基于uplc-q-tof-ms技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分的快速分類及鑒定的制作方法
【專利摘要】基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分的快速分類及鑒定，旨在以苦碟子注射液中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類為研究對(duì)象，基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)苦碟子注射中化學(xué)成分的快速分類及鑒定。本研究首先對(duì)苦碟子注射液中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類成分進(jìn)行信息整合，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)這四大類物質(zhì)的診斷碎片及中性丟失的規(guī)律；同時(shí)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)不同類別化合物的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜分析，加以驗(yàn)證。然后，利用診斷碎片及中性丟失的方法作為篩選鑒定工具，構(gòu)建苦碟子注射液中化學(xué)成分快速分類及鑒定的方法。
【專利說(shuō)明】基于uplc-q-tof-ms技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分 的快速分類及鑒定
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及一種中藥注射液中化學(xué)成分的鑒別，即基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦 碟子注射液中化學(xué)成分的快速分類及鑒定。

【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)有技術(shù)中，苦碟子注射液為菊科苦荬菜屬植物抱莖苦荬菜[ZMris soflcAi/b/ia Zfeflce]全草經(jīng)提取加工制成。苦碟子的化學(xué)成分比較復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其成 分主要有萜類、黃酮類和香豆素類、留醇等。其中主要活性成分，由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán) 境等因素的影響，不同產(chǎn)地苦碟子所制成的注射液所含成分詫異很大。研究報(bào)道，從各種 動(dòng)植物中提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗病毒、抗輻射、降血脂、降血 糖、美容等廣泛的作用。
[0003] 苦碟子注射液（曾用名：碟脈靈注射液）列入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品（國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20025450)，由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0004] 處方：抱莖苦荬菜lOOOg，制成1000ml。
[0005] 制法：取抱莖苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小時(shí)，第二次〇. 5小時(shí)，合并煎液， 濃縮至每Iml相當(dāng)于原生藥0. 5g，放冷至40°C以下，在攪拌下加10%氧化I丐乳調(diào)節(jié)pH值至 10,放置12小時(shí)，離心，離心沉淀物稱重，懸浮于5. 3倍量95%乙醇中（使含醇量達(dá)80%)，力口 50%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 - 4,充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)完全，離心，離心液加40%氫氧化鈉溶液 中和pH值至7. 0,濾過(guò)，濾液回收乙醇，并揮盡乙醇，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原生 藥4g，置-5°C以下放置12小時(shí)以上，濾過(guò)，濾液加0. 1 - 0. 2%藥用活性炭粉末，煮沸15分 鐘，置-5°C以下放置24小時(shí)以上，濾過(guò)，濾液加注射用水稀釋至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至7. 0 - 7. 5,濾過(guò)，灌封，滅菌即得。性狀：本品為淺黃棕色至黃棕色的澄明液體。
