一種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，所述檢測方法采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，包括如下步驟：a.確定色譜條件；b.供試品溶液制備：精密稱取復(fù)方丹參片，置于容量瓶中，加50％乙醇超聲溶解，定容，過濾，得到濾液，即供試品溶液；c.指紋圖譜建立：將b步驟制得的供試品溶液利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，得到復(fù)方丹參片指紋圖譜，其中色譜條件為步驟a中所述的色譜條件。該檢測方法簡單快捷、易操作、精密度高、穩(wěn)定性好，能夠很好的為復(fù)方丹參片的生產(chǎn)提供質(zhì)量控制的依據(jù)。
【專利說明】一種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含丹參藥物指紋圖譜的檢測方法，尤其是涉及一種復(fù)方丹參片指 紋圖譜的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 復(fù)方丹參片收載于《中國藥典》2010版第一增補本中，由丹參、三七和冰片三味藥 組成，具有活血化瘀，理氣止痛的作用。丹參藥材主要含有丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I、 丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮等脂溶性成分和丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、紫 草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等水溶性成分；三七藥材主要含有人參皂苷Rbl、 Rb2、Rb3、Rgl、Re、F2和三七皂苷1?1、1?2、1?4、1?6、？&等成分。臨床上用于氣滯血瘀所致的胸 痹，癥見胸悶、心前區(qū)刺痛，冠心病心絞痛。
[0003] 復(fù)方丹參片在配方或比例存在差異的情況下，可能會導(dǎo)致治療效果產(chǎn)生差異，因 此需要尋求一種質(zhì)量評價方法，對復(fù)方丹參片的質(zhì)量提供依據(jù)。目前，對于這一評價方法主 要有指紋圖譜研究方法，如下列文獻(xiàn)（1)王穎.復(fù)方丹參片的HPLC指紋圖譜研究[J].中 國藥房，2010(23) :2162-2163 ;⑵孫守國.復(fù)方丹參片的HPLC指紋圖譜研究[J].中成 藥，2009, 31 (3) :339-342. (3)黃琳，姚小華，林青等.復(fù)方丹參片指紋圖譜研究[J]·現(xiàn) 代中藥研究與實踐，2012, 26(4):66-69. (4)嚴(yán)玉平，同利琪，郭聰?shù)?復(fù)方丹參片指紋圖 譜及含量檢測研究[J].中成藥，2012, 31 (8) 1149-115。
[0004] 但上述文獻(xiàn)中，未有在同一條件下同時檢測出復(fù)方丹參片中丹參和三七有效成分 的復(fù)方丹參片指紋圖譜，增大了檢測時間和成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種精密度高、穩(wěn)定性好、能夠在同一流 動相下同時檢測出丹參和三七有效成分的指紋圖譜的方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，所述檢測 方法包括如下步驟：
[0008] a.確定色譜條件：
[0009] 色譜柱：C18色譜柱；
[0010] 流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0. 1 %磷酸；
[0011] 檢測波長：210nm;
[0012] 柱溫：30°C;
[0013] 體積流量：lml/min ;
[0014] 進(jìn)樣量：10μ1;
[0015] 參照峰：丹酚酸Β色譜峰；
[0016] 洗脫程序：梯度洗脫，洗脫時間為90min ;
[0017] 為了更好使供試品溶液中組分的分離效果最好，發(fā)明人在實驗中，選擇乙腈-水， 乙腈-0.1 %磷酸（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 乙腈-7K，甲醇-水系統(tǒng)下，色譜峰較少，出峰時間較長，甲醇-0.1 %磷酸系統(tǒng)下，色譜峰較 多，但分離效果不是很好，選用乙腈-0.1 %磷酸系統(tǒng)，分離效果較好，基線較平穩(wěn)，故選用乙 腈-0.1 %磷酸作為流動相；
[0018] 發(fā)明人利用二極管陣列檢測器，獲得復(fù)方丹參片190?400nm的3D色圖譜，結(jié)果 見圖1(復(fù)方丹參片指紋圖譜3D圖）。通過全波長掃描可以看出，在210nm處，復(fù)方丹參片 各類成分都有較好的吸收，且能同時檢測出丹參和三七藥材主要成分的吸收。在210nm以 上，三七成分的吸收峰逐漸消失，在210nm以下，丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I的吸收峰 逐漸消失，綜合各成分吸收峰的特點，選擇210nm作為復(fù)方丹參片的檢測波長；
