一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法，包括如下步驟：（1）制備測(cè)試用菌液：取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液復(fù)蘇，得測(cè)試用菌液；（2）檢測(cè)：取待檢中藥樣品，用測(cè)試用菌液檢測(cè)，確定發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%的樣品濃度以及濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線。本發(fā)明方法檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，操作簡(jiǎn)單。
【專利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥是我國(guó)的瑰寶，在防病治病和養(yǎng)生保健等方面發(fā)揮了巨大的作用。隨著中藥及其制劑應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，臨床報(bào)道其引發(fā)的不良反應(yīng)也日益增多，并有致死的報(bào)道，中藥不良反應(yīng)發(fā)生率僅次于化學(xué)藥品中的抗感染藥，且近年來(lái)有上升趨勢(shì)。關(guān)木通、廣防已、青木香等馬兜鈴酸類藥物引起嚴(yán)重腎損傷，補(bǔ)益中藥何首烏引起嚴(yán)重肝損傷、雙黃連、清開(kāi)靈等中藥注射劑引進(jìn)過(guò)敏性休克、使得中藥安全性問(wèn)題引起廣泛關(guān)注。
[0003]引發(fā)中藥不良反應(yīng)發(fā)生的因素與藥材、制劑、配伍及使用不當(dāng)?shù)让芮邢嚓P(guān)。為了保證中藥的安全性和有效性，數(shù)千年以來(lái)，中藥一直處于不斷標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的進(jìn)程中。由此可見(jiàn)，提高中藥的質(zhì)量是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的迫切需要。建立中藥質(zhì)量控制體系必須立足于中藥的特色，中藥的質(zhì)量控制方法必須能對(duì)起效的全成分(有機(jī)成分、無(wú)機(jī)成分和絡(luò)合物成分)進(jìn)行控制。只有這樣，所建立的質(zhì)量控制體系才能真正達(dá)到控制中藥質(zhì)量、保證中藥用藥安全有效的目的。
[0004]目前，我國(guó)已制定的中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有:GLP、GMP、GCP、GSP、GAP,但這些標(biāo)準(zhǔn)還遠(yuǎn)不能夠覆蓋中藥生產(chǎn)的系列環(huán)節(jié)。指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制方法已成為目前的國(guó)際共識(shí)，包括色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜和DNA指紋圖譜。但是，這些質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法仍然無(wú)法有效的保證中藥藥效的一致性和安全性。因此，有必要引入新的質(zhì)量控制方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法。
[0006]本發(fā)明快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法，包括如下步驟:
[0007](I)制備測(cè)試用菌液:取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液復(fù)蘇，得測(cè)試用菌液；
[0008](2)檢測(cè):取待檢中藥樣品，用測(cè)試用菌液檢測(cè)，確定濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線以及發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%的濃度。
[0009]濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線，是指待檢樣品濃度與發(fā)光強(qiáng)度抑制率的關(guān)系曲線。
[0010]步驟(I)中，所述發(fā)光細(xì)菌是費(fèi)氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌、青?；【捌渌侵虏“l(fā)光細(xì)菌。
[0011]步驟(I)中，所述制備測(cè)試用菌液的方法是:取型號(hào)為CS234的費(fèi)氏弧菌凍干粉I支，加入0.2-1.0ml的氯離子濃度為0.51mol/L的溶液，即得測(cè)試用菌液。
[0012]步驟(I)中，所述含氯離子的溶液的pH為5?9。
[0013]步驟(2)所述檢測(cè)的方法如下:
[0014]a、預(yù)測(cè)試:取待檢中藥樣品，用水稀釋成5個(gè)濃度的待檢液，體積百分比分別是:100%、25%、6.25%、1.5625%,0.39%，以氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待檢液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測(cè)試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15，放置5?30min，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算5個(gè)濃度的發(fā)光度抑制率；
[0015]b、確定檢測(cè)濃度的上限及下限:根據(jù)步驟a的結(jié)果，以抑制率為90?100%的任一濃度為上限，若樣品原液的抑制率未達(dá)到90%，則以樣品原液為上限；以抑制率為O?10%的任一濃度為下限；
[0016]C、測(cè)試:在步驟b確定的濃度上限和下限之間增配6?9個(gè)濃度的待檢液，以氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待檢液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測(cè)試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15，放置5?30min，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，制作濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線，計(jì)算抑制率為50%的濃度。
[0017]抑制率為50%的樣品濃度，即本發(fā)明IC5Q。
[0018]如果IC5tl值小，說(shuō)明待檢中藥的毒性大，如果IC5tl值大，說(shuō)明待檢中藥的毒性小。
[0019]步驟a和步驟c中，所述待檢液中加有含氯離子的溶液，其氯離子濃度為0.1-1.0mol/L ;所述標(biāo)準(zhǔn)液中氯離子濃度為0.51mol/L。