[0006] 含量測(cè)定：本品每IOml含總黃酮以無(wú)水蘆?。–27H3tlO 16)計(jì)，不得少于4. Omg。含抱 莖苦荬菜以腺苷（CltlH12N5O4)計(jì)，不得少于0? 025mg。
[0007] 功能主治：活血止痛，清熱祛瘀。用于瘀血閉阻的胸痹，證見(jiàn)：胸悶、心痛，口苦，舌 暗紅或存瘀斑等。適用于冠心病、心絞痛見(jiàn)上述病狀者。亦可用于腦梗塞者。
[0008] 用法用量：靜脈滴注，一次10 - 40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0. 9%氯化鈉注射 液稀釋至250 - 500ml后應(yīng)用；14天為一療程；或遵醫(yī)囑。
[0009] 規(guī)格：每支裝（I) 10ml，（2) 20ml，（3) 40ml。
[0010]目前許多分辨率高、靈敏度好的分析儀器如：GC-MS和LC-MS被用來(lái)對(duì)中藥單味 藥或復(fù)方成分進(jìn)行全譜表征。在藥物分析過(guò)程中，我們通常采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)藥 物進(jìn)行全譜掃描，然而基于UPLC-Q-T0F/MS的分析方法擁有譜圖復(fù)雜，信息量大等問(wèn)題，因 此需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行信息的挖掘與整合。如今，隨著數(shù)據(jù)后處理技術(shù)的 不斷發(fā)展，診斷碎片過(guò)濾（Diagnostic fragments filter, PIF)與中性丟失過(guò)濾（Neutral loss，NIF)在化合物的篩選與鑒別方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)：齊連文等，基于快速液 相-飛行時(shí)間-質(zhì)譜對(duì)人身皂苷進(jìn)行表征，[J].色譜A. 2012. 1230 : 93 - 99)。由于同 一類別的化合物一般具有相同或者相似的公共骨架，分子可在質(zhì)譜中裂解成碎片，可根據(jù) 其中一些碎片推斷出裂解的類型，進(jìn)而判斷分析進(jìn)入質(zhì)譜儀的分子，這些碎片被稱為特征 碎片；中性丟失指的是分子離子峰與高質(zhì)荷比區(qū)域的一些碎片峰的質(zhì)荷比的差值，這些中 性碎片的丟失在高質(zhì)荷比區(qū)域有很重要的鑒定價(jià)值(見(jiàn)：謝彤等，基于麥冬的體內(nèi)中藥藥 動(dòng)-藥效物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)與分類的理論方法.[J]色譜A，2012. 131(2) : 1747- 1824)。 由此可見(jiàn)，將診斷碎片與中性丟失相結(jié)合的方法，將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中復(fù)雜化 學(xué)成分快速準(zhǔn)確的分類與鑒定。中藥注射液的化學(xué)成分表征是尋找藥物有效成分及確認(rèn)藥 物效應(yīng)的基礎(chǔ)，然而通過(guò)傳統(tǒng)的液相色譜-紫外檢測(cè)的分析手段得到的化合物指紋圖譜往 往存在靈敏度低且專一性差，不能得到確切結(jié)構(gòu)信息的缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足，提供一種基于UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子 注射液中成分的快速分類及鑒定的方法，從而大大簡(jiǎn)化了苦碟子注射液分析過(guò)程中的工作 量，同時(shí)通過(guò)診斷碎片過(guò)濾策略及其它碎片與中性丟失分子的輔助分析，有利于復(fù)雜成分 的快速分類及鑒定。通過(guò)建立診斷碎片過(guò)濾策略及中性丟失過(guò)濾策略，并用于苦碟子注射 液指紋圖譜中的歸屬成分群的快速篩選，有效解決了中藥注射液因成分復(fù)雜造成的解析、 分類及鑒定困難的技術(shù)難題。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：基于UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué) 成分的快速分類及鑒定，其步驟如下：（1)對(duì)苦碟子注射液中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類 及核苷類成分進(jìn)行信息整合，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)這四類物質(zhì)的診斷碎片及中性丟失的規(guī)律；同時(shí) 采用UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)對(duì)不同類別化合物的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜分析，加以驗(yàn)證；（2)利用診 斷碎片及中性丟失作為篩選鑒定的工具，構(gòu)建苦碟子注射液中化學(xué)成分快速分類及鑒定的 方法；（3)基于UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)，取苦碟子注射液進(jìn)行指紋分析，快速提取并鑒定這四 類物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
