專(zhuān)利名稱(chēng)：抗－HBeAg單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗-乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細(xì)胞株及該單克隆抗體的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，肝病已經(jīng)越來(lái)越成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，其中病毒性肝炎中尤以乙型肝炎對(duì)人類(lèi)影響最大。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共健康問(wèn)題，成為了當(dāng)前的一種世界性疾病。目前全世界HBV持續(xù)感染者達(dá)3.5億，其中75％在亞洲和西太平洋地區(qū)。我國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)，HBV感染者達(dá)1.2億，平均年發(fā)病約140萬(wàn)左右，居法定傳染病第三位。隨著我國(guó)對(duì)乙型肝炎的深入了解，自我保健意識(shí)的逐步加強(qiáng)，對(duì)乙肝的預(yù)防與檢測(cè)成為了醫(yī)療界的重要課題。
由于乙肝影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性，乙型肝炎診斷試劑作為專(zhuān)用于乙肝患者各種生理指標(biāo)的檢測(cè)、乙肝的診斷和治療過(guò)程監(jiān)測(cè)的生物學(xué)和化學(xué)試劑，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。無(wú)論是新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)還是已有產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣，均具有巨大潛力。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒相關(guān)的一個(gè)分泌型的抗原，在前C區(qū)編碼，和核心抗原(C抗原)有部分同源性，但是由于在N端有了一個(gè)信號(hào)肽，所以是一個(gè)分泌型的抗原。HBeAg與HBV DNA、DNAP和前-S高度相關(guān)，共同代表病毒復(fù)制(Matsuo M.，Clinical Evaluation orHBeAg/Anti-Hbe system in HBeAg Positive Hapatitis，Acta Hepatol Spn.，1985，26(7)819)。目前在乙型肝炎病毒的血清標(biāo)志物中HBeAg是應(yīng)用最為廣泛、最為可靠的評(píng)估乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制與傳染性的指標(biāo)之一。HBeAg陽(yáng)性有助于判斷急性肝炎的預(yù)后、代表血液傳染性強(qiáng)，亦可作為抗病毒藥物療效的考核指標(biāo)之一(彭文偉主編，《病毒性肝炎研究》，廣東科技出版社，1998年版，19-20；倪語(yǔ)星、洪秀華、樓昌斌主編，《現(xiàn)代病原學(xué)檢驗(yàn)與臨床實(shí)踐》，上海上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1999年146)。目前，在乙型肝炎的兩對(duì)半的診斷中，HBeAg診斷也是其中很重要的一部分，因此HBeAg的抗體的研制具有重要的臨床使用價(jià)值。
目前，HBeAg的檢測(cè)方法有放射免疫檢測(cè)法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)等。由于RIA法所需設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、價(jià)格高、易污染等缺點(diǎn)而使其使用受到很大限制，這一限制為ELISA法的使用提供了廣闊的市場(chǎng)。Imai M等人利用單克隆抗體技術(shù)制備出單克隆抗-HBeAg(a，b)兩株雜交瘤細(xì)胞后，使檢測(cè)HBeAg的方法在特異性和敏感性方面達(dá)到了一個(gè)新水平(Imai M，免疫學(xué)雜志(J.Immunol)，1982，12869)。由于單克隆抗-HbeAg雜交瘤細(xì)胞株難以獲得，也由于其分泌的單克隆抗-HBeAg抗體不配對(duì)而無(wú)法用于ELISA檢測(cè)，因此，在檢測(cè)HBeAg時(shí)，往往采用包被單抗，酶標(biāo)多抗，這會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率高、敏感性低等技術(shù)缺陷，因此采用雙抗體夾心-ELISA法檢測(cè)HBeAg是必然趨勢(shì)。但是雙抗體夾心ELISA法需要兩個(gè)識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體，而利用傳統(tǒng)的方法制備抗-HBeAg單克隆抗體時(shí)往往只能得到識(shí)別HBeAg一個(gè)優(yōu)勢(shì)表位(命名為b表位)的抗體，這給夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg的臨床應(yīng)用造成了很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺乏識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體這樣的技術(shù)缺陷，發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而詳細(xì)的研究工作，包括對(duì)傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)的改進(jìn)、制備和篩選識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆雜交瘤細(xì)胞、抗-HBeAg單克隆抗體的制備及其在檢測(cè)HBeAg中的應(yīng)用等。
