一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種毛細(xì)管電泳涂層，特別涉及一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法。該涂層以聚合物分子刷pOEGMA為功能單體，通過(guò)化學(xué)鍵合方法修飾于石英毛細(xì)管內(nèi)壁。應(yīng)用本發(fā)明所述方法制備的pOEGMA涂層毛細(xì)管具有優(yōu)異的抑制蛋白吸附的能力，從而能夠有效解決毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)過(guò)程中的非特異性吸附問(wèn)題，能夠顯著提高方法對(duì)不同蛋白的分離效率。同時(shí)，該涂層物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在不影響分離效率的前提下，可以反復(fù)使用數(shù)百次。
【專利說(shuō)明】一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種毛細(xì)管電泳涂層，特別涉及一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是生物體的主要組成物質(zhì)及生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是一類含氮的天然高聚物，復(fù)雜生物體系中的蛋白分離分析是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。毛細(xì)管電泳是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳所用的石英毛細(xì)管，未經(jīng)修飾的毛細(xì)管內(nèi)壁表面由于與蛋白會(huì)發(fā)生靜電相互作用，同時(shí)由于范德華力和氫鍵相互作用等的影響，在毛細(xì)管內(nèi)壁產(chǎn)生非特異性吸附，從而對(duì)復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)的分離分析造成嚴(yán)重影響。特別是對(duì)于低豐度蛋白而言，這種非特異性吸附容易導(dǎo)致其無(wú)法與高豐度蛋白完全分離，從而造成分析結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性，導(dǎo)致分離效率降低，樣品回收率低，基線不穩(wěn)定，結(jié)果的重復(fù)性變差，定性定量困難，因此人們一直在探索各種方法來(lái)減小毛細(xì)管電泳過(guò)程中的蛋白吸附現(xiàn)象，提高分離效率。
[0003]POEGMA,是OEGMA單體通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，在毛細(xì)管內(nèi)壁聚合，形成分子刷聚合物，其末端是OEG的羥基基團(tuán)，抗非特異性吸附能力強(qiáng)，同時(shí)具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用(Adv.Mater.,2009, 21 (23)，2441 - 2446; J.Biomater.Sc1.2009,20: 1579; Soft Matter.2010，6，2115)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，得到的POEGMA涂層具有很好的抗蛋白吸附能力。
[0005]本發(fā)明所述的制備方法包括以下步驟:
1)毛細(xì)管預(yù)處理:首先用Imol/L H2SO4W洗毛細(xì)管空柱1_2 h，然后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，最后用無(wú)水乙醇沖洗30 min ；
2)硅烷化處理:預(yù)處理后的毛細(xì)管用體積比為8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液沖洗3h，使乙氧基與毛細(xì)管壁上的S1-OH反應(yīng)，將活性端基胺基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上，之后用無(wú)水乙醇沖洗過(guò)夜，然后用氮?dú)獯蹈?，?20° C下烘烤2小時(shí)，進(jìn)行老化處理，以使涂層固化；
3)分子刷聚合物pOEGMA涂層的制備:步驟2)制備的毛細(xì)管用4_6mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液沖洗lh，之后用二氯甲烷沖洗2h，再用甲醇沖洗過(guò)夜，然后用pOEGMA合成溶液沖洗24h，接著在氮?dú)猸h(huán)境下用甲醇沖洗I h，最后用除氧的蒸餾水沖洗I h。