[0013] 基于UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分的快速分類及鑒定，其 方法包括以下條件： UPLC :色譜柱為 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2. 1X50 mm, I. 7 Mm ;柱溫設(shè) 定為35°C;流動(dòng)相：水相為0. 05%甲酸水溶液，有機(jī)相為0. 05%甲酸乙腈溶液；流速：0. 3mL/ min ;米用梯度洗脫方式進(jìn)行色譜分尚，梯度程序如下：0_2min，2_2%B ;2_5min，2_9%B ; 5-10min,9-12%B ;10-16min,12-12%B ;16-19min,12-16% ;19-25min,16-20%B ;25-30min， 20-25%B ;30-32min，25-100%B ;32-34min，100-100%B ;34-36min，100-2%B ;36-38min， 2-2%B。
[0014] Q-TOF-MS :超高效液相色譜法耦合到Q-TOF-MS，配備電噴霧電離源，采用正離子 和負(fù)離子模式進(jìn)行掃描分析。
[0015] MS參數(shù)如下：干燥氣體溫度為325°C;干燥氣體流量為10毫升/分鐘；脫溶劑氣體 流量為600 L / h;毛細(xì)管電壓為3. 5 kV;碰撞誘導(dǎo)解離電壓為6 kV;碰撞能量10-20ev， 分別20-30ev和30-40ev ;霧化器，壓力為350 psi的蒸發(fā)氣；輔助氣體為高純氮?dú)猓粎⒖茧x 子來(lái)確保在光譜采集精度；數(shù)據(jù)采集的范圍是50到1000大。
[0016] 從苦碟子注射液中篩選并鑒定確認(rèn)了黃酮類化合物8種，分別是槲皮素、蘆丁、木 犀草素-7-0-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素-7-0-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-葡 萄糖醛酸苷、芹菜素；有機(jī)酸類化合物15種，分別為1-呋喃甲酸、3, 4-二羥基苯甲酸、4-甲 氧基肉桂酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡?？鼘幩帷?-咖啡?？鼘?酸、香草酸、阿魏?？鼘幩?、阿魏酸及其兩個(gè)同分異構(gòu)體、2-甲氧基肉桂酸、菊苣酸；氨基酸 類化合物6種，分別為絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸；核苷類化合物4 種，分別為尿苷、尿嘧啶、腺苷、鳥苷。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1、UPCL-Q-T0F-MS高分辨質(zhì)譜，可以得到更多的化合物信息。2、 本發(fā)明通過(guò)對(duì)苦碟子注射液中成分的的綜合分析與系統(tǒng)整合，根據(jù)同一類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)共性 和不同類別之間的特異性，借助數(shù)據(jù)后處理技術(shù)診斷碎片過(guò)濾及中性丟失過(guò)濾，建立快速 分類與鑒定的方法，這對(duì)復(fù)雜中藥注射液成分的分類、鑒定具有重要的意義。本發(fā)明一定程 度上可以解決中藥注射液復(fù)雜化學(xué)成分鑒定的關(guān)鍵難題一分類與識(shí)別，有力的推動(dòng)了中藥 成分快速鑒定的發(fā)展；此外，本發(fā)明也為其他復(fù)雜樣本中篩選目標(biāo)成分提供了一條新的思 路。3、UPLC 條件：米用 Waters Acquity UPLC BEH C18 Column, 2. I X 50 mm, I. 7 Mm 的 色譜柱；柱溫在35°C時(shí)，色譜峰的分離度、峰型以及基線穩(wěn)定性均優(yōu)于其他溫度；采用梯度 洗脫，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：A相為0. 05%甲酸水溶液，B相為0. 05%甲酸乙腈溶液的流動(dòng)相系 統(tǒng)可以使譜圖上各主要色譜峰達(dá)到較好的分離度，且保留時(shí)間適中，出峰時(shí)間短；流動(dòng)相的 流速在某種程度上對(duì)指紋圖譜的分離度產(chǎn)生一定的影響，流速較快或較慢時(shí)，都不能使各 種成分不能很好的分離開來(lái)，經(jīng)過(guò)一系列色譜條件適用性的考察，我們采用流速為〇. 