基于上述研究，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供抗-HBeAg單克隆抗體以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺乏識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體的技術(shù)缺陷。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供產(chǎn)生抗-HBeAg單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供抗-HBeAg單克隆抗體的制備方法以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺乏識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體的技術(shù)缺陷。
本發(fā)明還要的解決的技術(shù)問(wèn)題是提供抗-HBeAg單克隆抗體在檢測(cè)HBeAg中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的為了在獲得識(shí)別優(yōu)勢(shì)表位抗體的同時(shí)能夠獲得不同于優(yōu)勢(shì)表位抗體的抗體，人為改變機(jī)體對(duì)抗原不同表位反應(yīng)性的相對(duì)強(qiáng)弱。在免疫前先靜脈注射識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的單抗。優(yōu)選地每次免疫前將抗原HBeAg和b表位的單克隆抗體反應(yīng)，然后再進(jìn)行免疫。這樣增加了獲得b表位之外的其他表位的抗體的幾率。
本發(fā)明的理論根據(jù)是免疫學(xué)的兩個(gè)基本原理第一，用識(shí)別一個(gè)表位的抗體可以對(duì)這個(gè)表位進(jìn)行封閉；第二，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗體具有一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制——當(dāng)機(jī)體內(nèi)已經(jīng)有識(shí)別一個(gè)表位的大量抗體存在時(shí)，再注射抗原，機(jī)體對(duì)這個(gè)表位的反應(yīng)性會(huì)被負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而抑制了這個(gè)表位的抗體的產(chǎn)生水平，而對(duì)其他表位的反應(yīng)水平相對(duì)提高。
在本發(fā)明中，發(fā)明人用HBeAg免疫動(dòng)物，第一次免疫前先靜脈注射大量識(shí)別HBeAg的b表位的抗體，第一次免疫用福氏完全佐劑與HBeAg混合后乳化按照本領(lǐng)域公知的方法免疫動(dòng)物，第二次、第三次免疫用福氏不完全佐劑與HBeAg混合后乳化免疫動(dòng)物，第三次免疫后再用HBeAg回憶刺激動(dòng)物，取血清檢測(cè)抗體效價(jià)。優(yōu)選地在每次免疫前將HBeAg和優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的抗-HBeAg單抗預(yù)先反應(yīng)后再免疫動(dòng)物。免疫動(dòng)物的抗原或者是商品化的乙型肝炎病毒e蛋白(HBeAg)或者用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依所公知的基因工程技術(shù)制備得到的HBeAg(HBeAg的氨基酸序列是公知的，Sequence ID No.1)。免疫動(dòng)物可以是本領(lǐng)域常用的動(dòng)物如家兔、小鼠等。優(yōu)選地使用BALB/C小鼠。免疫方法、免疫劑量、免疫間隔時(shí)間等因使用不同的動(dòng)物會(huì)有所不同，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)(如根據(jù)金伯泉主編，《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，西安第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年)方便地實(shí)施之。血清抗體效價(jià)用雙向瓊脂擴(kuò)散法或間接ELISA法檢測(cè)。
免疫小鼠前先注射0.1mg～5.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體、優(yōu)選地注射0.1～2.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體。每次免疫前使0.05mg～0.2mgHBeAg和0.1～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體混合乳化后注射免疫小鼠。
優(yōu)選地免疫小鼠前先注射0.5mg～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體，然后每次免疫前使0.1mg～0.2mg HBeAg和0.5～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體混合乳化后注射免疫小鼠。
