一種熒光分子探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光分子探針及其制備方法和應(yīng)用。所述熒光分子探針包括親水多肽以及連接于所述親水多肽同一端的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)。本發(fā)明的熒光分子探針中，親水多肽能夠提高熒光分子探針在水溶液中的溶解性和穩(wěn)定性，疏水烷基鏈能夠嵌入細(xì)胞膜，受限發(fā)光基團(tuán)只在受限條件下發(fā)射熒光。該熒光分子探針?lè)€(wěn)定性強(qiáng)、特異性好，因此是一種良好的可用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針，可應(yīng)用于生物或醫(yī)學(xué)研究中。本發(fā)明所述熒光分子探針的制備方法，簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成本較低，光學(xué)穩(wěn)定性好。
【專利說(shuō)明】一種熒光分子探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光分子探針領(lǐng)域，尤其涉及一種用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光分子探針是建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測(cè)量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對(duì)象的化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測(cè)量的熒光信號(hào)的分子測(cè)量裝置。熒光分子探針受到周圍環(huán)境的影響，在不同條件下表現(xiàn)不同熒光特性。當(dāng)處于某一特定環(huán)境中時(shí)，熒光分子探針熒光特性發(fā)生變化，如熒光的從無(wú)到有，或是激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)的改變，從而使人們獲知周圍環(huán)境的特征或者環(huán)境中存在的某種特定信息。熒光分子探針具有靈敏度高、選擇性好、使用方便、成本低、不需預(yù)處理、不受外界電磁場(chǎng)影響、遠(yuǎn)距離發(fā)光等諸多優(yōu)點(diǎn)。熒光分子探針通常由識(shí)別基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)組成，前者決定了探針?lè)肿拥倪x擇性和特異性，后者則決定了識(shí)別的靈敏度。
[0003]在生物醫(yī)學(xué)研究中，人們常常需要標(biāo)記細(xì)胞膜以觀察細(xì)胞的形態(tài)和大小，或者觀察特定蛋白、囊泡與細(xì)胞膜的位置關(guān)系。然而現(xiàn)有的細(xì)胞膜分子探針具有特異性差、易光漂白等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用，無(wú)法滿足 科學(xué)研究的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針，其對(duì)細(xì)胞膜具有特異性標(biāo)記能力，與細(xì)胞膜結(jié)合后發(fā)光基團(tuán)有熒光，顯示細(xì)胞膜位置，因此是一種能夠用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針。本發(fā)明還提供所述熒光分子探針的制備方法和應(yīng)用，其制備方法簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成本較低，光學(xué)穩(wěn)定性好。
[0005]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0006]在第一方面，本發(fā)明提供一種熒光分子探針，包括親水多肽以及連接于所述親水多肽同一端的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)。
[0007]本發(fā)明的熒光分子探針中，所述疏水烷基鏈能夠嵌入細(xì)胞膜并導(dǎo)致發(fā)光基團(tuán)受限，在激光照射下發(fā)射熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的特異性標(biāo)記。本發(fā)明的熒光分子探針中，親水多肽能夠提高探針在水溶液中的穩(wěn)定性和靶向性，疏水烷基鏈能夠嵌入細(xì)胞膜，發(fā)光基團(tuán)只在受限條件下發(fā)射熒光，因此是一種良好的可用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針。
[0008]本發(fā)明中，所述疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽之間的共價(jià)連接可以是任意穩(wěn)定的共價(jià)鍵，只要能夠?qū)崿F(xiàn)三者的連接即可，比如酰胺鍵、酯鍵或醚鍵等。當(dāng)然，也包括未來(lái)開(kāi)發(fā)出的共價(jià)鍵連接類型。
[0009]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)均通過(guò)酰胺鍵與所述親水多肽共價(jià)連接。
