yīng)標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的單細(xì)胞。切換為熒光成像模式對(duì)選定區(qū)域(C23)單元格內(nèi)的單細(xì)胞進(jìn)行激光掃描共聚焦熒光成像分析，得到該細(xì)胞在細(xì)胞膜和細(xì)胞核區(qū)域的熒光成像圖。

(3)二次離子質(zhì)譜成像分析

將待檢樣品板置于二次離子質(zhì)譜儀的樣品室，使用質(zhì)譜儀器上內(nèi)置的攝像機(jī)找到該樣品板上特定區(qū)域(C23)內(nèi)的同一個(gè)單細(xì)胞，在下述實(shí)驗(yàn)條件下采集該細(xì)胞的二次離子質(zhì)譜信息：細(xì)胞表面成像，30keV Bi₃⁺一次離子束，發(fā)射電流0.8μA，采樣面積為60×60μm²，正離子成像模式，m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，磷脂酰膽堿片段)作為指示細(xì)胞膜分布的標(biāo)志片段，m/z 240(C₈H₁₄N₂Ru⁺)為釕化合物1的標(biāo)志片段。質(zhì)譜由CH⁺、CH₃⁺、C₂H₃⁺、C₃H₅⁺和C₅H₁₅NPO₄⁺校正?？傠x子流保持在10¹²個(gè)離子以下，保證在靜態(tài)模式下采集表面二次離子信號(hào)。細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)信息通過(guò)深度剖析得到，采用1kV(200nA)氧源作為剖析源，每剖析1s，采集1次二次離子質(zhì)譜信號(hào)，時(shí)間間隔為1s。分析區(qū)域面積為60×60μm²，剖析區(qū)域?yàn)?00×300μm²。m/z 81(C₅H₅O⁺，核糖片段)作為指示細(xì)胞膜分布的標(biāo)志片段，m/z 102(¹⁰²Ru⁺)為化合物1的指示信號(hào)。

結(jié)果顯示，按照實(shí)施例2的方法可以在兩種分析方法中迅速找到同一個(gè)單細(xì)胞，得到的待檢樣品板在激光掃描共聚焦顯微鏡和二次離子質(zhì)譜中的光學(xué)圖像如圖1A和1B所示。

(4)顯微成像重疊

將步驟(2)和步驟(3)得到的細(xì)胞膜和細(xì)胞核的熒光成像圖和二次離子質(zhì)譜得到細(xì)胞膜和細(xì)胞核特定成分成像圖保存為JPEG格式，在Image J軟件中調(diào)整為相同的格式和大小，采用merge命令將兩張圖片疊加在一起。

結(jié)果顯示，本實(shí)施例利用可尋址的硅片樣品板可以實(shí)現(xiàn)激光掃描共聚焦 顯微鏡和二次離子質(zhì)譜對(duì)同一區(qū)域相同單細(xì)胞的成像分析，如圖4所示。釕化合物1主要分布在MCF-7細(xì)胞核中，它的作用靶標(biāo)為DNA。

從本實(shí)施例可以看出，本發(fā)明方法制得的可尋址的硅片樣品板能夠準(zhǔn)確而快速地定位同一個(gè)單細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)激光共聚焦顯微鏡和二次離子質(zhì)譜的聯(lián)合分析。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明實(shí)施例1制得的樣品板用于SIMS-Confocal聯(lián)用成像研究釕化合物2(結(jié)構(gòu)式如圖2B所示)在MCF-7細(xì)胞內(nèi)空間分布的方法。

(1)MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)與凍干

將樣品板置于激光共聚焦用的細(xì)胞培養(yǎng)皿底部中央，消化好的MCF-7細(xì)胞以10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²濃度于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，加入含有100μM釕化合物2的培養(yǎng)基后孵育24h，除去培養(yǎng)基，用含有1μg/mL的Hoechst 33342的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中孵育10min。除去該培養(yǎng)基，再用含有5μM/L細(xì)胞膜紅色熒光染料的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min。除去培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)濃度為150mM的NH₄COOCH₃(pH 7.4)緩沖液洗滌三次，每次30s。將樣品板快速放入液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中(-60℃)冷凍干燥12h，并逐漸升至室溫，得到待檢樣品。

(2)激光掃描共聚焦熒光成像分析

將制備的待檢樣品板的細(xì)胞貼壁面朝下，置于激光共聚焦用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將該培養(yǎng)皿移至倒置熒光顯微鏡(FV1000-IX81，OLYMPUS)上，用汞燈或Hoechst 33342激發(fā)光405nm的反射光尋找樣品板上的微刻度標(biāo)記及相應(yīng)標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的單細(xì)胞。切換為熒光成像模式對(duì)選定區(qū)域(A43)單元格內(nèi)的單細(xì)胞進(jìn)行激光掃描共聚焦熒光成像分析，得到該細(xì)胞在細(xì)胞膜和細(xì)胞核區(qū)域的熒光成像圖。