[0020]步驟a和步驟c中，所述待檢液和氯化鈉溶液的pH為5?9。
[0021]步驟a和步驟c中,所述菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/20。
[0022]步驟a和步驟c中，所述放置時(shí)間為15min。
[0023]前述檢測(cè)方法中，發(fā)光強(qiáng)度采用生物毒性測(cè)試儀或其他具有發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)功能的儀器。
[0024]本發(fā)明方法可以有效檢測(cè)中藥的綜合毒性，為其臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)，同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)檢測(cè)速度快:在I小時(shí)內(nèi)可以得出結(jié)果，評(píng)估其綜合毒性；
(2)操作簡(jiǎn)單:無(wú)需灌胃、靜脈注射等專業(yè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，方便易行；(3)反應(yīng)靈敏；利用現(xiàn)代靈敏的光電檢測(cè)技術(shù)，能對(duì)極微弱的光強(qiáng)度變化進(jìn)行檢測(cè)，比一般生物細(xì)胞反應(yīng)靈敏幾個(gè)數(shù)量級(jí)；(4)能對(duì)綜合毒性的大小進(jìn)行判斷；(5)細(xì)菌樣本量大，克服了動(dòng)物試驗(yàn)中樣本數(shù)量少以及個(gè)體差異等影響。
[0025]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0026]以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1濃度I費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖
[0028]圖2濃度2費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖
[0029]圖3濃度3費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖
[0030]圖4濃度4費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖
[0031]圖5濃度5費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖
[0032]圖610種中藥對(duì)發(fā)光細(xì)菌的濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線
[0033]實(shí)施例1本發(fā)明毒性檢測(cè)方法
[0034]I實(shí)驗(yàn)材料[0035]1.1 菌種
[0036]費(fèi)氏弧菌凍干粉(CS234)，購(gòu)自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，_20°C避光保存。
[0037]1.2主要試劑
[0038]復(fù)蘇稀釋液:0.51mol/L氯化鈉溶液；[0039]滲透壓調(diào)節(jié)液:3.42mol/L氯化鈉溶液；
[0040]1.3主要儀器及器材
[0041]LUMIStox300生物毒性測(cè)試儀及配套的LUMIStherm預(yù)溫槽和測(cè)試管(Dr.BrunoLange GmbH)、BCD-539WF電冰箱(海爾)、PB-10酸度計(jì)(賽多利斯)
[0042]2實(shí)驗(yàn)方法
[0043]2.1測(cè)試用菌液的制備
[0044]從冰箱冷凍室(_20°C)取出費(fèi)氏弧菌凍干粉I支，置于室溫(20°C左右)平衡15min后，加入0.2-1.0ml復(fù)蘇稀釋液，于室溫下放置lOmin，即可用于測(cè)試。
[0045]2.2預(yù)試驗(yàn)
[0046]將中藥樣品用蒸餾水按1:4稀釋成5個(gè)濃度:100%、25%、6.25%、1.5625%,0.39%，按2.3所述制備成待測(cè)樣品溶液，按2.5所述方法粗測(cè)一遍，確定上限及下限的濃度范圍。上限為抑制率達(dá)到90~100%時(shí)樣品的濃度，若樣品原液的抑制率未達(dá)到90%，則以樣品原液為上限；下限為抑制率達(dá)到O~10%時(shí)樣品的濃度。
[0047]2.3待測(cè)樣品溶液制備
[0048]在上限和下限之間根據(jù)需要再增配6~12個(gè)濃度。將樣品用蒸餾水稀釋到各濃度，再將各濃度樣品與滲透壓調(diào)節(jié)液以17:3的比例混合，配制成待測(cè)樣品溶液，使待測(cè)樣品溶液氯離子濃度為0.51mol/L。
[0049]2.4空白對(duì)照液(標(biāo)準(zhǔn)液)制備
[0050]采用復(fù)蘇稀釋液作為空白對(duì)照液。
[0051]2.5發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定
[0052]待測(cè)樣品每個(gè)濃度準(zhǔn)備3支測(cè)試管，每支測(cè)試管加入1ml待測(cè)樣品，設(shè)3個(gè)平行樣；空白對(duì)照液也取3支測(cè)試管，每支測(cè)試管加入1ml復(fù)蘇稀釋液，同樣設(shè)置3個(gè)平行樣。用移液器向各測(cè)試管中依次加入0.05ml測(cè)試用菌液，輕輕振蕩，使之充分混勻，每個(gè)測(cè)試管加菌液的間隔時(shí)間為15秒，于育溫槽中放置15min后用生物毒性測(cè)試儀依次間隔15秒測(cè)定各測(cè)試管的發(fā)光強(qiáng)度，按下式計(jì)算抑制率，以IC5tl(抑制率等于50%時(shí)該樣品的濃度值)表示各樣品的毒性大小，IC50值越小,毒性越大。
[0053]
^nzfcll空白對(duì)照液平均發(fā)光強(qiáng)度值-樣品平均發(fā)光強(qiáng)度值 νιΛΛ()/抑制率(％) = - X100%
空白對(duì)照液平均發(fā)光強(qiáng)度值
[0054]2.6方法學(xué)考察
[0055]2.6.1測(cè)定方法影響因素考察
[0056]2.6.1.1時(shí)間對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響
[0057]測(cè)試管中加入不同體積的復(fù)蘇稀釋液和測(cè)試用菌液，制備成不同初始發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)試樣品(總體積為1.05ml，樣品I為1.04ml復(fù)蘇稀釋液加入0.01ml測(cè)試用菌液，樣品2為1.02ml復(fù)蘇稀釋液加入0.03ml測(cè)試用菌液，樣品3為1.0Oml復(fù)蘇稀釋液加入0.05ml測(cè)試用菌液，樣品4為0.95ml復(fù)蘇稀釋液加入0.1ml測(cè)試用菌液，樣品5為0.85ml復(fù)蘇稀釋液加入0.2ml測(cè)試用菌液)，輕輕振蕩，使之充分混勻，每組樣品做3個(gè)平行樣。從混勻開(kāi)始計(jì)時(shí)，每I分鐘測(cè)定I次發(fā)光強(qiáng)度值，算出3個(gè)平行樣的平均值，比較時(shí)間對(duì)不同初始發(fā)光強(qiáng)度的影響。
