Elisa方法定量測定人血清中重組人鼠嵌合抗cd20單克隆抗體濃度的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及ELISA方法定量測定人血清中重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體濃度。具體而言，本發(fā)明提供測定血清中抗CD20單克隆抗體濃度的酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，所述方法使用抗CD20單克隆抗體的F(ab′)2片段免疫動物獲得的多克隆抗體作為捕獲抗體，使用IgG-F(ab′)2抗體作為檢測抗體。本發(fā)明的方法具有良好的特異性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性、長期凍存穩(wěn)定性等優(yōu)點。
【專利說明】ELISA方法定量測定人血清中重組人鼠嵌合抗CD20單克隆 抗體濃度

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及定量測定血清中單克隆抗體藥物濃度的方法。本發(fā)明的方法采用酶聯(lián) 免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法對血清中抗CD20單克隆抗體 濃度進行分析，具有良好的靈敏度和特異性等優(yōu)點。

【背景技術(shù)】
[0002] 非霍奇金淋巴瘤（NHL)是最常見的淋巴組織惡性腫瘤，其死亡率在我國居惡性腫 瘤中的第十位。NHL的傳統(tǒng)治療方案是以化療為主，局部放療、手術(shù)治療為輔的綜合治療。 迄今為止，傳統(tǒng)細胞毒化療藥物進一步提高惡性淋巴瘤臨床療效的空間十分有限，單克隆 抗體已經(jīng)成為對經(jīng)過選擇的NHL患者較為成功的一種治療方法。治療B細胞性NHL最常用 的抗體靶目標包括⑶20、⑶22等。
[0003] ⑶20抗原位于前B和成熟B淋巴細胞的表面，而造血干細胞、正常漿細胞或其它 正常組織不表達⑶20。95%以上的B細胞型非霍奇金淋巴瘤瘤細胞表達⑶20。重組人鼠 嵌合抗CD20單克隆抗體與B細胞表面的CD20抗原特異性結(jié)合后，啟動介導B細胞溶解的 免疫反應(yīng)，作用機制包括補體依賴的細胞毒作用（CDC)、抗體依賴的細胞毒作用（ADCC)、生 長抑制作用等[1_2]。因此，⑶20抗原是靶向治療非霍奇金淋巴瘤的有效靶點。國外同類品 種利妥昔單抗注射液（英文名稱：Rituximab Injection ;商品名稱：RiUixmi t利妥昔單抗 (商品名：美羅華））由IDEC/Genentech公司開發(fā)，于1997年11月獲美國FDA批準用于NHL 治療，1998年歐盟也批準該藥上市。利妥昔單抗注射液于2000年3月在我國獲得進口許 可。利妥昔單抗注射液上市規(guī)格為500mg/50ml、100mg/10ml，臨床治療NHL使用推薦劑量為 375mg/m2BSA (體表面積）。
[0004] 神州細胞工程有限公司研制的重組人鼠嵌合抗⑶20單克隆抗體SCT400是一種人 鼠嵌合IgGl型抗CD20單克隆抗體，能特異性地與跨膜抗原CD20結(jié)合，臨床上擬單用或與 化藥聯(lián)合治療非霍奇金淋巴瘤（NHL)。SCT400抗原結(jié)合位點和抗體可變區(qū)氨基酸序列與利 妥昔單抗完全相同，恒定區(qū)與利妥昔單抗在重鏈CHl區(qū)域僅有一個氨基酸差異（V219A)已 經(jīng)開展了針對SCT400和利妥昔單抗在質(zhì)量、臨床前藥效、安全性評價等方面的比較研究工 作。研究結(jié)果證明二者的理化特性、生物活性、體內(nèi)外藥效和藥代動力學特征基本一致；臨 床前安全性評價結(jié)果也證實二者具有高度相似和可比性?；谝陨吓R床前數(shù)據(jù)和臨床研 究，在中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院和307醫(yī)院展開了多中心、開放I期臨床藥代動力學試驗。