3 mL/ min;進(jìn)樣量過(guò)小可能導(dǎo)致某些成分因含量低，響應(yīng)低而達(dá)不到儀器檢測(cè)限，相反進(jìn)樣量過(guò) 大會(huì)導(dǎo)致色譜柱超載，從而使色譜峰峰寬增加或色譜峰峰尖鈍化，并影響柱的壽命，綜合考 量選擇進(jìn)樣量為7ul。4、針對(duì)苦碟子注射液中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類四類 成分，采用診斷碎片過(guò)濾策略及中性丟失篩選策略對(duì)通過(guò)UPLC-Q-T0F-MS得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行 分析。與傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析模式相比，使用診斷碎片及中性丟失的篩選方法，首先，減少了繁 冗復(fù)雜的工作量，有效的剔除了一些雜質(zhì)離子，簡(jiǎn)化了利用碎片信息鑒別某一化合物的步 驟；其次，有助于分析過(guò)程中成分的歸屬及分類，我們可以僅根據(jù)某個(gè)含有奎寧酸碎片離子 的化合物將其歸納為含有奎寧酸基團(tuán)的有機(jī)酸；另外，從一定程度上有利于發(fā)現(xiàn)某類成分 中的未知成分，根據(jù)總結(jié)的診斷碎片及一定分子量的中性丟失，可以初步判斷某一成分所 屬類別，進(jìn)一步綜合其它碎片信息及中性丟失的信息可以明確判斷其分子量大小及結(jié)構(gòu)組 成?？偠灾?，診斷碎片過(guò)濾策略及中性丟失過(guò)濾策略，在苦碟子注射液的分析過(guò)程中的使 用，大大簡(jiǎn)化了工作量，同時(shí)通過(guò)診斷碎片的篩選及其它碎片與中性丟失的輔助分析，使復(fù) 雜成分的快速分類及鑒定成為可能。
[0018] 下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是苦碟子注射液正負(fù)離子模式下的的總離子流圖。
[0020] 圖2是苦碟子注射液正負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖流圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 基于UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中成分的快速分類及鑒定： 1刖目 苦碟子注射液為菊科苦荬菜屬植物抱莖苦荬菜[Zreri1S soflcAifbyia Zfeflce]全草經(jīng) 提取加工制成。依照其所屬化學(xué)物質(zhì)組將已確認(rèn)的化合物建立包含化學(xué)名、分子式、結(jié)構(gòu) 式、精確質(zhì)量數(shù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，總結(jié)具有相應(yīng)公共骨架的某類化合物的特征碎片及中性丟失，應(yīng) 用于指紋圖譜原始數(shù)據(jù)的解析，力求達(dá)到快速、準(zhǔn)確分類及鑒定的目的。如今，隨著數(shù)據(jù)后 處理技術(shù)的不斷發(fā)展，診斷碎片過(guò)濾（Diagnostic fragments filter, PIF)與中性丟失過(guò) 濾（Neutral loss，NIF)在化合物的篩選與鑒別方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。由于同一類別的 化合物一般具有相同或者相似的母核結(jié)構(gòu)，分子可在質(zhì)譜中裂解成碎片，可根據(jù)其中一些 碎片推斷出裂解的類型，進(jìn)而判斷分析進(jìn)入質(zhì)譜儀的分子，這些碎片被稱為特征碎片；中性 丟失指的是分子離子峰與高質(zhì)荷比區(qū)域的一些碎片峰的質(zhì)荷比的差值，這些中性碎片的丟 失在高質(zhì)荷比區(qū)域有很重要的鑒定價(jià)值。由此可見(jiàn)，將診斷碎片與中性丟失相結(jié)合的方法， 將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中復(fù)雜成分快速準(zhǔn)確的分類與鑒定。
[0022] 構(gòu)建苦碟子注射液中物質(zhì)快速分類及鑒定的篩選方法，為中藥注射液復(fù)雜成分的 分類及鑒定提供一條快速、準(zhǔn)確、可行的方法。首先，通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中 黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類成分進(jìn)行信息整合，同時(shí)采用uplc-q-tof-ms技術(shù)結(jié) 合不同碰撞能量對(duì)不同類別化合物的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)這四大類物質(zhì)的診 斷碎片及中性丟失的規(guī)律。其次，利用診斷碎片及中性丟失作為篩選鑒定的工具，構(gòu)建苦碟 子注射液中復(fù)雜成分快速分類及鑒定的方法。