一種己烯雌酚快速檢測卡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種己烯雌酚快速檢測卡,屬于農(nóng)產(chǎn)品違禁物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的己烯雌酚快速檢測卡，包括外殼，測試條，檢測窗孔，加樣孔，支承背板，硝酸纖維素膜，熒光素顆粒膜，樣品墊，吸水膜，檢測帶和質(zhì)控帶,檢測帶含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；質(zhì)控帶含肌動蛋白。本發(fā)明的檢測己烯雌酚具有敏度高、精確定量、特異性強、簡單方便和檢測時間短的優(yōu)點。
【專利說明】一種己烯雌酚快速檢測卡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種己烯雌酚快速檢測卡，是一種檢測己烯雌酚的檢測器具，屬于農(nóng)產(chǎn)品違禁物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]天然雌激素主要包括雌二醇、雌酮、雌三醇，而合成雌激素主要有己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚等，在農(nóng)業(yè)中主要用作口服避孕藥和家畜生長的同化激素，通過增強食欲、抑制發(fā)情、提高飼料轉(zhuǎn)化率和控制性別等作用，能達(dá)到大幅度地提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的目的，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中雌激素污染殘留呈上升趨勢。農(nóng)產(chǎn)品中的雌激素可以通過擾亂內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)的正常功能而對動物和人產(chǎn)生多種疾病，最主要表現(xiàn)在對生殖系統(tǒng)的影響:女性多出現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤，卵巢癌、乳腺癌等疾病。男性多出現(xiàn)睪丸癌、前列腺癌、精子的數(shù)量與質(zhì)量下降等癥狀。
[0003]外源雌激素在環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中含量很少(動物肌肉組織中類固醇激素以ng *kg-l到μ g.kg-1數(shù)量級存在)，加上本身化學(xué)性質(zhì)差異較大以及內(nèi)源性雌激素的影響，因此對檢測方法的靈敏度要求較高。目前用于農(nóng)產(chǎn)品中性激素檢測的方法主要包括儀器分析法、生物活性法和免疫分析法。
[0004]儀器分析法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，已被廣泛用于雌激素類等的測定。儀器分析法靈敏度高，能較準(zhǔn)確地定性定量，是實驗室進(jìn)行確證的標(biāo)準(zhǔn)方法。但該方法儀器成本較高，分析時間較長、操作較復(fù)雜，因此只適合實驗室確證用，并不適合基層普查使用。免疫層析技術(shù)具有成本低、速度快，特異性高等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于傳染病診斷、生殖生育監(jiān)測、藥物濫用等領(lǐng)域。雖然免疫層析具有如此吸引人的優(yōu)點，但其應(yīng)用也受到了一定限制，主要是因為目前在免疫層析中應(yīng)用的主要標(biāo)記物是膠體金，一般通過肉眼觀察進(jìn)行判斷結(jié)果，因此靈敏度不夠高，也無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因此對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中含量很低的雌激素己烯雌酚測定來說，普通的膠體金免疫層析很難達(dá)到靈敏度及定量的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能檢測己烯雌酚的檢測器具，直接應(yīng)用免疫學(xué)的方法檢測樣品中己烯雌酚的含量，克服現(xiàn)有色譜法檢測的操作繁瑣等缺點，建立基于免疫學(xué)特異性的高靈敏度的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種己烯雌酹快速檢測卡，其為在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼中設(shè)置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、熒光素顆粒膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜；熒光素顆粒膜為含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標(biāo)記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是:含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，含肌動蛋白質(zhì)控帶，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0007]采用上述己烯雌酚快速檢測卡，檢測樣品為環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品等，處理方法如下: 產(chǎn)品樣品粉碎后加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15 m i η，于4 °C、1 O O O r P m離心
15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
[0008]熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
[0009]在樣品吸收墊上滴加樣品，如果樣品中有己烯雌酚，則己烯雌酚經(jīng)層析作用移動到熒光素顆粒膜的時候就會和熒光素顆粒標(biāo)記的抗己烯雌酚抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并帶動熒光素顆粒標(biāo)記的質(zhì)控抗體一起在層析作用下上行。當(dāng)移動到檢測帶時，未被樣品中己烯雌酚結(jié)合的游離的熒光素顆粒標(biāo)記的抗己烯雌酚抗體就會和檢測帶上的偶聯(lián)在載體蛋白上的己烯雌酚結(jié)合，而有熒光信號。熒光素標(biāo)記的質(zhì)控抗體則被質(zhì)控帶上的質(zhì)控抗原捕獲，而有熒光信號。而樣品中己烯雌酚和熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體形成的復(fù)合物則被層析到吸水紙上。樣品中的己烯雌酚越多，則熒光素顆粒膜中剩余游離的熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體越少，結(jié)合到檢測帶上的熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體越少，熒光信號也就越弱，依此來檢測樣品中的己烯雌酚的含量。
[0010]本發(fā)明的檢測雌激素的試紙具有靈敏度高、精確定量、特異性強、簡單方便和檢測時間短的優(yōu)點。由于以熒光素代替了膠體金作為標(biāo)記物，很少的熒光信號既可以通過儀器檢測出來，因此大大提高了檢測的靈敏度，檢測雌激素靈敏度可達(dá)0.lng/ml。通過設(shè)置質(zhì)控帶(點)作為數(shù)據(jù)歸一化方法，降低了不同紙條間不同操作人員乃至不同儀器掃描的實驗誤差，將不同紙條測得的樣品值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可以達(dá)到精確定量的效果。