[0006]所述步驟3)中合成pOEGMA合成溶液的制備方法為:在圓底燒瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸餾水，氮吹10 min，稱180 mg聯(lián)吡啶加入上述混合物中，持續(xù)攪拌，再加Λ 75mg的溴化亞銅以及4.3ml的OEGMA單體，攪拌均勻，在移入毛細(xì)管前再次氮吹15min。
[0007]步驟I)所述毛細(xì)管指內(nèi)徑為5-350微米的石英毛細(xì)管。
[0008]步驟I)中以8-10 μ 1/h的流速通I mol/L H2SO4沖洗；步驟2)中以8-10 μ I/h的流速通體積比為8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液；步驟3)以10 μ 1/h的流速通4-6 mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液，以10 μ 1/h的流速通pOEGMA合成溶液。
[0009]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為:
首次將POEGMA引入毛細(xì)管電泳，利用其優(yōu)異的抑制蛋白吸附能力將其修飾的毛細(xì)管內(nèi)壁應(yīng)用于蛋白分離中。該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低。同時(shí)，本方法制備的POEGMA涂層與毛細(xì)管內(nèi)壁間是通過(guò)化學(xué)鍵合作用修飾上去的，比目前廣泛報(bào)導(dǎo)的動(dòng)態(tài)涂層方法具有更好的穩(wěn)定性，在不影響分離效率的前提下，可以反復(fù)使用數(shù)百次。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為實(shí)施例1毛細(xì)管電泳涂層制備過(guò)程示意圖，圖1中A為毛細(xì)管固定示意圖，B為毛細(xì)管電泳涂層制備過(guò)程示意圖；其中1.氮?dú)膺M(jìn)口；2.氮?dú)獬隹冢?.通入合成溶液的毛細(xì)管4.環(huán)氧基樹脂固定裝置。
[0011]圖2為應(yīng)用毛細(xì)管對(duì)6種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離的色譜圖，圖2中A為本發(fā)明所述POEGMA涂層毛細(xì)管分離六種蛋白，B為商品涂層毛細(xì)管分離六種蛋白，C為無(wú)修飾毛細(xì)管分離六種蛋白；其中，5細(xì)胞色素C，6溶菌酶，7核糖核酸酶A，8豬血紅蛋白，9肌血紅蛋白，10牛血清白蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1:在毛細(xì)管內(nèi)合成pOEGMA涂層 以下是毛細(xì)管內(nèi)合成POEGMA的具體步驟:
I)準(zhǔn)備pOEGMA合成溶液:首先，在圓底燒瓶加入6mL的甲醇以及1.5mL的二次水，氮吹10 min,稱180 mg聯(lián)卩比唳加入混合物中，持續(xù)攪拌。再加入75mg的溴化亞銅，以及4.3ml的OEGMA單體，在移入注射器前再次氮吹15min。
[0013]2)毛細(xì)管柱首先插入注射器針頭，用環(huán)氧基樹脂固定直到涂層制作完成(如圖1中A所示)。
[0014]3)以10 μ 1/h的流速通2小時(shí)H2SO40
[0015]4)通二次水沖洗過(guò)夜。
[0016]5)通乙醇30分鐘。
[0017]6)以10 μ Ι/h流速通10%氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液3小時(shí)，使乙氧基與毛細(xì)管壁上的S1-OH反應(yīng)，將活性端基胺基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上。
[0018]7)通乙醇過(guò)夜。
[0019]8)氮?dú)獯蹈伞?br> [0020]9)在120° C下烘烤2小時(shí)，進(jìn)行老化處理，以使涂層固化。
[0021]10)以10 μ 1/h的流速通6mL添加了 41 μ L三乙胺和37uL溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液I小時(shí)。[0022]11)通二氯甲烷2小時(shí)。
[0023]12)通甲醇過(guò)夜。
[0024]13)以10 μ 1/h的流速通pOEGMA合成溶液24小時(shí)，毛細(xì)管的另一端浸沒在氮?dú)猸h(huán)境下的甲醇中(如圖1中B所示)。
[0025]14)通甲醇I小時(shí)。
[0026]15)用除氧的二次水沖洗I小時(shí)。
[0027]16)在注射針頭端切斷毛細(xì)管，用保鮮膜包裹好末端儲(chǔ)存。
[0028]實(shí)施例2