[0010]已經(jīng)證明，采用酰胺鍵連接能夠?qū)崿F(xiàn)疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽的高效、穩(wěn)定連接，兩個(gè)酰胺鍵連接都是非常專一和穩(wěn)定的，且對(duì)三部分功能不會(huì)產(chǎn)生干擾。[0011 ] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述親水多肽的N-端氨基酸的側(cè)鏈R基上具有氨基基團(tuán)，所述氨基基團(tuán)與所述疏水烷基鏈形成酰胺鍵共價(jià)連接；所述親水多肽的N-端氨基酸的α氨基與所述受限發(fā)光基團(tuán)形成酰胺鍵共價(jià)連接。所述親水多肽的N-端氨基酸比如賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述親水多肽的N-端氨基酸為賴氨酸，所述賴氨酸的側(cè)鏈氨基與所述疏水烷基鏈形成酰胺鍵共價(jià)連接；所述賴氨酸的α氨基與所述受限發(fā)光基團(tuán)形成酰胺鍵共價(jià)連接。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述疏水烷基鏈的碳鏈含有8-20個(gè)碳原子，例如8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)碳原子，優(yōu)選為12-20個(gè)碳原子，更優(yōu)選為棕櫚
酸、油酸或硬脂酸。在上述范圍內(nèi)，疏水烷基鏈嵌入細(xì)胞膜的能力較強(qiáng)，且得到的分子探針?lè)€(wěn)定性良好。
[0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述親水多肽帶有正電荷，優(yōu)選為以帶正電荷的氨基酸為主組成的多肽，更優(yōu)選為含有精氨酸的多肽。除精氨酸以外還可以含有賴氨酸或組氨酸等。上述氨基酸組成的帶正電荷的親水多肽能夠在提高熒光分子探針?lè)€(wěn)定性的同時(shí)促進(jìn)其與細(xì)胞相互接觸，從而提高特異性。 [0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述受限發(fā)光基團(tuán)為受限誘導(dǎo)發(fā)光分子，優(yōu)選為四苯基乙烯分子或硅雜環(huán)戊二烯。上述受限誘導(dǎo)發(fā)光分子具有分子轉(zhuǎn)動(dòng)受限發(fā)光特性，且具有熒光穩(wěn)定不易淬滅、發(fā)光效率高等優(yōu)勢(shì)。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面所述的熒光分子探針的方法，包括:將疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽的同一端連接形成所述熒光分子探針。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括:在催化劑的存在下，分別使帶有羧基的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽的氨基接觸，形成酰胺鍵共價(jià)連接，得到所述熒光分子探針。
[0018]優(yōu)選地，所述催化劑為2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯
和N，N-二異丙基乙胺。
[0019]在本發(fā)明的方法中，親水多肽、疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)的特性和選擇如第一方面所述，在此不再贅述。
[0020]在第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的熒光分子探針在細(xì)胞膜標(biāo)記中的應(yīng)用。
[0021 ] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的熒光分子探針中，親水多肽能夠提高熒光分子探針在水溶液中的溶解性和穩(wěn)定性，疏水烷基鏈能夠嵌入細(xì)胞膜，受限發(fā)光基團(tuán)只在受限條件下發(fā)射熒光。該熒光分子探針?lè)€(wěn)定性強(qiáng)、特異性好，因此是一種良好的可用于細(xì)胞膜標(biāo)記的熒光分子探針，可應(yīng)用于生物或醫(yī)學(xué)研究中。本發(fā)明所述熒光分子探針的制備方法，簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成本較低，光學(xué)穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的熒光分子探針在50 μ M濃度下孵育細(xì)胞30min后對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記效果(單光子激光共聚焦顯微鏡拍攝)。
[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的熒光分子探針在50 μ M濃度下孵育細(xì)胞30min后對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記效果(雙光子激光共聚焦顯微鏡拍攝)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0025]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買得到的。
[0026]實(shí)施例中所用材料的來(lái)源:Fmoc保護(hù)的氨基酸(Fmoc-amino acids)、2_(7_偶氮苯并三氮唑)-N, N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(O- (7-Azabenzotriazole-1-yl)-1, I, 3, 3-tetramethyluroniIum hexaf luorophosphate, HATU)和 N, N- 二異丙基乙胺(diisopropylethylamine, DIEA)均購(gòu)自北京博邁杰科技有限公司；棕櫚酸(≥99 %,palmitic acid)、油酸(^ 99 %, oleic acid)、硬脂酸(> 99 %, stearic acid)均購(gòu)自Sigma-Aldrich(St Louis，美國(guó))公司；羧基化的四苯基乙烯(TPE-C00H)(參考文獻(xiàn) Chunqiu Zhang 等人,Imaging Intracellular Ant1-Cancer Drug Delivery bySelf-Assembly Micelles with Aggregation-1nduced Emission(AIE Micelles).ACSApplied Materials&Interfaces.2014.9 ；6(7):5212-5220.)