[0019] 復(fù)方丹參片指紋圖譜中丹酚酸B色譜峰峰形適中，對稱性較好、峰面積較大，且丹 酚酸B為2010版藥典中丹參藥材的含量控制指標(biāo)之一，故選擇丹酚酸B為參照峰；
[0020] b.供試品溶液制備：精密稱取復(fù)方丹參片，置于容量瓶中，加50%乙醇（質(zhì)量百分 數(shù)）超聲溶解，定容，過濾，得到濾液，即供試品溶液；
[0021] 復(fù)方丹參片所含成分主要有水溶性和脂溶性成分，發(fā)明人分別以50%乙醇（質(zhì)量 百分?jǐn)?shù)）、75%乙醇（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）、50%甲醇（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）和75%甲醇（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）為 提取溶劑制備供試品，按液相色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%乙醇提取包含的色譜法最多， 總峰面積較大，故選擇50%乙醇作為提取溶劑；
[0022] c.指紋圖譜建立：將b步驟制得的供試品溶液利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，得 到復(fù)方丹參片指紋圖譜，其中色譜條件為步驟a中所述的色譜條件。
[0023] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述b步驟具體為：取復(fù)方丹參片，研細(xì)，精密稱取0. 5g， 置于25ml容量瓶中，加50%乙醇超聲溶解，定容，過濾，得到濾液，即供試品溶液；所述超聲 處理的功率為300w，頻率為50kHz，處理時間為30min ;其中過濾采用的濾膜為孔徑0. 45 μ m 的微孔濾膜。
[0024] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟中的洗脫程序具體為：
[0025] 0_5min時，流動相A為6-20 %的乙腈，流動相B為80-94的0. 1 %的磷酸溶液；
[0026] 5-30min時，流動相A為20-25%的乙腈，流動相B為75-80的0. 1 %的磷酸溶液；
[0027] 30-45min時，流動相A為25-32%的乙腈，流動相B為68-75的0. 1 %的磷酸溶液；
[0028] 45-70min時，流動相A為32-70%的乙腈，流動相B為30-68的0. 1 %的磷酸溶液；
[0029] 70-90min時，流動相A為70-90%的乙腈，流動相B為10-30的0. 1 %的磷酸溶液。
[0030] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004》對經(jīng)過c 步驟得到的復(fù)方丹參片指紋圖譜進(jìn)行評價，得到復(fù)方丹參片的對照指紋圖譜。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：選用乙腈-ο. 1 %磷酸作為流動相系統(tǒng)，分離 效果較好，基線較平穩(wěn)；檢測波長為210nm，復(fù)方丹參片各類成分都有較好的吸收，且能同 時檢測出丹參和三七藥材主要成分的吸收；丹酚酸B色譜峰峰形適中，對稱性較好、峰面積 較大，能夠起到很好的參照作用；50%乙醇作為提取溶劑，提取包含的色譜法最多，總峰面 積較大；此外該檢測方法簡單快捷、易操作、精密度高、穩(wěn)定性好，能夠很好的為復(fù)方丹參片 的生產(chǎn)提供質(zhì)量控制的依據(jù)。
[0032] 下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為復(fù)方丹參片指紋圖譜3D圖；
[0034] 圖2為復(fù)方丹參片和對照品色譜圖；
[0035] 圖3為12批復(fù)方丹參片指紋圖譜；
[0036] 圖4為復(fù)方丹參片對照指紋圖譜；
[0037] 圖2中：S1 :丹參素納對照品；S2 :原兒余對照品；S3 :迷迭香酸對照品；S4 :紫 草酸對照品；S5 :人參皂苷Rgl對照品；S6 :丹酚酸B對照品；S7 :人參皂苷Rbl對照品；S8 : 隱丹參酮對照品；S9 :丹參酮I對照品；S10 :丹參酮IIA對照品；S11 :丹參陰性對照品； S12 :三七陰性對照品；S13 :復(fù)方丹參片供試品。
[0038] 圖3中：S1 :復(fù)方丹參片L3A082批；S2 :復(fù)方丹參片D3A008批；S3 :復(fù)方丹參片 E3A023批；S4 :復(fù)方丹參片F(xiàn)3A016批；S5 :復(fù)方丹參片G3A026批；S6 :復(fù)方丹參片I3A094 批；S7 :復(fù)方丹參片J3A001批；S8 :復(fù)方丹參片J3A002批；S9 :復(fù)方丹參片J3A003批；S10 : 復(fù)方丹參片J3A006批；S11 :復(fù)方丹參片L3A080批；S12 :復(fù)方丹參片L3A081批。

【具體實施方式】