(3)二次離子質(zhì)譜成像分析

將待檢樣品板用二次離子質(zhì)譜儀內(nèi)置的攝像機(jī)找到該樣品板上選定區(qū)域(A43)內(nèi)的同一個(gè)單細(xì)胞，在下述實(shí)驗(yàn)條件下采集該細(xì)胞二次離子質(zhì)譜信息：細(xì)胞表面成像，30keV Bi₃⁺一次離子束，電流0.8μA，采樣面積為60×60μm²，正離子成像模式，m/z 184(C₅H₁₅NPO₄⁺，磷脂酰膽堿片段)作為指示細(xì)胞膜形貌的標(biāo)志片段，m/z 598(C₂₆H₂₈ClFN₅O₂Ru⁺)作為指示釕化合物2分布的質(zhì)譜片段。質(zhì)譜由CH⁺、CH₃⁺、C₂H₃⁺、C₃H₅⁺和C₅H₁₅NPO₄⁺校正?？傠x子流保持在10¹²個(gè)離子以下，保證在靜態(tài)模式下采集表面二次離子信號(hào)。細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)信息通過(guò)深度剖析得到，采用1kV(200nA)氧源作為剖析源，每剖析1s，采集1次二次離子質(zhì)譜信號(hào)，時(shí)間間隔為1s。分析區(qū)域面積為60×60μm²，剖析區(qū)域?yàn)?00×300μm²。m/z 81(C₅H₅O⁺，脫氧核糖分子片段)作為指示細(xì)胞膜形貌的標(biāo)志片段，m/z 102(¹⁰²Ru⁺)作為指示釕化合物2的質(zhì)譜碎片。具體結(jié)果參見(jiàn)圖3，其中，圖3A為釕化合物2在細(xì)胞膜表面的質(zhì)譜成像圖，圖3B為釕元素在細(xì)胞核內(nèi)的質(zhì)譜成像圖。

(4)顯微成像重疊

將步驟(2)和步驟(3)得到的細(xì)胞膜和細(xì)胞核的熒光成像圖和二次離子質(zhì)譜得到細(xì)胞膜和細(xì)胞核特征離子的質(zhì)譜成像圖保存為JPEG格式，在Image J軟件中調(diào)整為相同的格式和大小，采用merge命令將兩張圖片疊加在一起。

數(shù)據(jù)顯示，本實(shí)施例利用可尋址的硅片樣品板可以實(shí)現(xiàn)激光掃描共聚焦顯微鏡和二次離子質(zhì)譜對(duì)同一區(qū)域內(nèi)同一單細(xì)胞的成像分析，如圖5所示。釕化合物2(m/z 598)在細(xì)胞膜上有聚集，并且與細(xì)胞膜標(biāo)志物(m/z 184)分布相同，說(shuō)明細(xì)胞膜是化合物2的作用位點(diǎn)?；衔?在細(xì)胞核也有聚集，并且與細(xì)胞核標(biāo)志物(m/z 81)分布相同，說(shuō)明化合物2可以同時(shí)作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，具有多靶點(diǎn)綜合治療癌癥的潛能。

從本實(shí)施例可以看出，本發(fā)明方法制得的可尋址硅片樣品板能夠準(zhǔn)確而快速地定位同一個(gè)單細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)激光共聚焦顯微鏡和二次離子質(zhì)譜成像的聯(lián)用分析。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的樣品板的制備方法。

按照實(shí)施例1的方法制備可尋址的樣品板，不同的是，所用的材料為0.17mm厚，面積22×22mm²的蓋玻片(玻璃)，該樣品板上共有8個(gè)4×4陣列，其中四個(gè)陣列中的單元格為正方形，四個(gè)為圓形，每個(gè)正方形單元格的大小為50×50μm²，而每個(gè)圓形單元格的直徑為50μm。

實(shí)施例5

本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明實(shí)施例4制得可尋址的玻璃樣品板用于研究化合物1在HeLa細(xì)胞(D34)中的空間分布的方法。

按照實(shí)施例3的方法，研究HeLa細(xì)胞的顯微成像，不同的是，細(xì)胞與化合物1孵育后只用Hoechst 33342熒光標(biāo)記，然后用4％的多聚甲醛(PBS)溶液在4℃條件下固定30min后凍干48h再進(jìn)行分析。將玻璃樣品板細(xì)胞貼壁面朝上，尋找玻璃樣品板上的微刻度標(biāo)記，選定相應(yīng)標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的單細(xì)胞直接進(jìn)行激光掃描共聚焦熒光成像分析和二次離子質(zhì)譜成像分析。

數(shù)據(jù)顯示，實(shí)施例4制備的可尋址的玻璃樣品板能夠應(yīng)用于單細(xì)胞顯微成像分析(見(jiàn)圖6)，可以精確定位藥物在細(xì)胞體內(nèi)的分布。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。