從回憶刺激后的動(dòng)物脾臟中分離脾臟B淋巴細(xì)胞，在常規(guī)條件下用聚乙二醇(PEG)作融合劑將脾臟B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，用含有1×HAT(次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T))和10％小牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行選擇培養(yǎng)。50×HAT有商品化產(chǎn)品，其含有5mM的H、0.02mM的A和0.8mM的T。按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行細(xì)胞融合，培養(yǎng)液是RPMI1640。融合雜交瘤細(xì)胞的克隆化采用本領(lǐng)域常規(guī)的有限稀釋法，最后獲得了一株產(chǎn)生抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株S-72-3，該細(xì)胞株已經(jīng)于2005年9月23日提交位于中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC-C200517。
將上述保藏號(hào)為CCTCC-C200517的雜交瘤細(xì)胞株按照常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增或者注射小鼠腹腔制備腹水。用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液或腹水中的抗體效價(jià)，用本領(lǐng)域公知的方法從培養(yǎng)物或者腹水中回收抗-HBeAg單克隆抗體。
以HBeAg和其他蛋白質(zhì)抗原如牛血清白蛋白作為抗原、用間接ELISA法進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)。用本領(lǐng)域公知的方法如酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體鑒定抗體的Ig類(lèi)及用標(biāo)準(zhǔn)的抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)散或夾心ELISA法鑒定上述抗-HBeAg單克隆抗體的亞類(lèi)，上述抗-HBeAg單克隆抗體為IgG2b，輕鏈為κ鏈。
用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)和/或生物傳感器(Biosensor)檢定上述抗-HBeAg單克隆抗體的識(shí)別表位。人工合成了一段18個(gè)氨基酸殘基的肽(LN18)(Sequence IDNo.2)，它是HBeAg的119-136的氨基酸序列，間接ELISA檢測(cè)表明上述抗-HBeAg單克隆抗體與肽LN18的結(jié)合性很弱而商品化的識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的單克隆抗體ewb與LN18特異性結(jié)合，表明本發(fā)明的上述抗-HBeAg單克隆抗體所結(jié)合的表位是在HBeAg的119-136之外的氨基酸序列，與ewb的表位不同。進(jìn)一步用基因工程的手段表達(dá)了另一個(gè)多肽Ec(Sequence IDNo.3)，系去掉了HBeAg抗原C端氨基酸殘基的多肽，亦即包含HBeAg1-118的肽段。本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體和Ec高度結(jié)合而ewb與Ec幾乎不結(jié)合，因而本發(fā)明的抗-HbeAg單克隆抗體的表位位于HBeAg的1-118序列。
因而，本發(fā)明提供了一種抗-HBeAg單克隆抗體，它結(jié)合HBeAg的優(yōu)勢(shì)表位(b表位)以外的表位，優(yōu)選地結(jié)合HBeAg的119-136之外的表位，最優(yōu)選地結(jié)合位于HBeAg的1-118氨基酸序列的表位。
本發(fā)明還提供了一株產(chǎn)生上述抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株。
另外，本發(fā)明提供了制備上述抗-HBeAg單克隆抗體的方法，包括如下步驟(a)擴(kuò)增產(chǎn)生上述抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株；(b)從擴(kuò)增產(chǎn)物中回收抗-HBeAg單克隆抗體。
擴(kuò)增細(xì)胞株的方法在本領(lǐng)域是公知的，如用體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法，例如滾瓶、方瓶或者動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵罐培養(yǎng)擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞；或者用體內(nèi)制備腹水法，如先擴(kuò)增上述雜交瘤細(xì)胞株然后腹腔注射BABL/C小鼠，7-10天后采集腹水。
從培養(yǎng)液或腹水中回收抗-HBeAg單克隆抗的方法在本領(lǐng)域也是常用的，如硫酸銨沉淀法、陰離子交換層析法或者葡萄球菌A蛋白親和層析法。
本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體與商品化的識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的單克隆抗體ewb識(shí)別HBeAg的不同表位，可以配合使用，用于夾心法ELISA檢測(cè)血清中的HBeAg。用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體，與ewb配合用于檢測(cè)血清中的HBeAg。預(yù)先將ewb固定在固相載體上，然后加入待檢樣品，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，抗體-抗原結(jié)合后加入標(biāo)記的本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體，反應(yīng)、加入酶反應(yīng)底物顯色或發(fā)光，檢測(cè)樣品中的HBeAg。當(dāng)然，標(biāo)記ewb而預(yù)先固定本發(fā)明的抗體也可以達(dá)到檢測(cè)目的。本發(fā)明的方法具有很高的特異性和較高的準(zhǔn)確率。
