一種提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種厭氧條件下，利用惰氣加壓，以同位素輻射提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法。將待測蛋白溶解于氘代試劑中，溶液體系充惰性氣體以增加壓力至0.15-1.0MPa。放射源選用鈷-60、銫-137等放射性同位素，劑量在5-500kGy范圍內(nèi)。所檢測蛋白基本涵括所有蛋白種類，交換率以質(zhì)譜法檢測。
【專利說明】一種提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用厭氧狀態(tài)下加壓，同位素輻射提供額外能量，用以提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法。本發(fā)明屬于化學(xué)反應(yīng)熱力學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]處于自然狀態(tài)的蛋白一般都具有緊致的折疊結(jié)構(gòu)。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主鏈上的α -位氫原子由于折疊或者螺旋構(gòu)象，而處于不同的空間位置。在厭氧條件下，放射性同位素可以通過輻射，引發(fā)氨基酸片段的α-位氫原子轉(zhuǎn)移，形成α-碳自由基中心。同時，在一定幾率上，如果氨基酸片段的Ct -側(cè)鏈末端也含有氫原子，同樣的，在所述α-位側(cè)鏈末端也可以形成α-位側(cè)鏈自由基中心。輻射條件下的氘代試劑，在厭氧條件下也會形成氘原子自由基，可與氨基酸片段自由基(α -碳自由基或者α -側(cè)鏈自由基)成鍵(例如通過碳原子提供的sp3軌道成鍵)。這個過程，可以看做是蛋白質(zhì)主鏈的氫氘原子交換過程，這是一種自由基反應(yīng)，與傳統(tǒng)的酰胺氫原子交換存在著本質(zhì)區(qū)別。
[0003]氨基酸主鏈上質(zhì)子交換作用的有效部位由蛋白的精確構(gòu)造決定。所述的有效部位主要指蛋白質(zhì)主鏈上與酰胺N毗鄰的α-碳原子上的氫原子，或者是氨基酸片段的α-位側(cè)鏈。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶于D2O以及其他一些氘代試劑后，在自由基反應(yīng)條件下，將發(fā)生氫氘原子的交換。當(dāng)?shù)鞍滋幱诰o密折疊狀態(tài)下，只有較少數(shù)目的α-氫原子或末端氫原子可接觸到溶劑并參與質(zhì)子交換。所述的交換效率取決于α-氫原子處于蛋白質(zhì)折疊空間內(nèi)或是否參與蛋白質(zhì)之間的相互作用?？梢酝ㄟ^檢測確定蛋白質(zhì)不同序列片段的氫氘交換速率，從而判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中哪些部位參與了構(gòu)象變化并具有形成活性中心的可能以及潛在的蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)。α-氫原子的這種質(zhì)子交換反應(yīng)可以用作判斷、表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的探針應(yīng)用在酶活中心、藥物靶點(diǎn)的判定。
[0004]蛋白質(zhì)主鏈的同位素交換可由一維或者二維核磁進(jìn)行表征與測定，但研究者們更傾向于使用質(zhì)譜法，通過分子量增量和理論值的比值，直接計算氘氫交換率。對于大分子量的蛋白質(zhì)反應(yīng)體系，多采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Mald1-TOF)進(jìn)行測試，對于一般的小分子量蛋白質(zhì)片段例如酶等，離子阱質(zhì)譜和三重四級桿質(zhì)譜均可用來測定。
[0005]上述蛋白質(zhì)主鏈上氫氘原子自由基交換的反應(yīng)體系，一般在和蛋白質(zhì)樣品匹配的PH范圍，厭氧環(huán)境中，讓體系自行反應(yīng)，直至達(dá)到氫氘原子交換的熱力學(xué)平衡。這種傳統(tǒng)的讓質(zhì)子交換自然趨于平衡的反應(yīng)方法，盡管可以在保持蛋白質(zhì)樣品性質(zhì)不變的前提下，預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)與活性部位，但是反應(yīng)速度慢(> 30min)，交換率低(< 80% )。一種高效快速的氫氘原子交換方法，具有重要的研發(fā)意義并處于長期技術(shù)改進(jìn)中。