最后，基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，取苦碟子注 射液進(jìn)行指紋分析，快速提取并鑒定四大主要類別的物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。本發(fā)明通過(guò)對(duì) 苦碟子注射液中成分的的綜合分析與系統(tǒng)整合，根據(jù)同一類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)共性和不同類別之 間的特異性，借助數(shù)據(jù)后處理技術(shù)診斷碎片過(guò)濾及中性丟失過(guò)濾（DI-MDF、NIF)，建立快速 分類與鑒定的方法，這對(duì)復(fù)雜中藥注射液成分的分類、鑒定具有重要的意義。本發(fā)明一定程 度上可以解決中藥注射液復(fù)雜化學(xué)成分鑒定的關(guān)鍵難題一分類與識(shí)別，有力的推動(dòng)了中藥 成分快速鑒定的發(fā)展；此外，本發(fā)明也為其他復(fù)雜樣本中篩選目標(biāo)成分提供了一條新的思 路。
[0023] 實(shí)驗(yàn)和方法 2. 1標(biāo)準(zhǔn)品和試劑 苦碟子注射液（批號(hào)111201)由華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司提供（中國(guó)吉林);甲酸(分析純） 購(gòu)自化學(xué)試劑一廠（中國(guó)南京）；甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭∕erck, Darmstadt,德國(guó)）；木犀草 素-7-0-0 -D-批喃葡萄糖苷、蘆?。ㄖ袊?guó)藥品牛物制品鑒定所0080-970);脯氨酸、纈氨酸 (中國(guó)藥品生物制品鑒定所140624-200805);尿苷（SIGMA-ALDRICH)、腺嘌呤（中國(guó)藥品生物 制品鑒定所）；單咖啡酰基酒石酸(上海源葉生物科技有限公司、批號(hào)PA0805RA13);綠原酸 (天津一方科技有限公司10081444)阿魏酸（中國(guó)藥品生物制品鑒定所110773-201012) 2. 2樣品的制備 取吉林通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的苦碟子注射液（批號(hào)111201)兩支，混勻，經(jīng) 0. 22Mm的微孔濾膜過(guò)濾，待進(jìn)樣。
[0024] 和MS條件 UPLC:色譜柱為 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2.1X50 mm, 1.7 Mm;柱溫 設(shè)定為35°C;流動(dòng)相：水相（A)為0. 05%甲酸水溶液，有機(jī)相（B)為0. 05%甲酸乙腈溶液；流 速：0. 3mL/min。采用梯度洗脫方式進(jìn)行色譜分離，梯度程序如下：〇-2min，2-2%B;2-5min， 2-9%B ;5-10min，9-12%B ;10-16min，12-12%B ;16-19min，12-16% ;19-25min，16-20%B ; 25-30min,2〇-25%B ；3〇-32min,25-100%B ；32-34min,100-100%B ；34-36min,10〇-2%B ； 36_38min，2_2%B。
[0025] Q-TOF-MS :超高效液相色譜法耦合到Q-TOF-MS，配備電噴霧電離源（ESI),采用正 離子和負(fù)離子模式進(jìn)行掃描分析。MS參數(shù)如下：干燥氣體溫度為325°C ;干燥氣體流量為 10毫升/分鐘；脫溶劑氣體流量為600 L / h ;毛細(xì)管電壓為3. 5 kV ;碰撞誘導(dǎo)解離電壓為 6 kV ;碰撞能量10-20ev，分別20-30ev和30-40ev ;霧化器，壓力為350 psi的蒸發(fā)氣；輔 助氣體為高純氮?dú)猓粎⒖茧x子（[M + H] + = 556. 2771，[MH] - = 554. 26)來(lái)確保在光譜采 集精度。數(shù)據(jù)采集的范圍是50到1000大。
[0026] 數(shù)據(jù)分析 進(jìn)樣結(jié)束后，通過(guò)MassLynx軟件(版本4. 1)對(duì)峰值進(jìn)行檢測(cè)、校準(zhǔn)、采集得到原始數(shù) 據(jù)。參數(shù)如下：保留時(shí)間：0-40 ;質(zhì)量：0-1000 ;消除噪聲水平：6。然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和轉(zhuǎn) 換成Excel格式，含有大量信息，包括保留時(shí)間、m/z值及各組峰面積。輸出的數(shù)據(jù)通過(guò)處 理得到目標(biāo)化合物。最后，由數(shù)據(jù)庫(kù)確定提取目標(biāo)化合物。