應(yīng)當(dāng)明確，在本發(fā)明中單克隆抗體和單抗系同義語(yǔ)，可以互換使用。本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體有時(shí)也以抗體S-72-3表示，但抗體S-72-3指稱(chēng)雜交瘤細(xì)胞株S-72-3(保藏號(hào)CCTCC-C200517)產(chǎn)生的抗-HBeAg單克隆抗體，因而抗體S-72-3不能與抗-HBeAg單克隆抗體互換使用。


圖1是BALB/C小鼠免疫后血清抗體效價(jià)的測(cè)定，方法為間接ELISA法，◆為免疫HBeAg的小鼠血清、■為正常小鼠血清。
圖2是間接ELISA法檢測(cè)單克隆抗體腹水效價(jià)，◆系雜交瘤細(xì)胞株S-72-3腹水，■系骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0腹水，▲系正常小鼠血清。
圖3是間接ELISA法檢測(cè)單克隆抗體腹水和HBeAg結(jié)合的特異性，1為重組HBeAg抗原(5μg/mL)，2為對(duì)照蛋白(牛血清白蛋白，BSA，10μg/mL)。
圖4是間接ELISA法檢測(cè)抗體與肽LN18的結(jié)合，LN18+S-72代表LN18和抗體S-72-3，LN18+ewb代表肽LN18和商品化抗體ewb結(jié)合。
圖5是間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與Ec的結(jié)合，其中S-72表示抗體S-72-3與Ec結(jié)合，ewb表示抗體ewb與Ec結(jié)合。
圖6是夾心ELISA法鑒定抗體識(shí)別表位，其中E代表重組HBeAg抗原，BLANK代表無(wú)關(guān)的抗原牛血清白蛋白(BSA)。
圖7是Biocore檢測(cè)抗體S-72-3的親和常數(shù)。
以下結(jié)合具體的實(shí)施方式詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除有特殊說(shuō)明外，具體操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)(金冬雁、黎孟楓等譯，J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，北京科學(xué)出版社，1998年)和《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(金伯泉主編，西安第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年版)進(jìn)行。在詳細(xì)描述了這些具體實(shí)施方式
后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)充分知曉如何設(shè)計(jì)其他可靠方法，從而通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的成果來(lái)獲得同樣的信息。因此無(wú)論這些具體實(shí)施方法的描述如何詳細(xì)具體，均不意味著對(duì)發(fā)明總體范圍的任何限制，本發(fā)明的范圍僅以權(quán)利要求的范圍為準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1抗-HBeAg雜交瘤細(xì)胞株的建立及其單克隆抗體的制備(一)免疫動(dòng)物用基因重組的HBeAg蛋白三次免疫BALB/C小鼠。第一次免疫的前一天，先靜脈注射0.5mg識(shí)別HBeAg的b表位的抗體ewb(上?？迫A有限公司產(chǎn)品)。第一次免疫用福氏完全佐劑與HBeAg蛋白等量混勻后乳化，靜脈注射，0.1mg/只，注射體積0.2～0.3mL。第二、第三免疫用福氏不完全佐劑與HBeAg蛋白等量混勻后乳化，免疫方法與用量同第一次免疫。每次免疫小鼠前均使0.1mgHBeAg和0.5mg抗體ewb混合、與等量佐劑混勻乳化。每次免疫間隔一個(gè)月。第三次免疫一個(gè)月后，腹腔注射0.1mg的HBeAg蛋白回憶刺激BALB/C小鼠。間接ELISA方法檢測(cè)免疫后的血清效價(jià)，圖1。從圖1中可以看出，經(jīng)過(guò)三次免疫之后，對(duì)重組HBeAg抗原的間接ELISA法檢測(cè)血清的抗體效價(jià)為64000，而正常小鼠血清對(duì)重組HBeAg抗原沒(méi)有反應(yīng)。間接ELISA法檢測(cè)中包被的HBeAg抗原濃度是1.5μg/ml。
福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑均使用商品化產(chǎn)品。
(二)雜交瘤細(xì)胞株的制備和篩選取回憶刺激3天后的小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50％PEG-4000進(jìn)行融合。用含1×HAT和10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。融合后三天開(kāi)始出現(xiàn)融合細(xì)胞，512個(gè)孔中335個(gè)為融合孔，融合率為65.4％。用ELISA法檢測(cè)抗-HBeAg單克隆抗體，檢測(cè)281個(gè)孔，其中陽(yáng)性孔為12個(gè)，陽(yáng)性率為4.2％。經(jīng)過(guò)三次有限稀釋法克隆化，最后獲得一株穩(wěn)定分泌抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株，標(biāo)記為S-72-3。