[0006]同位素輻射技術(shù)的應(yīng)用將科學(xué)上的理論推測在分子水平，甚至原子、原子核水平動態(tài)地進(jìn)行了核實，豐富了研究手段。同位素輻射技術(shù)在輻射育種、滅蟲殺菌、食品保鮮和水利工程等方面都已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。在化學(xué)反應(yīng)領(lǐng)域，輻射射線與物質(zhì)的相互作用，對放射源說，它是一種能量傳遞和能量損耗過程；對受照射體系來說，它是一種對外來能量的物理性反應(yīng)和吸收過程。對于蛋白質(zhì)而言，在接受同位素輻射的情況下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)接受能量而變得更易于改變構(gòu)象。同時額外的壓力，一方面使蛋白質(zhì)更易溶解于試劑，使蛋白質(zhì)構(gòu)象更趨向舒展；另一方面正壓使自由基中心在熱力學(xué)上更易發(fā)生；此外，惰氣加壓過程可促進(jìn)體系排除氧氣，維持厭氧環(huán)境。同位素輻射與氣體加壓聯(lián)用對蛋白質(zhì)氣代溶液體系中氫氣交換效率的影響未有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種利用厭氧狀態(tài)下，充入惰氣加壓，同位素輻射提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法。在本發(fā)明中，待檢測蛋白質(zhì)溶解于氘代試劑中而無需后步驟蛋白結(jié)晶。所述氘代試劑為一種特指的氘代試劑或者幾種氘代試劑的混合體系。氘代溶液的pH值，以待檢測蛋白的溶解性而定。
[0008]為了使反應(yīng)體系達(dá)到厭氧環(huán)境，向所述蛋白質(zhì)氘代溶液中充入氬氣大于20分鐘，再向所述蛋白質(zhì)氘代溶液充入N2O氣體大于15分鐘，所述蛋白質(zhì)氘代溶液含氧量小于300ppmo
[0009]溶解蛋白質(zhì)的同時，向蛋白質(zhì)的氘代溶液液面施加氣體壓力。所述施加氣體壓力方法為，以惰性氣體充入含有蛋白質(zhì)溶液的密閉容器。蛋白質(zhì)溶液體系壓力為
0.15-1.0MPa，優(yōu)選0.3-0.5MPa。所述惰性氣體為氦氣、氬氣、氮?dú)庵械囊环N或者其中兩種氣體的混合氣體，優(yōu)選為IS氣。
[0010]本發(fā)明的檢測對象包括為清蛋白、球蛋白、組蛋白、精蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、硬蛋白類、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金屬蛋白、磷蛋白的一種或者幾種。針對不同的檢測對象，所選用的氘代試劑為重水、氘代乙酸、氘代丙酮、氘代乙腈、氘代甲醇、氘代氯仿、氘代二氯甲烷、氘代正己烷、氘代正辛烷、氘代正戊烷、氘代四氫呋喃、氘代甲苯、氘代二甲苯、氘代苯甲酸中的一種或者其中幾種的混合溶液。檢測蛋白時，氘代溶劑的選擇依據(jù)之一是能讓待測蛋白完全溶解；氘代溶劑的選擇依據(jù)之一是不引起待測蛋白變性。
[0011]本發(fā)明的放射源來自于放射性同位素镅-241、鋇-133、鎘-109、锎-252、鈷-57、鈷-60、銫-137、銪-152、鐵-55、釓-153、氪-85、鈉-22、鎳-63、钷-147、釕-106、硒-75、鍶-90、鐿-169、銥-192中的一種或者幾種。優(yōu)選為鈷-60和銫-137。放射性同位素使用齊U量為lX10_4-lX104kGy，優(yōu)選為5_500kGy。檢測蛋白時，放射性同位素使用劑量的選擇依據(jù)之一是不會導(dǎo)致待測蛋白質(zhì)變性。
[0012]本發(fā)明中所述加壓條件下，同位素輻射提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法，氫氘原子轉(zhuǎn)換率在2min內(nèi)超過99%，所述交換效率以質(zhì)譜法檢測。其中，分子量大于5，000的蛋白質(zhì)樣品用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Mald1-TOF)進(jìn)行測試，分子量小于5，000的蛋白質(zhì)樣品用離子阱質(zhì)譜或者三重四級桿質(zhì)譜測定。交換率用如下公式計算，E= [ ) / (Hi100O7l; ~m0%) ] X 100 % ;其中E為氫氣原子交換率，m為即時取樣所得蛋白質(zhì)樣品分子質(zhì)量，Hic^為蛋白質(zhì)樣品初始分子量，為蛋白質(zhì)樣品α -位氫原或者α-位側(cè)鏈末端氫原子完全被氘原子取代后的分子量。