[0027] 結(jié)果與討論 3. I UPLC-MS條件的優(yōu)化 中藥注射液的化學(xué)成分表征是尋找藥物有效成分及確認(rèn)藥物效應(yīng)的基礎(chǔ)，通過(guò)傳統(tǒng)的 液相色譜-紫外檢測(cè)的分析手段得到的化合物指紋圖譜往往存在靈敏度低且專一性差，不 能得到確切結(jié)構(gòu)信息的缺點(diǎn)，因而我們所使用的為UPCL-Q-T0F-MS高分辨質(zhì)譜，以求得到 更多的化合物信息。
[0028] UPLC條件：本實(shí)驗(yàn)我們主要分析苦碟子注射液中的黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類 及核苷酸類幾大類成分，綜合幾類化合物的物理及化學(xué)性質(zhì)，使用反相高效液相色譜進(jìn)行 指紋圖譜檢測(cè)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，我們采用Waters Acquity UPLC BEH C18 Column, 2.1 X 50 mm，1.7 Mm的色譜柱；同樣，柱溫的選擇與恒定是影響指紋圖譜技術(shù)穩(wěn)定的主要因素之 一，過(guò)高或過(guò)低的柱溫都會(huì)影響色譜峰的分離效果，引起色譜峰保留時(shí)間的改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明柱溫在35°C時(shí)，色譜峰的分離度、峰型以及基線穩(wěn)定性均優(yōu)于其他溫度；再者，為使注 射液中各成分分離完全，出峰時(shí)間縮短，且具有相對(duì)穩(wěn)定的保留時(shí)間，我們采用梯度洗脫， 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：A相為0. 05%甲酸水溶液，B相為0. 05%甲酸乙腈溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)可以 使譜圖上各主要色譜峰達(dá)到較好的分離度，且保留時(shí)間適中，出峰時(shí)間短；然后，流動(dòng)相的 流速在某種程度上對(duì)指紋圖譜的分離度產(chǎn)生一定的影響，流速較快或較慢時(shí)，都不能使各 種成分不能很好的分離開來(lái)，經(jīng)過(guò)一系列色譜條件適用性的考察，我們采用流速為〇. 3 mL/ min;最后，雖然進(jìn)樣量的大小對(duì)指紋圖譜的結(jié)果影響不顯著，但進(jìn)樣量過(guò)小可能導(dǎo)致某些 成分因含量低，響應(yīng)低而達(dá)不到儀器檢測(cè)限；相反進(jìn)樣量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致色譜柱超載，從而使色 譜峰峰寬增加或色譜峰峰尖鈍化，并影響柱的壽命，綜合考量我們進(jìn)樣量為7ul。
[0029] MS條件：首先，為了找到相應(yīng)適合苦碟子注射液中成分的離解模式，分別于正、負(fù) 離子模式下進(jìn)樣，在總離子流圖中發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸類物質(zhì)基本只在負(fù)離子模式下出峰；黃酮類 物質(zhì)雖然在正負(fù)離子模式下都有出峰行為，但在正離子模式下出現(xiàn)的成分明顯多于負(fù)離子 模式；氨基酸類物質(zhì)則在正負(fù)離子模式下有相似的出峰行為，核苷類物質(zhì)也主要在正離子 模式下出峰。同時(shí)參照對(duì)照品的質(zhì)譜行為，選用兩種模式同時(shí)進(jìn)樣?？嗟幼⑸湟赫?fù)離 子模式下的的總離子流圖（TIC)及質(zhì)譜圖流圖分別見(jiàn)圖1及圖2。其次，碰撞電壓的選擇： 分子母離子進(jìn)入質(zhì)譜后，在碰撞電壓的作用下裂解為不同程度的子離子，值得注意的是，碎 片離子受能量碰撞的影響較大，碰撞能量過(guò)低可能導(dǎo)致碎片離子豐度過(guò)高，碰撞能量過(guò)高 可能導(dǎo)致碎片離子斷裂為其他離子，因此設(shè)置單一的碰撞能量會(huì)導(dǎo)致碎片離子信息的缺 失。因而，為了得到理想豐度的碎片離子，我們對(duì)碰撞能量進(jìn)行分級(jí)，碰撞電壓分別設(shè)置為 為 10-20V，20-30V，30-40V。
[0030]結(jié)果： 通過(guò)對(duì)對(duì)照品的質(zhì)譜碎片信息及現(xiàn)有參考文獻(xiàn)中的碎片信息進(jìn)行整合及規(guī)律總結(jié)，我 們使用診斷碎片過(guò)濾及中性丟失過(guò)濾的方法對(duì)分子母離子及碎片離子進(jìn)行提取及鑒定，由 此對(duì)苦碟子注射液中的4類33種化合物進(jìn)行了快速鑒定，包括黃酮類化合物8種，分別是 槲皮素、蘆丁、木犀草素-7-0-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素-7-0-葡萄糖苷、 芹菜素-7-0-葡萄糖醛酸苷、芹菜素；有機(jī)酸類化合物15種，分別為1-呋喃甲酸、3, 4-二羥 基苯甲酸、4-甲氧基肉桂酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡酰奎寧酸、 5-咖啡?？