(三)腹水的制備及其效價(jià)和抗體亞型的鑒定將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株S-72-3以1×106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先致敏的8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測(cè)S-72-3單抗的效價(jià)。以骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0腹水和正常小鼠血清為對(duì)照，包被的HBeAg抗原濃度是1.5μg/mL。
結(jié)果SP2/0腹水和正常血清對(duì)重組HBeAg抗原無(wú)反應(yīng)(圖2)，單克隆抗體S-72-3的效價(jià)為1.024×106。進(jìn)而用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙夾心ELISA確定細(xì)胞株S-72-3分泌的抗體亞型為IgG2b，輕鏈均為κ鏈。
實(shí)施例2抗-HBeAg單克隆抗體的制備將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株S-72-3以1×106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先致敏8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測(cè)S-72-3單抗的效價(jià)。腹水4℃、12000rpm離心15min，取1份(體積)腹水與2份(體積)60mM、pH4.8的醋酸緩沖液混合，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胝了?3μL/mL腹水，室溫混合30min。4℃靜置2小時(shí)以上使其充分沉淀，然后4℃、12000rpm離心30min，棄去沉淀，上清經(jīng)砂芯漏斗過(guò)濾后加入1/10體積的0.1MpH7.4的PBS，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/mL的硫酸銨使飽和度達(dá)到45％，4℃靜置1小時(shí)以上，然后4℃、10000rpm離心30min，棄去上清。沉淀用含有137mM NaCl、2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH7.4的PBS溶解，并于50-100倍體積的上述PBS中4℃透析過(guò)夜。然后用Q SepharoseFast Flow交換柱層析技術(shù)進(jìn)一步純化。平衡緩沖液為20mMpH7.5Tris-HCl緩沖液、洗脫緩沖液為含1.0M NaCl的20mM、pH7.5的Tris-HCl緩沖液，層析柱XK 16/20、Pharmacia AKTA FPLC層析系統(tǒng)。按照廠(chǎng)商提供的說(shuō)明書(shū)裝柱，平衡緩沖液平衡層析柱、流速5mL/min。上樣完畢后用3倍柱體積的平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，以NaCl遞增的線(xiàn)性梯度洗脫結(jié)合的抗體蛋白，線(xiàn)性梯度為0-1.0MNaCl/10倍柱體。檢測(cè)A280，收集洗脫的抗體蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純度，用本領(lǐng)域常用的紫外分光光度法測(cè)定抗體含量，間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。
實(shí)施例3抗-HBeAg單克隆抗體的特異性用間接ELISA方法檢測(cè)抗-HBeAg單克隆抗體的特異性。包被的抗原是重組HBeAg抗原(5μg/ml)，對(duì)照為牛血清白蛋白(10μg/ml)。抗體S-72-3的濃度是5μg/ml(實(shí)施例2)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。
從圖3可以看出抗體S-72-3與重組蛋白HBeAg都有著很強(qiáng)的反應(yīng)性，而與對(duì)照蛋白的反應(yīng)性很低。表明抗體S-72-3抗原特異性好。
實(shí)施例4抗體S-72-3的結(jié)合表位的鑒定及性質(zhì)分析為了研究所制備的單克隆抗體所識(shí)別的表位，設(shè)計(jì)合成了多肽，命名為L(zhǎng)N18(見(jiàn)序列表Sequence No.2)。LN18肽的序列是根據(jù)文獻(xiàn)資料和計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)的，它所代表的是HBeAg抗原119-136的氨基酸序列所組成的一個(gè)表位。間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與LN18的結(jié)合性，結(jié)果如圖4。ewb和LN18具有較好的結(jié)合性，而抗體S-72-3和LN18的結(jié)合幾乎是沒(méi)有的，表明，ewb所結(jié)合的表位很有可能是LN18所在的HBeAg的這段序列上，而抗體S-72-3結(jié)合的表位是119-136之外的區(qū)域。同時(shí)結(jié)果也可以很清晰的說(shuō)明這兩個(gè)抗體所結(jié)合的位置是不同的，位于HBeAg的不同區(qū)域上。