[0039] 實施例1
[0040] 一種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，其特征在于采用高效液相色譜法進(jìn)行檢 測，所述檢測方法包括如下步驟：
[0041] a.確定色譜條件：
[0042] 色譜柱：C18色譜柱；
[0043] 流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0. 1 %磷酸；
[0044] 檢測波長：210nm ;
[0045] 柱溫：30。。；
[0046] 體積流量：lml/min ;
[0047] 進(jìn)樣量：10μ1;
[0048] 參照峰：丹酚酸Β色譜峰；
[0049] 洗脫程序：梯度洗脫，洗脫時間為901^11;0-51^11時，流動相4為6-20 (%的乙腈，流 動相Β為80-94的0. 1 %的磷酸溶液；5-30min時，流動相Α為20-25 %的乙腈，流動相Β為 75-80的0. 1 %的磷酸溶液；30-45min時，流動相A為25-32 %的乙腈，流動相B為68-75的 0. 1 %的磷酸溶液；45-70min時，流動相A為32-70 %的乙腈，流動相B為30-68的0. 1 %的 磷酸溶液；70_90min時，流動相A為70-90 %的乙腈，流動相B為10-30的0. 1 %的磷酸溶 液；
[0050] b.供試品溶液制備：取復(fù)方丹參片，研細(xì)，精密稱取0. 5g，置于25ml容量瓶中，力口 50 %乙醇超聲溶解，定容，過濾，得到濾液，即供試品溶液；所述超聲處理的功率為300w，頻 率為50kHz，處理時間為30min ;其中過濾采用的濾膜為孔徑0. 45 μ m的微孔濾膜；
[0051] c.指紋圖譜建立：將b步驟制得的供試品溶液利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，得 到復(fù)方丹參片指紋圖譜，其中色譜條件為步驟a中所述的色譜條件。
[0052] 對廣州白云山和記黃埔有限公司的復(fù)方丹參片進(jìn)行指紋圖片檢測：
[0053] 儀器：Waters2695液相色譜儀（美國waters) ;AG245型電子分析天平（瑞士 METTLED TOLEDO) ;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 405-D-1型超純水機(jī)（廣州東銳科技有限公司）。
[0054] 試劑：復(fù)方丹參片12批（廣州白云山和記黃埔有限公司提供，批號為：L3A080， L3A081, L3A082, D3A008, E3A023, F3A016, G3A026, I3A094, J3A001, J3A002, J3A003, J3A006)；
[0055] 丹酚酸 B 對照品（批號：Y0001559-01，EDQM);
[0056] 丹參酮 ΙΙΑ 對照品（批號：Y0001560-01，EDQM);
[0057] 迷迭香酸對照品（批號：Y0000786-01，EDQM);
[0058] 紫草酸對照品（批號：must-13082702);
[0059] 丹參素鈉對照品（批號：110855-201311,中國食品藥品檢定研究院）；
[0060] 原兒茶醛對照品（批號：110810-201007,中國食品藥品檢定研究院）；
[0061] 人參皂苷Rgl對照品（批號：110703-201128,中國食品藥品檢定研究院）；
[0062] 人參皂苷Rbl對照品（批號：110704-201223,中國食品藥品檢定研究院）；
[0063] 隱丹參酮對照品（批號：110852-200806,中國食品藥品檢定研究院）；
[0064] 丹參酮I對照品（批號：110867-200406,中國食品藥品檢定研究院）；
[0065] 甲酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；
[0066] 甲醇（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）；
[0067] 磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；
[0068] 乙腈（色譜純，TEDIA);
[0069] 甲醇（色譜純，TEDIA);
[0070] 高純水。
[0071] 對照品溶液制備：分別取丹酚酸B、丹參素鈉、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、人參 皂苷Rgl、人參皂苷Rb 1、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA對照品適量，置量瓶中，各加75% 甲醇配成一定濃度的對照品溶液。
[0072] 丹參陰性對照品制備：按中國藥典復(fù)方丹參片處方比例，稱取除丹參的其余飲片， 按藥典工藝制成顆粒，按本實施例中b步驟的方法制成丹參陰性供試品溶液。
[0073] 三七陰性對照品制備：按中國藥典復(fù)方丹參片處方比例，稱取除三七的其余飲片， 按藥典工藝制成顆粒，按本實施例中b步驟的方法制成三七陰性供試品溶液。
[0074] 對本實施例的檢測方法進(jìn)行考察，主要對本方法的專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定 性進(jìn)行評價。