【專利附圖】

【附圖說明】

【具體實施方式】
[0013]用具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限制于此。
[0014]實施例1
[0015]在連有數(shù)顯壓力計的耐壓玻璃反應(yīng)容器中，將牛血紅蛋白溶解于重水(99.9%原子D)、氘代乙酸(98%原子D)和氘代甲醇(99.5%原子D)的混合溶液(體積比為95: 2: 3)中。充入氬氣30分鐘，再向所述蛋白質(zhì)氘代溶液充入N2O氣體20分鐘，所述蛋白質(zhì)氘代溶液含氧量=200ppm。溶液濃度為0.lmol/L,向體系充氬氣以使體系壓力達(dá)到
0.15MPa。放射源為鈷-60，劑量為5kGy。反應(yīng)2min，所得測試樣以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜表征。由公式E = [ (m-m0.^ ) / (Hi100O7l; ~m0%) ] X 100%計算得到,氫氣原子交換率為99.2%。
[0016]實施例2
[0017]在連有壓力計的四氟接口耐壓玻璃反應(yīng)容器中，將緩激肽溶解于重水(99.9%原子D)和氘代乙酸(98%原子D)的混合溶液(體積比為99: I)中，溶液濃度為0.2mol/L。充入氬氣25分鐘，再向所述蛋白質(zhì)氘代溶液充入N2O氣體25分鐘，所述蛋白質(zhì)氘代溶液含氧量=150ppm。向體系充氬氣以使體系壓力達(dá)到0.4MPa。放射源為銫-137，劑量為500kGy。反應(yīng)2min,所得測試樣以離子講質(zhì)譜表征。由公式E = [ ) / (m1QQ%-mQ% ) ] X 100%計算得到，氫氘原子交換率為99.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種提高蛋白質(zhì)在氘代試劑中氫氘原子交換效率的方法，其特征在于，蛋白質(zhì)氘代溶液處于厭氧狀態(tài)下，并同時處于加壓條件下，通過放射性同位素的輻射提供額外能量，促進(jìn)蛋白質(zhì)主鏈上的氫原子與氘原子的交換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)氘代溶液含氧量小于300ppm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，向所述蛋白質(zhì)氘代溶液中充入氬氣大于20分鐘，再向所述蛋白質(zhì)氘代溶液充入N2O氣體大于15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白質(zhì)的氘代溶液處于的壓力范圍為0.15-1.0Mpa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用非金屬導(dǎo)管向含有蛋白質(zhì)的氘代溶液的容器內(nèi)充入惰性氣體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，向含有蛋白質(zhì)的氘代溶液的容器內(nèi)充入的惰性氣體為氦氣、氬氣、氮?dú)庵械囊环N或者其中兩種氣體的混合氣體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述放射性同位素為镅-241、鋇-133、鎘-109、锎-252、鈷-57、鈷-60、銫-137、銪-152、鐵-55、釓-153、氪-85、鈉-22、鎳-63、钷-147、釕-106、硒-75、鍶-90、鐿-169、銥-192中的一種或者幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，放射性同位素輻射劑量為lX10_4-lX104kGy。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，放射性同位素輻射劑量為5-500kGy。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為清蛋白、球蛋白、組蛋白、精蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、硬蛋白類、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金屬蛋白、磷蛋白的中一種或者幾種。
【文檔編號】G01N30/06GK104198631SQ201410394622
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】賈明宏 申請人:賈明宏