專利名稱：：一種雙烯雌酚的檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測雙烯雌酚(dienoestrol，DEN)的檢測試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(Timeresolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于食品和飼料中雙烯雌酚藥物殘留量的檢測。
背景技術(shù)：
：雙烯雌酚是一種與己烯雌酚結(jié)構(gòu)類似的人工合成的具有酚羥基結(jié)構(gòu)的二苯乙烯類雌性激素，有與內(nèi)源性激素相似的生物效應(yīng)而被廣泛地應(yīng)用于臨床中。近年來，許多國家將其加入到動物飼料中，以提高家禽家畜的飼養(yǎng)效率。動物通過食物獲得的雌性激素一部分被排泄到環(huán)境中，一部分在動物體內(nèi)殘留，并通過食物鏈在人體內(nèi)富集。激素類藥物殘留會使正常人的生理功能發(fā)生紊亂，更嚴(yán)重的是影響兒童正常的生長發(fā)育，引發(fā)動物和人的癌癥和致畸毒性，而且妊娠期間使用還能引起后代生殖系統(tǒng)疾病。由于其致癌作用，我國和FDA、歐盟、美國、日本、加拿大已禁止己烯雌酚在飼料中的使用。目前國內(nèi)使用較多的為己烯雌酚，國家規(guī)定動物組織中不得檢出己烯雌酚，雙烯雌酚已證實為己烯雌酚的代謝產(chǎn)物。因此，快速準(zhǔn)確檢測雌性激素對于估計食品安全的潛在因素是很必須的。雙烯雌酚的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)和酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)等。通常以ELISA作為在現(xiàn)場抽樣快速篩選檢驗方法，HPLC或GC-MS作為確證性檢驗方法，目前，我國檢測機構(gòu)所用雙烯雌酚ELISA檢測試劑盒多為國外進口，其價格昂貴，很難在國內(nèi)推廣應(yīng)用。國產(chǎn)雙烯雌酚ELISA試劑盒普遍存在靈敏度不高、假陽性率高、不穩(wěn)定等問題。時間分辨熒光免疫分析檢測技術(shù)是近來發(fā)展迅速的高靈敏檢測手段。TRFIA其原理是利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，其一端和鑭系元素結(jié)合，另一端和抗體(抗原)上的自由氨基連接，制成Eu"標(biāo)記抗體(抗原)，它與待測樣品中的抗原(抗體)結(jié)合成免疫復(fù)合物。理想情況下，測定復(fù)合物中鑭系元素的熒光強度就能確定樣品中抗原的含量，但實際上這種復(fù)合物的熒光強度相當(dāng)弱，只有再加入一種增強溶液(Enhancementsolution)，使鑭系元素從復(fù)合物中解離下來，并與增強液中所含的P-奈甲酰三氟丙酮(P-NTA)重新形成微膠囊，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，即可確定樣品中抗原的量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雙烯雌酚試劑盒及檢測方法，用于定性或定量地檢測食品和飼料中雙烯雌酚的殘留量；檢測時間短、平均回收率高、批內(nèi)、批間誤差小，并具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點。本發(fā)明的技術(shù)方案該檢測雙烯雌酚的試劑盒是由1、多孔包被板，2、緩沖液，3、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，4、雙烯雌酚的抗體，5、銪標(biāo)記的羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液所組3成。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)來檢測DEN。采用TRFIA的技術(shù)主要有兩個方面第一，特異性多克隆抗體的制備，利用抗原免疫家兔，獲得含有抗體的血清，經(jīng)過生化提純分離免疫球蛋白；第二，Eu"標(biāo)記抗體的制備。測定方法為測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有DEN-載體蛋白的微孔板，加入DEN標(biāo)準(zhǔn)溶液或已處理好的樣品處理液到各自的微孔中、再加入DEN抗體，振蕩反應(yīng)，游離的DEN與微孔板上的DEN-載體蛋白競爭DEN抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的DEN抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-羊抗兔抗體，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒有連接的￡1!3+-羊抗兔抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中DEN的量。本發(fā)明的有益效果該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.Olng/mL以上。圖1:檢測雙烯雌酚的試劑盒示意圖。1、多孔包被板，2、緩沖液，3、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，4、雙烯雌酚的抗體，5、銪標(biāo)記的羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液。圖2:DEN-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施例方式實施例1:制備試劑盒和檢測動物組織樣品免疫抗原的制備本發(fā)明所述的人工免疫抗原為改造雙烯雌酚(DEN)成為雙烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)，再采用混合酸酐法與大分子載體蛋白結(jié)合，以合成的DEN-HS-BSA作為免疫抗原進行動物免疫。稱取20mglOOmg雙烯雌酚(DEN)，加入5mL吡啶后，加入10mg50mg琥珀酸，室溫，攪拌過夜，反應(yīng)完成，用酸水洗滌，抽濾沉淀，干燥，得雙烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)。載體蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。稱取30mg300mg牛血清白蛋白，溶解于50%二氧六環(huán)水溶液6mL10mL中，調(diào)pH值為910，為A液；稱取10mg50mgDEN-HS，溶于2mL二氧六環(huán)中，置4°C10min，依次加入三正丁胺20yL和氯甲酸異丁酯10yL，于4°C攪拌30min，作為B液。