[0005] 目前目前已經(jīng)由多篇文獻報道應(yīng)用ELISA的方法檢測人血清中利妥昔單抗的濃 度[Maloney et al, 1994 ；Berinstein et al, 1998 ；Tobinai et al, 1998 ；Iacona et al, 2000，Buem et al，2004;Cragg et al，2004;Hampson et al，2010]。但文獻報道的多克隆 抗體，如純化的多克隆羊抗IDEC C2B8抗體血清、羊抗人IgG結(jié)合辣根過氧化氫酶、商品化 的兔抗鼠 IgG或者是過氧化氫酶標記的羊抗鼠 IgG被用于一系列利妥昔單抗的臨床研究 中，但是在這些臨床研究中樣本檢測前需要稀釋1/20000倍以上因為缺少特異性，且與正 常人IgG有交叉反應(yīng)。因為這個原因，Cragg提出了使用特異的mAb MB2A4直接檢測利妥 昔單抗的濃度，這種分析方法呈現(xiàn)出高的特異性，但是需要進行高通量篩選、費用昂貴因此 很難被廣泛運用。并且這種抗獨特性抗體只能檢測游離的利妥昔單抗的濃度不能檢測循環(huán) 的⑶20-利妥昔單抗的混合濃度。
[0006] 參考文獻
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 為了準確的檢測血清藥物濃度的變化，更好的分析抗CD20抗體的藥代動力學特 征，本文提供了新的定量測定血清中抗CD20單克隆抗體（尤其是SCT400)濃度的ELISA方 法。
[0021] 在一些實施方案中，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)所述方法不需要高倍稀釋，檢測抗CD20單克 隆抗體具備高特異性。在一些實施方案中，所述方法不與正常人IgG產(chǎn)生交叉反應(yīng)。在一 些實施方案中，所述方法避免了使用單克隆抗體如mAb MB2A4檢測所必需的高通量篩選、費 用昂貴和難以廣泛運用等缺陷。
[0022] 因此，本申請?zhí)峁┝藴y定血清中抗CD20單克隆抗體濃度的酶聯(lián)免疫吸附測定法， 所述測定法使用抗CD20單克隆抗體的F (ab') 2片段免疫動物獲得的多克隆抗體作為捕獲 抗體，使用IgG_F(ab' )2抗體作為檢測抗體。
[0023] 在一些實施方案中，所述多克隆抗體如下獲得：使用胃蛋白酶消化抗CD20單克隆 抗體，去除Fc片段（例如可通過親和層析柱去除混合液中的Fc片段），收集F(ab' )2片 段，優(yōu)選對所述F(ab' )2片段進行純化（例如可通過超濾和采用層析柱進行純化），然后 用于免疫動物。
[0024] 在一些實施方案中，所述免疫動物為兔。
[0025] 在一些實施方案中，在檢測前對血清樣品進行稀釋的步驟。在一些實施方案中，所 述方法不需要高倍稀釋，檢測抗CD20單克隆抗體具備高特異性，例如，對樣品的稀釋可低 于20000倍，例如18000倍以下，17000倍以下，16000倍以下，15000倍以下，14000倍以下， 13000倍以下，12000倍以下，11000倍以下，10000倍以下，9000倍以下，8000倍以下，7000 倍以下，6000倍以下，5000倍以下，4000倍以下，3000倍以下，2000倍以下，1800倍以下， 1700倍以下，1600倍以下，1500倍以下，1400倍以下，1300倍以下，1250倍以下，1200倍以 下，1180倍以下，1150倍以下，1120倍以下，1100倍以下，1080倍以下，1050倍以下，1020倍 以下，或1000倍以下；所述稀釋倍數(shù)可以在200倍以上，300倍以上，400倍以上，500倍以 上，600倍以上，700倍以上，800倍以上，850倍以上，900倍以上，950倍以上，980倍以上，或 1000倍以上。在一些實施方案中，血清樣品的稀釋范圍可在上述范圍內(nèi)任意選擇。
[0026] 在一些實施方案中，所述血清包括人血清。