[0011]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1己烯雌酚快速檢測卡的測試條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]圖中:5、支承背板，6、硝酸纖維素膜，7、熒光素顆粒膜，8、樣品墊，9、吸水膜，10、檢測帶，11、質(zhì)控帶。
[0014]圖2己烯雌酚快速檢測卡外殼及測試條在外殼內(nèi)的安置圖。
[0015]圖中:1、外殼，2、測試條，3、檢測窗孔，4、加樣孔。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明結(jié)合具體實施例參見附圖進(jìn)一步說明如下:
實施例1
一種己烯雌酚快速檢測卡，它是在檢測卡外殼I中設(shè)置測試條2，檢測卡外殼I的結(jié)構(gòu)及測試條2的設(shè)置參見附圖2，檢測卡外殼I為長條扁平薄殼狀外殼，長70_，寬20_，厚5mm,薄殼壁厚Imm,由工程塑料制成。檢測卡外殼I由殼蓋與殼座兩半聯(lián)接構(gòu)成，在檢測卡外殼I殼蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。測試條2放置在檢測卡外殼I的殼座內(nèi)。測試條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，片長約60mm，片寬約4mm，厚度約2. 5mm。測試條2是多層結(jié)構(gòu)：底層是支承背板5,為聚氯乙烯塑料薄片,厚約O. 5mm,長60mm,寬4_ ;支承背板5中部疊置粘貼硝酸纖維素膜6，硝酸纖維素膜厚O. 5mm,長20_25mm，寬4mm。硝酸纖維素膜6上有二條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖1，二條顯示印跡帶中，一條是檢測帶10，含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；另一條是質(zhì)控帶11，含肌動蛋白。支承背板5 —端部上疊置粘貼吸水膜9，支承背板5另一端部上疊置粘貼樣品墊8，吸水膜9內(nèi)端與樣品墊8內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜6 —端搭接，在樣品墊8與硝酸纖維素膜6的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜7，熒光素顆粒膜是含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標(biāo)記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜。突光素顆粒膜7厚O. 5-0. 8mm,長5mm,寬4mm。樣品墊8厚
O.5-0. 8mm,長20_，寬4_。吸水膜9厚O. 5-0. 8mm,長16-20_，寬4_。熒光素顆粒膜7、樣品墊8及吸水膜9與硝酸纖維素膜搭接長度為1-2_。吸水膜9材料是吸水紙，樣品墊8材料是吸水玻璃纖維膜。
[0018]熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
[0019]實施例2
本發(fā)明己烯雌酚檢測卡用于牛奶樣品中的己烯雌酚的檢測。
[0020]在牛奶中加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15min,于4 °C、IOOOOrpm離心15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
[0021]取150ul待測樣品加入注樣孔，在毛細(xì)管作用下待測樣品沿吸水墊方向移動，樣品溶解熒光素顆粒膜上的包被物質(zhì)，并帶動包被物質(zhì)一起向吸水墊方向移動。在樣品吸收墊上滴加樣品，如果樣品中有己烯雌酚，則己烯雌酚經(jīng)層析作用移動到熒光素顆粒膜的時候就會和熒光素顆粒標(biāo)記的抗己烯雌酚抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并帶動熒光素顆粒標(biāo)記的質(zhì)控抗體一起在層析作用下上行。當(dāng)移動到檢測帶時，未被樣品中己烯雌酚結(jié)合的游離的熒光素顆粒標(biāo)記的抗己烯雌酚抗體就會和檢測帶上的偶聯(lián)在載體蛋白上的己烯雌酚結(jié)合，而有熒光信號。熒光素標(biāo)記的質(zhì)控抗體則被質(zhì)控帶上的質(zhì)控抗原捕獲，而有熒光信號。而樣品中己烯雌酚和熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體形成的復(fù)合物則被層析到吸水紙上。樣品中的己烯雌酚越多，則熒光素顆粒膜中剩余游離的熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體越少，結(jié)合到檢測帶上的熒光素標(biāo)記的抗雌激素抗體越少，熒光信號也就越弱，依此來檢測樣品中的己烯雌酚的含量。通過測定標(biāo)準(zhǔn)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和對質(zhì)控帶上的熒光濃度進(jìn)行歸一化比較（T/C)，可以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而可以定量樣品中己烯雌酚的濃度。很少的熒光信號既可以通過儀器檢測出來，因此大大提高了檢測的靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.一種己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼中設(shè)置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、熒光素顆粒膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜；熒光素顆粒膜為含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標(biāo)記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是:含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，含肌動蛋白質(zhì)控帶，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
2.如權(quán)利要求1所述己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于，檢測時檢測樣品的前處理方法為產(chǎn)品樣品粉碎后加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15min，于4°C、1000rpm離心15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
3.如權(quán)利要求1所述己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于，所述熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
【文檔編號】G01N33/74GK104034905SQ201410284470
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍(lán)文苑 申請人:廣西博士海意信息科技有限公司