[0058]2.6.1.2pH值對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響
[0059]取復(fù)蘇稀釋液加入NaOH或HCl，分別配成pH為3，4，5，6，7，8，9，10，11的復(fù)蘇稀釋液。分別取各PH值復(fù)蘇稀釋液Iml于測(cè)試管中(每組做3個(gè)平行樣)，向各測(cè)試管中依次加入0.05ml測(cè)試用菌液,輕輕振蕩，使之充分混勻，分別于放置5min, IOmin, 15min后用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度值，比較PH值對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。
[0060]2.6.2精密度考察
[0061]2.6.2.1重復(fù)性考察
[0062]按上述確定的方法對(duì)3批樣品進(jìn)行測(cè)試、每批樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0063]2.6.2.2中間精密度考察
[0064](I)不同人員試驗(yàn)
[0065]按上述確定的方法，由兩個(gè)工作人員在同一工作日對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)試，對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0066](2)不同工作日試驗(yàn)
[0067]按上述確定的方法，由同一工作人員在不同工作日對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)試，對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0068]3 結(jié)果
[0069]3.1測(cè)定方法影響因素考察
[0070]3.1.1時(shí)間對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響
[0071]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I和圖1所示:
[0072]表I時(shí)間對(duì)不同初始發(fā)光強(qiáng)度的影響(i±S )
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)制備測(cè)試用菌液:取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液復(fù)蘇，得測(cè)試用菌液； (2)檢測(cè):取待檢中藥樣品，用測(cè)試用菌液檢測(cè)，確定濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線以及發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟(I)中，所述發(fā)光細(xì)菌是費(fèi)氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌、青?；【捌渌侵虏“l(fā)光細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟(I)中，所述制備測(cè)試用菌液的方法是:取型號(hào)為CS234的費(fèi)氏弧菌凍干粉I支，加入0.2-1.0ml的氯離子濃度為0.51mol/L的溶液，即得測(cè)試用菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟(I)中，所述含氯離子的溶液的pH為5?9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟(2)所述檢測(cè)的方法如下: a、預(yù)測(cè)試:取待檢中藥樣品，用水稀釋成5個(gè)濃度的待檢液，體積百分比分別是:100%、25%,6.25%、1.5625%,0.39%，以氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待檢液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測(cè)試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15，放置5?30min，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算5個(gè)濃度的發(fā)光度抑制率； b、確定檢測(cè)濃度的上限及下限:根據(jù)步驟a的結(jié)果，以抑制率為90?100%的任一濃度為上限，若樣品原液的抑制率未達(dá)到90%，則以樣品原液為上限；以抑制率為O?10%的任一濃度為下限； C、測(cè)試:在步驟b確定的濃度上限和下限之間增配6?9個(gè)濃度的待檢液，以氯離子濃度為0.1-1.0mol/L的溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，在所述待檢液和標(biāo)準(zhǔn)液中加入測(cè)試用菌液，菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/25?1/15，放置5?30min，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，制作濃度_效應(yīng)動(dòng)力曲線，計(jì)算抑制率為50%的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟a和步驟c中，所述待檢液中加有含氯離子的溶液，氯離子的濃度為0.1-1.0mol/L ;所述標(biāo)準(zhǔn)液中氯離子濃度為0.51mol/L0
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟a和步驟c中，所述待檢液和氯化鈉溶液的pH為5?9。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟a和步驟c中，所述菌液加入量為待檢液或標(biāo)準(zhǔn)液體積的1/20。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)試方法，其特征在于:步驟a和步驟c中，所述放置時(shí)間為15min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任意一項(xiàng)所述的測(cè)試方法，其特征在于:檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度采用生物毒性測(cè)試儀或其他具有發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)功能的儀器。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103868916SQ201410115374
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】趙軍寧, 鄢良春 申請(qǐng)人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院