和娃雜環(huán)戍二烯(silole)(參考文獻(xiàn) Silole-Contai ning Polyacetylenes.Synthesis, Thermal Stability, LightEmission, Nanodimensional Aggregation, and Restricted Intramolecular Rotation.Macromolecules, 2003, 36(4)，ppll08 - 1117)為自己合成；所有化學(xué)試劑用之前均未經(jīng)過(guò)其他處理，整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的超純水采用密理博公司的Mill1-Q三蒸水(18.2ΜΩ.cm,Millipore System Inc.)。
[0027]實(shí)施例1
[0028]本實(shí)施例以4個(gè)精氨酸組成的多肽(RRRR，R4，SEQ ID NO:1)作為親水多肽、羧基化四苯基乙烯(TPE-C00H)作為受限發(fā)光基團(tuán)、棕櫚酸作為疏水烷基鏈為例，說(shuō)明熒光分子探針的制備。將該熒光分子探針命名為TR4，下文中TR4均指該探針。其中精氨酸帶正電，故R4多肽呈現(xiàn)正電性，對(duì)細(xì)胞具有親和性。精氨酸后續(xù)連接一個(gè)賴氨酸N端和側(cè)鏈端的兩個(gè)氨基供連接TPE-C00H和棕櫚酸使用。棕櫚酸的羧基易于反應(yīng)，而疏水烷基鏈可以嵌入細(xì)胞膜中，并固定整個(gè)熒光分子探針。TPE分子在自由狀態(tài)下不發(fā)光，一旦探針結(jié)合于細(xì)胞膜，苯環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)受限，TPE發(fā)射突光。其最優(yōu)激發(fā)波長(zhǎng)為330nm,發(fā)射波長(zhǎng)為466nm。下式為合成的TR4的分子結(jié)構(gòu)。
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種熒光分子探針，包括親水多肽以及連接于所述親水多肽同一端的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光分子探針，其特征在于，所述疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)均通過(guò)酰胺鍵與所述親水多肽共價(jià)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光分子探針，其特征在于，所述親水多肽的N-端氨基酸的側(cè)鏈R基上具有氨基基團(tuán)，所述氨基基團(tuán)與所述疏水烷基鏈形成酰胺鍵共價(jià)連接；所述親水多肽的N-端氨基酸的α氨基與所述受限發(fā)光基團(tuán)形成酰胺鍵共價(jià)連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的熒光分子探針，其特征在于，所述親水多肽的N-端氨基酸為賴氨酸，所述賴氨酸的側(cè)鏈氨基與所述疏水烷基鏈形成酰胺鍵共價(jià)連接；所述賴氨酸的α氨基與所述受限發(fā)光基團(tuán)形成酰胺鍵共價(jià)連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的熒光分子探針，其特征在于，所述疏水烷基鏈的碳鏈含有8-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為12-20個(gè)碳原子，更優(yōu)選為棕櫚酸、油酸或硬脂酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的熒光分子探針，其特征在于，所述親水多肽帶有正電荷，優(yōu)選為以帶正電荷的氨基酸為主組成的多肽，更優(yōu)選為含有精氨酸的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的熒光分子探針，其特征在于，所述受限發(fā)光基團(tuán)為受限誘導(dǎo)發(fā)光分子，優(yōu)選為四苯基乙烯分子或硅雜環(huán)戊二烯。
8.一種制備權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的突光分子探針的方法,包括:將疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽的同一端連接形成所述熒光分子探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括:在催化劑的存在下，分別使帶有羧基的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團(tuán)與親水多肽的氨基接觸，形成酰胺鍵共價(jià)連接，得到所述熒光分子探針； 優(yōu)選地，所述催化劑為2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯和N, N-二異丙基乙胺。
10.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的熒光分子探針在細(xì)胞膜標(biāo)記中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103980886SQ201410231022
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】梁興杰, 金叔賓, 張春秋, 鄒國(guó)漳, 楊科妮 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心