為了進(jìn)一步研究抗體S-72-3所結(jié)合的具體位置，表達(dá)了一個(gè)新的抗原，一個(gè)HBeAg的肽段，標(biāo)記為Ec(Sequence No.3)，這個(gè)抗原和HBeAg最大的不同是把HBeAgC端的31個(gè)氨基酸殘基去掉，去掉的這段區(qū)域包含了LN18所在的序列，也即Ec系HBeAg1-118氨基酸的序列。間接ELISA方法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與Ec的結(jié)合，抗體濃度均為5μg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥闯?，S-72-3與Ec有較好的結(jié)合，而ewb與Ec的結(jié)合是幾乎沒(méi)有的。前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明ewb的結(jié)合表位很可能是LN18所在的序列，所以去掉了LN18所在的序列之后的蛋白Ec與ewb的不反應(yīng)也進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的結(jié)論，而S-72-3與Ec的反應(yīng)表明S-72-3所結(jié)合的表位是Ec所在的區(qū)域，不同于ewb。
為了進(jìn)一步分析抗體結(jié)合表位，發(fā)明人對(duì)它們所結(jié)合的抗原表位進(jìn)行了初步的定性分析，確定它們所識(shí)別的是線(xiàn)性還是構(gòu)型表位。如果識(shí)別的是構(gòu)型表位，那么在抗原變性之后，反應(yīng)活性將大大的下降，一般來(lái)說(shuō)＞50％；如果識(shí)別的是線(xiàn)性表位，那么活性下降幅度會(huì)比較小，一般來(lái)說(shuō)＜50％。
首先將重組的HBeAg變性，用間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb對(duì)HBeAg變性前后的結(jié)合性，結(jié)果如表1。
表1單克隆抗體對(duì)抗原變性前后反應(yīng)結(jié)果

從表中結(jié)果看出，抗體S-72-3對(duì)變性前后的HBeAg的反應(yīng)活性分別下降了89％，這表明抗體S-72-3所識(shí)別的表位可能是構(gòu)型表位；而ewb只下降了43％，這表明它所識(shí)別的表位可能是線(xiàn)性表位。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步判斷抗體S-72-3所識(shí)別的是HBeAg的1-118氨基酸所組成的一個(gè)構(gòu)型表位，這個(gè)表位可能跨越了整個(gè)的Ec。
實(shí)施例5夾心法檢測(cè)重組HBeAg用夾心ELISA法檢測(cè)重組的HBeAg，其中將抗體ewb包被在酶標(biāo)板上，用過(guò)碘酸鈉法將實(shí)施例2的抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，檢測(cè)的抗原是重組HBeAg，對(duì)照為BSA。結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體S-72-3可以和ewb進(jìn)行配對(duì)特異檢測(cè)重組E蛋白，進(jìn)一步表明它和ewb識(shí)別的抗原表位是不同的。這個(gè)結(jié)果表明，單克隆抗體S-72-3是識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位b表位之外的其他表位的單克隆抗體，并且可以和已知抗體ewb進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)HBeAg。
實(shí)施例6單克隆抗體S-72-3親和常數(shù)的測(cè)定選擇目前廣泛采用的biocore技術(shù)測(cè)定親和常數(shù)。
系統(tǒng)信息BIAcore 3000(上海生命科學(xué)研究院藥物研究所)CM5sensorchipAmine coupling(Directly immobilization)系統(tǒng)緩沖液20mM HEPEs150mM NaCl5mM EDTA0.1％P20實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。其中抗體濃度梯度如下4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM和0μM。根據(jù)二價(jià)結(jié)合模型，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)結(jié)果如下ka1＝1.14±0.129×1031/Ms kd1＝2.49±0.168×10-51/ska2＝1.46±0.187×10-31/Mskd2＝0.0651±0.002 1/s
親和常數(shù)K＝ka/kd＝4.57×1010M其中Ka結(jié)合常數(shù)；Kd解離常數(shù)。可見(jiàn)抗體S-72-3對(duì)HBeAg具有高度的親和力。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>抗-HBeAg單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和用途<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>-10<211>149<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>SIGNAL<222>(-10)..(-1)<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(149)<400>1Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr-10 -5 -1 5Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp10 15 20Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr25 30 35Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala40 45 50Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr55 60 65 70Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp Leu Val Val