[0075] 專屬性試驗：取丹酚酸B、丹參素鈉、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、人參皂苷Rgl、 人參皂苷Rbl、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA對照品溶液、供試品溶液、丹參和三七陰性 對照品溶液根據(jù)本實施例a步驟中的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果見圖2 (復(fù) 方丹參片和對照品色譜圖）。復(fù)方丹參片共檢測出23個共有峰，其中5、6、10、11、12、13、 18、20、21、22號色譜峰為丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、人參皂苷Rgl、丹酚酸B、 人參皂苷Rbl、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA色譜峰，見圖3。其中1、2號色譜峰為丹參 和三七共有的色譜峰，3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23號色譜峰 為丹參的歸屬色譜峰，12、18號色譜峰為三七的歸屬色譜峰。
[0076] 精密度試驗：分別精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μ L，按上述 方法色譜條件檢測，記錄HPLC色譜圖，以丹酚酸B色譜峰作為參照峰，計算各特征峰相對保 留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果顯示所有色譜峰相對保留時間的RSD為0. 05%?0. 29%， 相對峰面積的RSD為0. 44%?3. 38%，相似度為1. 000,見表1，表明儀器的精密度好。 [0077] 表1精密度相似度計算結(jié)果
[0078]

【權(quán)利要求】
1. 一種復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，其特征在于采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測， 所述檢測方法包括如下步驟： a. 確定色譜條件： 色譜柱：C18色譜柱； 流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0. 1 %磷酸； 檢測波長：210nm ; 柱溫：30°C ; 體積流量：lml/min ; 進(jìn)樣量：10μ 1 ; 參照峰：丹酚酸Β色譜峰； 洗脫程序：梯度洗脫，洗脫時間為90min ; b. 供試品溶液制備：精密稱取復(fù)方丹參片，置于容量瓶中，加50%乙醇超聲溶解，定 容，過濾，得到濾液，即供試品溶液； c. 指紋圖譜建立：將b步驟制得的供試品溶液利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，得到復(fù) 方丹參片指紋圖譜，其中色譜條件為步驟a中所述的色譜條件。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，其特征在于所述b步驟具 體為：取復(fù)方丹參片，研細(xì)，精密稱取〇. 5g，置于25ml容量瓶中，加50%乙醇超聲溶解，定 容，過濾，得到濾液，即供試品溶液；所述超聲處理的功率為300w，頻率為50kHz，處理時間 為30min ;其中過濾采用的濾膜為孔徑0. 45 μ m的微孔濾膜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，其特征在于所述a步 驟中的洗脫程序具體為： 0-5min時，流動相A為6-20 %的乙腈，流動相B為80-94的0. 1 %的磷酸溶液； 5-30min時，流動相A為20-25 %的乙腈，流動相B為75-80的0. 1 %的磷酸溶液； 30-45min時，流動相A為25-32 %的乙腈，流動相B為68-75的0. 1 %的磷酸溶液； 45-70min時，流動相A為32-70 %的乙腈，流動相B為30-68的0. 1 %的磷酸溶液； 70-90min時，流動相A為70-90%的乙腈，流動相B為10-30的0. 1 %的磷酸溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)方丹參片指紋圖譜的檢測方法，其特征在于：利用《中 藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004》對經(jīng)過c步驟得到的復(fù)方丹參片指紋圖譜進(jìn)行評 價，得到復(fù)方丹參片的對照指紋圖譜。
【文檔編號】G01N30/02GK104111292SQ201410281551
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】劉軍, 鄧祝玲, 鄭文忠, 蔣文慶, 丘鸰原 申請人:廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司