將A液在fC滴入B液，攪拌過夜。將反應(yīng)液對蒸餾水透析72小時，期間換蒸餾水5次。或萄聚糖凝膠G50(S印hadexG50)柱提純，以0.05mol/LpH8.0碳酸鹽緩沖溶液洗脫。收集透析純化液或第1峰的柱洗脫液，分裝保存于-2(TC作免疫原用。雙烯雌酚多克隆抗體的制備將上述合成的雙烯雌酚-牛血清白蛋白結(jié)合物(DEN-BSA)作免疫抗原，采用皮內(nèi)或皮下多點注射方式，接種1kg1.5kg雄性新西蘭兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫時，在免疫原中加等量弗氏完全佐劑混勻制成乳劑，以后免疫均加等量弗氏不完全佐劑；自第二次免疫開始，每次免疫后810天采血測試抗血清效價。觀察抗血清效價增長情況，達到滿意效價時將取全血，分離血清。抗血清經(jīng)過3次硫酸銨沉淀后，再用層析柱分離純化，對磷酸鹽緩沖溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室溫，加入等量的0.01mol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，加入20mL飽和硫酸銨溶液(以濃氨水調(diào)至pH7.8)，搖勻，4"靜止1小時后，以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液。沉淀物用20mLO.Olmol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解，然后加入10mL飽和硫酸銨溶液(pH7.8)，搖勻，4"靜止30分鐘后，以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液。重復(fù)鹽析兩次。最終以2mL0.01mol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，裝入透析袋，對2000mL0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖溶液透析12小時。將上述透析液，加入到約25克濕重的纖維素DEAE-52(取纖維素DEAE-52干粉10克，用500mL0.01mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液浸泡過夜，4t:平衡1小時，每10分鐘攪拌一次，傾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗濾。收集濾液，再對O.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖溶液透析12小時，最后加入適量甘油_201:保存。Eu3+_羊抗兔抗體的制備取溶解于50mmol/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗體lmL2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.15mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A28。-0.74A26。)，用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L。取500iiL1000iiL稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2mg0.4mg的Eu3+_N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30。C磁力攪拌反應(yīng)20小時。反應(yīng)液經(jīng)用80,1/LTris-HClpH7.8緩沖液平衡的S印haroseCL-6B柱(1X40cm)層析，A28。監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。固相抗原包被板制備將雙烯雌酚-卵清白蛋白結(jié)合物(DEN-OVA)用50mmol/LNa2C03-NaHC03pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100yL，4。C放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加150iiL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4t:放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(rc冷凍保存。試劑的配制(1)雙烯雌酚(DEN)標(biāo)準(zhǔn)溶液:(Ong/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)，從DEN純品中稀釋得到，稀釋液為0.lmol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液。(2)緩沖液8mmol/LNaCl、0.2%0VA、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lmL/LTween-80禾P0.1%NaN3的Tris—HClpH7.8。(3)洗滌液:14.5mmol/LNaC1、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50,1/LTris-HClpH7.8。(4)增強液的配制1LpH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15ymolP_萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)，50iimol三正辛基氧化膦(T0P0)，lmL曲拉通X-100(TritonX-100)。試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8條X12孔，可以拆分為單孔)包被有DEN-OVA。(2)6XDEN標(biāo)準(zhǔn)液，1.OmL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0ng/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。(3)1XDEN抗體，用時0.5mL蒸餾水溶解。5(4)1XEu3+_羊抗兔抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(5)IX增強液15mL。(6)IX洗滌液30mL，用時以蒸餾水1:25稀釋。(7)1X緩沖液30mL。