一種馬秋波病毒非診斷性的免疫學(xué)檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬秋波病毒的免疫學(xué)檢測方法，該方法步驟如下：根據(jù)馬秋波病毒基因序列S片段設(shè)計特異性引物；逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增馬秋波病毒S片段上的開放閱讀框架，PCR產(chǎn)物；將上述PCR產(chǎn)物與TOPO質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選出陽性克??；將陽性克隆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離出轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，以該目的蛋白為抗原，采用免疫學(xué)檢測方法檢測待測樣本中是否含有馬秋波病毒。本發(fā)明采用免疫學(xué)方法實現(xiàn)了對馬秋波病毒的可靠而有效的檢測，對科研和人民的生命健康具有重大意義。
【專利說明】一種馬秋波病毒非診斷性的免疫學(xué)檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，具體地涉及一種馬秋波病毒的免疫學(xué)檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬秋波病毒（machupo virus,MACV)屬于沙粒病毒屬（Arenavirus)，有包膜，毒粒 呈多型性，大小為80?150nm。1963年首次在玻利維亞委內(nèi)瑞拉暮鼠（Calomys callosus) 中分離到的。病毒基因組為單負(fù)鏈RNA雙環(huán)，分節(jié)段（L段和S段），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制。幾乎所 有的沙粒病毒都能引起嚙齒類動物持續(xù)性感染。馬秋波病毒被視為沙粒病毒屬中新世界病 毒的代表之一。它與胡寧病毒（Junin)、瓜納里托病毒（Guanarito)是引起人出血熱重要病 毒，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、乏力、肌肉酸痛、厭食等，3?4天后會伴隨頭痛頭暈、惡心和嚴(yán)重 衰竭，潛伏期在1?2周，其高致病性和致死率不低于30%。
[0003] 雖然，我國還未發(fā)現(xiàn)感染馬秋波病毒的病例存在，但是隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào) 易自由化，國外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過先進(jìn)的交通工具和國際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一 個國家或地區(qū)傳向全球，造成國際間傳播。傳染病在國際間的廣泛傳播與流行，已成為各國 政府密切關(guān)注的政治問題?！秶H衛(wèi)生條例》、《中華人民共和國衛(wèi)生檢疫法》、都對傳染病風(fēng) 險預(yù)警與快速決策做出了相應(yīng)的規(guī)定。我國已將傳染病防控提升到戰(zhàn)略的角度，予以高度 重視。
[0004] 本發(fā)明選取馬秋波病毒的基因序列的S片段，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)馬秋波 病毒基因的目的蛋白，繼而通過免疫學(xué)方法對馬秋波病毒進(jìn)行檢測，對科研和社會衛(wèi)生安 全具有重大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種馬秋波病毒的非診斷性檢測免疫學(xué)檢測方法。該方法 包括具體如下步驟：
[0006] (1)根據(jù)馬秋波病毒基因序列的S片段設(shè)計特異性引物；
[0007] (2)以馬秋波病毒的RNA為模板，加入所述特異性引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以 所述cDNA為模板，利用PCR擴增馬秋波病毒S片段上的開放閱讀框架，經(jīng)酶切、純化，得到 PCR產(chǎn)物；
[0008] (3)將上述PCR產(chǎn)物與TOPO質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pETlOO,并在大腸桿菌 的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR篩選出陽性克隆；
[0009] (4)將所述陽性克隆接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后分離出轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以收集的目的蛋白作為抗原，采用免疫學(xué)檢測方法檢測待測樣本中是否含 有馬秋波病毒；
[0010] 其中，步驟（1)中設(shè)計的所述特異性引物的序列為：
[0011] 上游引物 NP of Machupo virus-F :
[0012] 5'-TTACAGTGCAAAGGCTGCCTTGGGTAGAAATAGAA-3' ；
[0013] 下游引物 NP of Machupo virus-R :
[0014] 5'-TGGCTCACTCCAAGGAAATTCCCAGCTTTCGGTGGACTCA-3' 。
[0015] 進(jìn)一步地，所述免疫學(xué)檢測方法為間接ELISA。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟（2)中所述PCR的反應(yīng)物為：

【權(quán)利要求】
1. 一種馬秋波病毒非診斷性的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： (1) 根據(jù)馬秋波病毒基因序列的S片段設(shè)計特異性引物； (2) 以馬秋波病毒的RNA為模板，加入所述特異性引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以所述 cDNA為模板，利用PCR擴增馬秋波病毒S片段上的開放閱讀框架，經(jīng)酶切、純化，得到PCR產(chǎn) 物； (3) 將上述PCR產(chǎn)物與TOPO質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pETlOO,并在大腸桿菌的化 學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR篩選出陽性克隆； (4) 將所述陽性克隆接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后分離出轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，以收集的目的蛋白作為抗原，采用免疫學(xué)檢測方法檢測待測樣本中是否含有馬 秋波病毒； 其中，步驟（1)中設(shè)計的所述特異性引物的序列為： 上游引物 NP of Machupo virus-F: 5'-TTACAGTGCAAAGGCTGCCTTGGGTAGAAATAGAA-3' ； 下游引物 NP of Machupo virus-R : 5'-TGGCTCACTCCAAGGAAATTCCCAGCTTTCGGTGGACTCA-3' 。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，所述免疫學(xué)檢測方法為間接 ELISA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，步驟⑵中PCR的條件為：反 應(yīng)體系為：
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，步驟（3)中PCR產(chǎn)物與TOPO 質(zhì)粒連接的條件為：
冰上輕輕混勻，室溫孵浴5min，冰上連接反應(yīng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，步驟（3)菌落PCR的條件如 下：
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)檢測方法，其特征在于，步驟（4)中所述誘導(dǎo)表達(dá)的步 驟包括： (1) 在若干支已高壓滅菌的試管里分別倒入含IOOmg ? mr1氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)液3? 4ml; (2) 用記號筆圈出長得比較圓潤且單一的工程菌落，鑷子輕挑，放入分裝好的試管里； (3) 搖床 225rpm，37°C 培養(yǎng) 2h ; (4) 取上述培養(yǎng)液按1:500比例接種到新鮮的LB培養(yǎng)液，225rpm，37°C培養(yǎng)大約4h后 測且〇D_值為0. 585,再加入IPTG至終濃度為ImM開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)后經(jīng)后續(xù)步驟分 離出目的蛋白。
【文檔編號】G01N33/569GK104360059SQ201410640296
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】姚李四, 張曉龍, 曹曉梅 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院