[0027] 在一些實施方案中，所述抗⑶20單克隆抗體包括SCT400和利妥昔單抗，優(yōu)選單克 隆抗體SCT400。
[0028] 在一些實施方案中，所述IgG_F(ab' )2抗體包括兔抗鼠 IgG_F(ab' )2抗體。在 一些實施方案中，IgG-Ffeb' )2抗體可以進行標記，優(yōu)選所述IgG-Ffeb' )2抗體是HRP標 記的抗體。
[0029] 在一些實施方案中，所述測定法為定量測定法。
[0030] 在一些實施方案中，所述測定法的靈敏度可達0. 78ng/mL。
[0031] 在一些實施方案中，所述測定法的線性范圍在I. 56ng/ml?50ng/ml范圍內(nèi)。
[0032] 在一些實施方案中，在0. 1%空白血清檢測時，非相關(guān)人、鼠、嵌合IgG對檢測結(jié)果 無影響。
[0033] 因此，在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┑臏y定法檢測抗CD20單克隆抗體具備高特 異性。在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┑臏y定法不與正常人IgG產(chǎn)生交叉反應(yīng)。在一些實 施方案中，本申請?zhí)峁┑臏y定法避免了使用單克隆抗體如mAb MB2A4檢測所必需的高通量 篩選、費用昂貴和難以廣泛運用等缺陷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1 :血清中SCT400藥物濃度測定典型標準曲線（0? 39?50ng/ml)。
[0035] 圖2 :1-01受試者（250mg/m2)給藥后時間血清中SCT400隨時間變化的藥物濃 度-時間曲線。

【具體實施方式】
[0036] 為了更加清楚的對本發(fā)明進行說明，以下通過具體實施實例對本發(fā)明的具體實施 方式進行更為詳細的說明。但是應(yīng)該理解，以下所述具體實施實例僅用于本發(fā)明進行示例 性說明，而非用于本發(fā)明進行任何性質(zhì)限定，其中所用材料、試劑、儀器及操作條件僅為代 表性的，其并不限于所列舉的情況。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員通過閱讀以下說明可以對本 發(fā)明做出不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所限定的保護范圍的改動和改進，這些改動和改進也處于 本發(fā)明所要求保護的范圍內(nèi)。
[0037] 1 ?抗體篩選：
[0038] I. 1兔抗SCT400_F(ab ' )2多抗的生產(chǎn)與純化：將500 ii g胃蛋白酶 (sigma-aldrich，USA)用20mM醋酸鈉緩沖液稀釋好后，加入到50mgSCT400中，37°C孵育過 夜，加入2M Tris-HCl緩沖液進行終止。使用蛋白G親和層析柱去除混合液中的Fc片段，收 集含有F(ab' )2片段的溶液，進行超濾（30KDa孔徑，Miilipore，USA)。之后采用SEC-葡 聚糖凝膠200層析柱將SCT400F (ab' ) 2片段進一步純化。
[0039] 純化后的SCT400F(ab' )2片段皮下注射入新西蘭大白兔進行免疫，從而產(chǎn)生 抗-SCT400F(ab' )2抗體。收集兔血清，用蛋白G親和層析柱進行純化后，進行抗原親和層 析。為了減少兔抗體與人免疫球蛋白的交叉反應(yīng)，采用正常人血清來源的人免疫球蛋白偶 聯(lián)的親和層析柱進行純化。經(jīng)SDS-PAGE檢測兔抗體純度后，0D280測定蛋白質(zhì)含量。
[0040] I. 2HRP標記的兔抗鼠 IgG-F(ab2片段：HRP標記的兔抗鼠 IgG-F(ab2片段 購自Jackson Immuno Research,該試劑與人IgG抗體交叉反應(yīng)較低。