實驗室應(yīng)自備的試劑(1)蒸餾水或去離子水；(2)無水乙醚；(3)三氯甲烷；(4)正己烷；(5)氫氧化鈉溶液0.Olmol/L;(6)磷酸溶液磷酸(85%)+水(1+1);(7)甲醇;(8)磷酸鹽緩沖液pH7.2，取1.45g磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)、0.lg磷酸二氫鉀(無水)、8.Og氯化鈉，溶解于水中并定溶至1000mL;(9)甲醇_pH7.2磷酸鹽緩沖液(1+4)。測定之前注意事項(1)使用之前將所有試劑回升至室溫(18°C30°C)。(2)使用之后立即將所有試劑放回2°C8°C。(3)如果樣品量大，建議使用多通道移液器。(4)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。(5)取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中，并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2°C8°C。具體檢測步驟如下稱取4g豬肉試樣(精確至O.lg)，置于試管中，加入10mL無水乙醚振搖20min后，以3500r/min離心3min，將提取液轉(zhuǎn)移至另一干凈試管中，重復(fù)上述操作一次，合并乙醚提取液，于4(TC水浴蒸發(fā)至近干。用4mL三氯甲烷溶解殘渣，然后加4mL氫氧化鈉溶液振搖20min，靜置分層后將氫氧化鈉溶液層轉(zhuǎn)移至另一干凈試管內(nèi)，重復(fù)上述操作一次，合并氫氧化鈉溶液層。加入8mL正己烷，劇烈振搖，待分層后棄去正己烷層。用磷酸溶液調(diào)整溶液pH至7.0。每次用8mL無水乙醚提取2次，合并乙醚層并蒸發(fā)至近干。用4mL甲醇-pH7.2磷酸鹽緩沖液溶解殘留物供測定。取DEN-OVA板條，加入50yL的DEN標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品處里液到各自的微孔中，每個標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液l:20稀釋的DEN抗體50iiL，25t:振蕩1小時，洗滌液洗三次，加緩沖液1:20稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100iiL，25t:振蕩1小時，用洗滌液洗六次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的DEN含量，見表1和圖2，該例的樣品濃度為0.23ng/mL。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施實例2制備試劑盒和檢測飼料樣品。DEN-BSA抗原制備稱取20mglOOmg雙烯雌酚(DEN)，加入5mL吡啶后，加入10mg50mg琥珀酸，室溫，攪拌過夜，反應(yīng)完成，用酸水洗滌，抽濾沉淀，干燥，得雙烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)。稱取12mgDEN-HS、40mgN_羥基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亞胺(EDC)溶于N，N'_二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫攪拌24h，制成A液；稱取50mgBSA溶于3mL0.Olmol/mLpH7.4PBS中，制成B液。將A液逐滴加入B液，邊加邊攪拌，室溫反應(yīng)3h，將反應(yīng)液蒸餾水中透析72小時，期間換蒸餾水5次?；蚪?jīng)萄聚糖凝膠G50(S印hadexG50)柱提純，以0.05mol/LpH8.0碳酸鹽緩沖溶液洗脫。收集透析純化液或第1峰的柱洗脫液，分裝保存于-2(TC作免疫原用。多克隆雙烯雌酚抗體的制備與實施例1相同，略。Eu3+_羊抗兔抗體的制備與實施例1相同，略。固相抗原包被板的制備與實施例1相同。試劑的配制與實施例1相同。試劑盒提供的試劑與實施例1相同。實驗室應(yīng)自備的試劑與實施例1相同。測定之前注意事項同實施例1。具體檢測步驟同實施例1。實驗室應(yīng)自備的試劑(1)蒸餾水或去離子水；(2)無水乙醚；(3)三氯甲烷；(4)甲醇;(5)磷酸鹽緩沖液PH7.2，取1.45g磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)、0.lg磷酸二氫鉀(無水)、8.Og氯化鈉，溶解于水中并定溶至lOOOmL;(6)0.2mol/L的乙酸銨緩沖液15.4g乙酸銨溶解于900mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH，使其至pH5.2p±H0.2，定容至1L;(7)1.Omol/L氫氧化鈉溶液；(8)0.lmol/L氫氧化鈉甲醇溶液+水(7+3);(9)甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2%甲酸)溶液；(10)固相萃取柱OasisMAX柱(60mg，3mL)或相當(dāng)者。(11)甲醇-pH7.2磷酸鹽緩沖液(1+4)。測定之前注意事項同實施例1。具體檢測步驟如下準(zhǔn)確稱取5.0g±0.lg動物飼料于50mL具蓋的離心管中，加入lOmLO.2mol/L的乙酸銨緩沖液，均質(zhì)lmin，加入10mL乙醚，漩渦震蕩提取3min，于3500r/min離心5min，吸取乙醚層于另一試管中。重復(fù)乙醚提取一次，合并乙醚層，常溫下用氮氣吹干。加入2mL三氯甲烷溶解殘余物，加入5mL1.Omol/L氫氧化鈉溶液，漩渦震蕩lmin，于1500r/min離心5min，上層水相移入另一試管中，重復(fù)氫氧化鈉溶液提取一次，合并氫氧化鈉提取液。合并的氫氧化鈉提取液過MAX固相萃取柱，流速2mL/min，依次用5mL1.Omol/L氫氧化鈉溶液和5mL0.lmol/L氫氧化鈉甲醇溶液+水(7+3)淋洗小柱，待溶液流過固相萃取柱后，在65kPa的負(fù)壓下，減壓抽干。加入5mL甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2%甲酸)溶液洗脫，控制流速在2mL/min，收集洗脫液，蒸發(fā)至近干。用5mL甲醇-pH7.2磷酸鹽緩沖液溶解殘留物供測定。取DEN-OVA板條，加入50yL的DEN標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品處里液到各自的微孔中，每個標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品處里液必須使用新的吸頭，加緩沖液l:20稀釋的DEN抗體50iiL，25t:振蕩1小時，洗滌液洗三次，加緩沖液1:20稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100yL，25t:振蕩1小時，用洗滌液洗六次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的DEN含量，見表2和圖2，該例的樣品濃度為0.17ng/mL。