鼘幩?、香草酸、阿魏?？鼘幩?、阿魏酸及其兩個(gè)同分異構(gòu)體、2-甲氧基肉桂酸、 菊苣酸；氨基酸類化合物6種，分別為絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸； 核苷類化合物4種，分別為尿苷、尿嘧啶、腺苷、鳥苷。（具體信息見(jiàn)表1) 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分的快速分類及鑒 定，其特征在于步驟如下：（1)對(duì)苦碟子注射液中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類 成分進(jìn)行信息整合，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)這四大類物質(zhì)的診斷碎片及中性丟失的規(guī)律；同時(shí)采用 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)不同類別化合物的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜分析，加以驗(yàn)證；（2)利用診斷 碎片及中性丟失作為篩選鑒定的工具，構(gòu)建苦碟子注射液中化學(xué)成分快速分類及鑒定的方 法；（3)基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，取苦碟子注射液進(jìn)行指紋分析，快速提取并鑒定這四類 物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
2. 按照權(quán)利要求1所述的基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化學(xué)成分的 快速分類及鑒定，其特征在于包括以下條件： UPLC:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2. 1X50 mm, 1.7 Mm;柱溫設(shè) 定為35°C;流動(dòng)相：水相為0. 05%甲酸水溶液，有機(jī)相為0. 05%甲酸乙腈溶液；流速：0. 3mL/ min ;米用梯度洗脫方式進(jìn)行色譜分尚，梯度程序如下：0_2min，2_2%B ;2_5min，2_9%B ; 5-10min,9-12%B ;10-16min,12-12%B ;16-19min,12-16% ;19-25min,16-20%B ;25-30min， 20-25%B ;30-32min，25-100%B ;32-34min，100-100%B ;34-36min，100-2%B ;36-38min， 2-2%B ； Q-TOF-MS :超高效液相色譜法耦合到Q-TOF-MS，配備電噴霧電離源，采用正離子和負(fù) 離子模式進(jìn)行掃描分析； MS參數(shù)如下：干燥氣體溫度為325°C ;干燥氣體流量為10毫升/分鐘；脫溶劑氣體流 量為600 L / h;毛細(xì)管電壓為3. 5 kV;碰撞誘導(dǎo)解離電壓為6 kV;碰撞能量10-20ev，分 另ij 20-30ev和30-40ev ;霧化器，壓力為350 psi的蒸發(fā)氣；輔助氣體為高純氮?dú)?；參考離子 來(lái)確保在光譜采集精度；數(shù)據(jù)采集的范圍是50到1000大。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)苦碟子注射液中化 學(xué)成分的快速分類及鑒定，其特征在于從苦碟子注射液中篩選并鑒定確認(rèn)了黃酮類化合 物8種，分別是槲皮素、蘆丁、木犀草素-7-0-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜 素-7-0-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-葡萄糖醛酸苷、芹菜素；有機(jī)酸類化合物15種，分別為 1-呋喃甲酸、3, 4-二羥基苯甲酸、4-甲氧基肉桂酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎 寧酸、4-咖啡?？鼘幩?、5-咖啡?？鼘幩?、香草酸、阿魏?？鼘幩?、阿魏酸及其兩個(gè)同分異 構(gòu)體、2-甲氧基肉桂酸、菊苣酸；氨基酸類化合物6種，分別為絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨 酸、纈氨酸、異亮氨酸；核苷類化合物4種，分別為尿苷、尿嘧啶、腺苷、鳥苷。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK104359968SQ201410639878
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】李遇伯, 袁磊, 楊彬, 鄒敬韜 申請(qǐng)人:通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司