專利名稱：己烯雌酚陽離子化完全抗原制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種己烯雌酚陽離子化完全抗原制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，用于制備特異識別化學(xué)獸藥己烯雌酚的高效抗體與研制可以快速檢測己烯雌酚殘留的免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
己烯雌酹(Diethystilbestrol, DES),又名乙烯雌酹、乙蔵酹,化學(xué)名為1,2-雙(4-羥苯基)-1，2_ 二乙基乙烯，1938年由Dodds在英國倫敦合成，DES是一種具有酚羥基結(jié)構(gòu)的人工合成的非留體雌性激素，為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，幾乎無臭無味，幾乎不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、脂肪油、稀氫氧化鈉等，熔點(diǎn)169 172°C。己烯雌酚在獸醫(yī)臨床上主要用于發(fā)情不明顯動物的催情，還可用于治療子宮炎、胎衣不下、排出死胎等。DES曾作為促生長劑而廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，這是由于其在促進(jìn)動物蛋白質(zhì)的合成代謝、減少脂肪和提高動物日增重等方面效果明顯。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)研究發(fā)現(xiàn)，DES是一種致癌物質(zhì)，會對人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，甚至可誘發(fā)人體產(chǎn)生癌變。與致癌性關(guān)系最密切的是女性陰道和子宮頸透明細(xì)胞腺癌(CCA)，這種病過去只發(fā)生在中老年婦女中，但到20世紀(jì)70年代以后CCA的發(fā)病率在年輕女性中有所增加。Herbst等的調(diào)查結(jié)果中發(fā)現(xiàn)年齡和出生年份是影響患透明細(xì)胞腺癌風(fēng)險(xiǎn)的主要因素，而Kinch等的研究中也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病患都與其母親在妊娠早期服用過DES有關(guān)。此外，DES還會導(dǎo)致乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等，現(xiàn)在大多數(shù)女孩月經(jīng)初潮明顯提前也與DES有關(guān)。己烯雌酚作為一種飼料添加劑，能夠在動物源性食品(肝臟、肌肉、蛋、奶)中殘留，并通過食物鏈危害人體健康，因此世界各國開始關(guān)注DES殘留控制。早在1981年，歐盟理事會在81/602號指令中制訂的第一批歐盟禁用獸藥清單中就包括了己烯雌酚。美國也頒布禁令，將己烯雌酚列為禁止在食品動物中使用的獸藥。我國在1999年制定的《中華人民共和國動物及動物源食品殘留監(jiān)控計(jì)劃》中規(guī)定在動物性食品中不得檢出己烯雌酚，2002年又發(fā)布了《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》，禁止己烯雌酚及其鹽、酯制劑以任何用途用于所有食品動物。然而，由于巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，養(yǎng)殖商違禁添加己烯雌酚的情況依然存在，嚴(yán)重影響我國水產(chǎn)品、畜產(chǎn)品在國際上的聲譽(yù)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也給人們的健康帶來隱患。因此，為了確保我國畜牧水產(chǎn)品出口貿(mào)易的暢通和動物食品的安全，建立針對己烯雌酚的快速、靈敏的檢測技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的提供一種己烯雌酚陽離子化完全抗原。本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種己烯雌酚陽離子化完全抗原的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種己烯雌酚陽離子化完全抗原，具有式I結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種己烯雌酚陽離子完全抗原，具有式I結(jié)構(gòu):
2.式I結(jié)構(gòu)的一種己烯雌酚陽離子化完全抗原的制備方法，由如下步驟組成: (1)陽離子化載體蛋白的合成及鑒定在冰浴條件下，將670yL乙二胺(EDA)滴加到670 μ L乙烷磺酸偶聯(lián)緩沖液(MES)，用4MHC1調(diào)pH值至4.75左右，此為A液；先后將載體蛋白的MES溶液(50mg溶解于500mL)、EDC的MES溶液(30mg溶解于500 μ L)滴加至冰浴中的A液中；室溫磁力攪拌反應(yīng)2h，加入醋酸(約400 μ L)終止；去離子水透析72h，凍干備用； (2)己烯雌酚陽離子完全抗原的合成采用EDC法，具體操作步驟如下:稱取己烯雌酚半琥珀酸酯10.0mg、EDC 7.8mg、NHS 3.7mg，溶于2mLN, N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫震蕩攪拌反應(yīng)8h，此為A液；按陽離子蛋白:小分子=I: 40投料比準(zhǔn)確稱取陽離子化蛋白溶于2mL PBS中，此為B液，將A液用2mL PBS稀釋后，在震蕩器上將A液逐滴加至B液，4°C緩慢攪拌過夜，將反應(yīng)液在PBS (0.0lmol/L、pH 7.4)中透析3天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種己烯雌酚陽離子化完全抗原的制備方法及其用途，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明合成了陽離子化的載體蛋白，利用EDC法與羧基化的己烯雌酚偶聯(lián)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定及SDS-PAGE分析成功合成了陽離子化的己烯雌酚人工完全抗原，制備方法簡單有效，成本低廉，相對于天然載體蛋白，陽離子化的完全抗原作為免疫原時(shí)，被免疫的小鼠機(jī)體能產(chǎn)生更高水平的免疫應(yīng)答，合成的人工完全抗原可以應(yīng)用于制備特異識別己烯雌酚的高效抗體與研制快速檢測己烯雌酚的免疫速測試劑盒。
文檔編號C07K14/765GK103172728SQ201110440578
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者寧保安, 柳明, 彭媛, 連璐, 高志賢, 孫思明, 白家磊, 張亦紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所