75 80 85Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp90 95 100Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr105 110 115Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro120 125 130Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val135 140 145<210>2<211>18<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>2Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro1 5 10 15Pro Asn<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>3Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr11權(quán)利要求
1.抗-HBeAg單克隆抗體，其特征在于識(shí)別HbeAg的b表位之外的抗原表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗-HBeAg單克隆抗體，其特征在于識(shí)別位于HBeAg氨基酸序列1-118的抗原表位。
3.由保藏號(hào)為CCTCC-C200517的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗-HBeAg單克隆抗體識(shí)別位于HBeAg氨基酸序列1-118的抗原表位。
4.一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CCTCC-C200517。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，包括用抗原HBeAg免疫動(dòng)物、分離脾臟B淋巴細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞和雜交瘤檢測(cè)的步驟，其特征在于在用HBeAg免疫動(dòng)物前先靜脈注射大量識(shí)別HBeAg的b表位的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于在用HBeAg免疫動(dòng)物前先使HBeAg和識(shí)別HBeAg的b表位的抗體反應(yīng)后再免疫動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于免疫動(dòng)物為BALB/C小鼠、骨髓瘤細(xì)胞系為SP2/0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于免疫BALB/C小鼠前靜脈注射0.1mg～2.0mg的識(shí)別HBeAg的b表位的抗體，每次免疫小鼠前使0.05mg～0.2mg HbeAg和0.1mg～1.0mg識(shí)別HBeAg的b表位的抗體混合、乳化，然后免疫小鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的制備方法，包括體外培養(yǎng)保藏號(hào)為CCTCC-C200517的細(xì)胞和從培養(yǎng)液中回收抗-HBeAg單克隆抗體的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的制備方法，包括將保藏號(hào)為CCTCC-C200517的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射動(dòng)物、回收腹水并從腹水中分離抗-HBeAg單克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的的單克隆抗體的制備方法，其特征在于用辛酸-硫酸銨沉淀法從腹水中回收單抗，然后用陰離子交換層析法純化單抗。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一的抗-HBeAg單克隆抗體在檢測(cè)HBeAg中的用途。
全文摘要
本發(fā)明抗－HBeAg單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和用途涉及病毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗－HBeAg單克隆抗體以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺乏識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體的技術(shù)缺陷并提供產(chǎn)生抗－HBeAg單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株和抗－HBeAg單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的抗－HBeAg單抗識(shí)別HBeAg的b表位之外的抗原表位，篩選獲得了產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞株，保藏號(hào)為CCTCC－C200517，通過(guò)擴(kuò)增該細(xì)胞分離獲得了抗－HBeAg單抗。本發(fā)明的抗體可以用于檢測(cè)HBeAg。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1757653SQ200510030849
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者孫兵, 靖彩英, 顏凌晨 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院