[0041] 1. 3流式細胞術(shù)：采用流式細胞術(shù)檢測SCT400及利妥昔單抗與細胞表面的⑶20 抗原結(jié)合是否具有差異。制備3管Daudi細胞,每管含有IX IO6個細胞,一管加入I ii g SCT400, 一管加入I ii g利妥昔單抗，剩余一管加入PBS作為陰性對照。4°C孵育20分鐘，用 ImL含有0. 5 % BSA的PBS洗滌細胞，800rpm離心5分鐘。之后采用FITC標記的鼠抗人IgG Fc二抗（義翹神州生物技術(shù)有限公司提供）在4°C孵育20分鐘。洗滌三次后，加入500 UL 0. 5% BSA-PBS重懸細胞，采用BD FACS Calibur流式細胞儀進行分析。
[0042] 2?方法驗證與結(jié)果
[0043] 2. 1.藥品與試劑：標準品：SCT400,由神州細胞工程有限公司提供。規(guī)格： 50mg (5ml)/瓶，批號：20120301。包被液（pH 9. 6碳酸鹽緩沖液）；磷酸鹽緩沖液（pH7. 4); 洗滌液（磷酸鹽緩沖液-〇. 05% Tween 20, pH7. 4);封閉液（含2%牛血清白蛋白的洗滌 液）；二抗稀釋液（0.5%牛血清白蛋白-PBS-Tween 20，pH7. 4);樣品稀釋液（0. 1%牛血清 白蛋白-PBS-Tween20，pH 7. 4) ;0. 1%人混合血清稀釋液；顯色液；終止液（2M硫酸）；包被 抗體：即兔抗SCT400-F(ab' )2多抗（0. 14mg/m2,批號：PH05SE0501);檢測抗體：即辣根過 氧化物酶標記的兔抗鼠 IgG-F(ab' )2(0. 5mg/ml，批號：96850)。
[0044] 2. 2設(shè)備與耗材：酶標儀：型號Multiskan GO, Thermo公司產(chǎn)品；渦旋混勻器：型 號QL-901，海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；Eppendorf單道、12道移液器；高吸附96 孔酶標板：Nunc公司產(chǎn)品等。
[0045] 2. 3ELISA測定操作步驟：用包被液稀釋兔抗SCT400-F(ab' )2多抗至750ng/ml， 以100 yl/孔加至96孔酶標板內(nèi)，4°C放置過夜。洗滌液300ul/孔，洗板3次。用含保護 劑的封閉液以300 iU/孔加至板內(nèi)，室溫放置1小時。干燥及真空包裝：室溫4小時后，于 吸水紙上拍干酶標板，之后將酶標板正向置于通風櫥中干燥1小時。取出后用鋁箔袋真空 包裝（每袋一板，加一袋干燥劑）。置4°C保存。將預(yù)包板從4°C取出后，300ul/孔，洗板 3次。將空白對照、標準品、質(zhì)控樣品及稀釋好的待檢樣品均以IOOiU/孔加至板內(nèi)，室溫 放置2小時。洗板5次，每次都需要在濾紙上拍干。再用二抗稀釋液將HRP標記的兔抗鼠 IgG-F (ab')2抗體稀釋4000倍，以100 iU/孔加至板內(nèi)，室溫放置1小時。洗板5次，每次 都需要在濾紙上拍干。以100 Ul/孔加入臨時配制的顯色液，室溫放置20min。以50 iil/ 孔加入終止液終止反應(yīng)。混勻后立即將酶標板放入酶標儀中，選擇450nm為測定波長測定 吸光度。
[0046] 2. 4方法學驗證
[0047] 參照FDA及CFDA生物樣本檢測指導原則，方法學驗證包括方法的靈敏度、特異性、 標準曲線與線性范圍、精密度與準確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋效應(yīng)、方 法學質(zhì)控等方面。
[0048] 2. 4. 1標準曲線、線性范圍、質(zhì)控樣品和定量下限
[0049] 標準曲線是采用含0. 1%空白人血清的樣品稀釋液稀釋SCT400標準品，配制不 同濃度的SCT400,使標準曲線各濃度點的終濃度分別為50、25、12. 5、6. 25、3. 125、1. 56ng/ ml, LLOQ為I. 56ng/ml，ULOQ為50ng/ml標準曲線外帶一個Ong/ml的濃度點，用于標準曲 線的本底扣除參比值。QC高、中、低濃度分別為：40、12. 5和3. 125ng/ml。