表2權(quán)利要求一種檢測雙烯雌酚的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是由多孔包被板(1)，緩沖液(2)，雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(3)，雙烯雌酚的抗體(4)，銪標(biāo)記的羊抗兔抗體(5)，洗滌液(6)和增強液(7)所組成。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將DEN-OVA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100iiL，4t:放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150iiL含3g/LOVA的上述緩沖液封閉，4t:放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-201:冷凍保存。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其中的雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(3)，從DEN純品中稀釋得到，稀釋液為0.lmol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液，共6瓶，DEN濃度分別為:0ng/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其中的雙烯雌酚的抗體凍干品(4)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2mL混合2mgDEN-BSA，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600iiL制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔和BALB/c小白鼠身上多位點地進行皮下注射，在免疫34次后，可進行鑒定，血清和腹水合格后稀釋、分裝、凍干備用。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其中的銪標(biāo)記的羊抗兔抗體(5)，將購得的羊抗兔抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗兔抗體加入Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]_二乙烯三胺四乙酸，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中的銪標(biāo)記的羊抗兔抗體(5)，取溶解于50mmo1/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗體lmL2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5-9.0緩沖液，收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L，取500-1000iiL稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-3(TC磁力攪拌反應(yīng)16小時，反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/LTris-HClpH7.8緩沖液平衡的S印hadex-G50柱(1X40cm)層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。7.—種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測雙烯雌酚的方法，其特征是取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入DEN標(biāo)準(zhǔn)溶液或處理好的樣品處里液到各自的微孔中，再加入DEN抗體，振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加銪標(biāo)記的羊抗兔抗體，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的DEN含量。8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測雙烯雌酚的方法，其操作為取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入50iiL的DEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，力B50iiL以緩沖液(2)作稀釋劑，1:20稀釋DEN抗體，25t:37"振蕩0.51小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1:20稀釋的100iiLEU"-羊抗兔抗體，25。C37。C振蕩0.5l小時，用洗滌液洗六次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的DEN含量。全文摘要一種檢測雙烯雌酚的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于食品和飼料中雙烯雌酚(DEN)含量的檢測。本發(fā)明配制的試劑盒，采用TRFIA檢測DEN，測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。微孔板包被有DEN-載體蛋白，加入DEN標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品處里液，再加入DEN抗體。游離的DEN與微孔板上的DEN-載體蛋白競爭DEN抗體，沒有連接的DEN抗體被洗滌除去，加入Eu3+-羊抗兔抗體，標(biāo)記免疫反應(yīng)后沒有連接的Eu3+-羊抗兔抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的DEN濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測樣品中DEN的含量。本發(fā)明提供的檢測DEN試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.01ng/mL以上。文檔編號G01N33/74GK101713783SQ20091023265公開日2010年5月26日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日發(fā)明者宓曉黎,李利東,杜妹蓮,肖華龍,陸茂林,黃麗俊申請人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司