[0050] 以0? 1 %血清中配置的SCT400的梯度濃度（取log)為橫坐標，濃度對應(yīng)的0? D值 為縱坐標，采用四參數(shù)方法￥ = \*(仏142)八乂42)-1)八（1/?進行回歸計算，所得回歸 方程即為標準曲線。定量下限是標準曲線上的最低濃度點。標準曲線上的低濃度點誤差值 不得超過20 %，中、高濃度點的誤差值不超過15 %，且至少75 %的濃度點在合格范圍內(nèi)。
[0051] 典型的標準曲線圖如圖1所示。
[0052] 2. 4. 2分析方法的準確度和精密度
[0053] 取0. 1%空白人血清的樣品稀釋液稀釋，制備高、中、低三個濃度點的QC樣品40， 12. 5和3. 125ng/ml，每個濃度平行五個樣品測定，依法與標準曲線同批測定，以同批的標 準曲線計算QC樣品濃度。連續(xù)進行三批試驗，根據(jù)QC樣品的結(jié)果，求算批內(nèi)及批間的精密 度和準確度。結(jié)合三批試驗數(shù)據(jù)進行方法準確度與精密度的計算。精密度要求高、中濃度 點的批內(nèi)和批間相對標準偏差（RSD% )不超過15%，低濃度點的批內(nèi)和批間相對標準偏差 (RSD%)不超過20%。高、中濃度點準確度（RE%)的均值應(yīng)在理論值的±15%以內(nèi)，低濃 度點的均值在±20%以內(nèi)。結(jié)果見表1。
[0054] 表1、檢測0. 1 %血清樣品中SCT400分析方法準確度和精密度
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 測定血清中抗CD20單克隆抗體濃度的酶聯(lián)免疫吸附測定法，所述測定法使用 抗CD20單克隆抗體的F(ab ' )2片段免疫動物獲得的多克隆抗體作為捕獲抗體，使用 IgG-F (ab' ) 2抗體作為檢測抗體。
2. 權(quán)利要求1所述的測定法，其中所述多克隆抗體如下獲得：使用胃蛋白酶消化抗 ⑶20單克隆抗體，去除Fc片段，收集F(ab' )2片段，優(yōu)選對所述F(ab' )2片段進行純化， 然后用于免疫動物，優(yōu)選兔。
3. 權(quán)利要求1-2任一項所述的測定法，其中包括在檢測前對血清樣品進行稀釋的步 驟，優(yōu)選稀釋低于20000倍，例如稀釋200至18000倍，300至15000倍，400至12000倍，500 至 10000 倍，600 至 8000 倍，700 至 6000 倍，800 至 3000 倍，900 至 2000 倍，950 至 1500 倍， 980至1200倍等。
4. 權(quán)利要求1-3任一項所述的測定法，其中所述血清包括人血清。
5. 權(quán)利要求1-4任一項所述的測定法，其中所述抗⑶20單克隆抗體包括SCT400和利 妥昔單抗，優(yōu)選SCT400。
6. 權(quán)利要求1-5任一項所述的測定法，其中所述IgG-F(ab' )2抗體包括兔抗鼠 I gG-F (ab '）2抗體，優(yōu)選所述I gG-F (ab '）2抗體是HRP標記的抗體。
7. 權(quán)利要求1-6任一項所述的測定法，其中所述測定法為定量測定法。
8. 權(quán)利要求1-7任一項所述的測定法，其中所述測定法的靈敏度達0. 78ng/mL。
9. 權(quán)利要求1-8任一項所述的測定法，其中所述測定法的線性范圍在1. 56ng/ml? 50ng/ml范圍內(nèi)。
10. 權(quán)利要求1-9任一項所述的測定法，其中在0. 1%空白血清檢測時，非相關(guān)人、鼠、 嵌合IgG對檢測結(jié)果無影響。
【文檔編號】G01N33/577GK104391114SQ201410640266
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】石遠凱, 謝良志, 韓曉紅, 蓋文琳, 宋媛媛, 李丹, 王寅 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院, 神州細胞工程有限公司