一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，步驟如下:
1)毛細(xì)管預(yù)處理:首先用1mol/L H2SO4W洗毛細(xì)管空柱1_2 h，然后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，最后用無(wú)水乙醇沖洗30 min ； 2)硅烷化處理:預(yù)處理后的毛細(xì)管用體積比為8%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液沖洗3h，使乙氧基與毛細(xì)管壁上的S1-OH反應(yīng)，將活性端基胺基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上，之后用無(wú)水乙醇沖洗過(guò)夜，然后用氮?dú)獯蹈?，?20° C下烘烤2小時(shí)，進(jìn)行老化處理，以使涂層固化；
3)分子刷聚合物pOEGMA涂層的制備:步驟2)制備的毛細(xì)管用4mL含41μ L三乙胺和37 UL溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液沖洗lh，之后用二氯甲烷沖洗2h，再用甲醇沖洗過(guò)夜，然后用pOEGMA合成溶液沖洗24h，接著在氮?dú)猸h(huán)境下用甲醇沖洗I h，最后用除氧的蒸餾水沖洗I h。
[0029]合成pOEGMA合成溶液的制備方法為:在圓底燒瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸懼水，氮吹10 min,稱180 mg聯(lián)吡唳加入上述混合物中，持續(xù)攪拌,再加入75mg的溴化亞銅以及4.3ml的OEGMA單體，攪拌均勻，在移入毛細(xì)管前再次氮吹15min。
[0030]實(shí)施例3:三種毛細(xì)管分離6種蛋白的對(duì)比實(shí)驗(yàn)
電泳條件如下:分離毛細(xì)管總長(zhǎng)度為42cm,有效長(zhǎng)度為32cm,內(nèi)徑為75--m;運(yùn)行緩沖液為30mmol/L, pH=3.5的PBS緩沖液；運(yùn)行電壓:18kV ;進(jìn)樣:壓力進(jìn)樣0.5psi，5sec ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm。
[0031]I)無(wú)修飾毛細(xì)管分離六種蛋白:細(xì)胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，豬血紅蛋白，肌血紅蛋白，牛血清白蛋白，辣根過(guò)氧化物酶的分離譜圖如圖2中C所示，無(wú)法分離。
[0032]2)商品涂層毛細(xì)管分離六種蛋白:細(xì)胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，豬血紅蛋白，肌血紅蛋白，牛血清白蛋白，辣根過(guò)氧化物酶的分離譜圖如圖2中B所示，得到了基線分離，分離效果較好。
[0033]3)本發(fā)明所述POEGMA涂層毛細(xì)管分離六種蛋白:細(xì)胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，豬血紅蛋白，肌血紅蛋白，牛血清白蛋白，辣根過(guò)氧化物酶。將混合的蛋白用本發(fā)明所述的毛細(xì)管涂層進(jìn)行蛋白電泳分離，本實(shí)施例1制備的POEGMA涂層的毛細(xì)管測(cè)試結(jié)果如圖2中A所示。從圖中可以看出，應(yīng)用本發(fā)明制備的涂層毛細(xì)管對(duì)六種蛋白進(jìn)行分離，所得到的分離效果最高。
[0034]本發(fā)明制備的pOEGMA涂層毛細(xì)管具有優(yōu)異的抑制蛋白吸附的能力，從而能夠有效解決毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)過(guò)程中的非特異性吸附問(wèn)題，能夠顯著提高對(duì)不同蛋白的分離效率。同時(shí)，該涂層物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，制得的涂層毛細(xì)管重復(fù)使用300次未見明顯變化。
[0035]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟: 1)毛細(xì)管預(yù)處理:首先用Imol/L H2SO4W洗毛細(xì)管空柱1_2 h，然后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，最后用無(wú)水乙醇沖洗30 min ； 2)硅烷化處理:預(yù)處理后的毛細(xì)管用體積比為8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液沖洗3h，使乙氧基與毛細(xì)管壁上的S1-OH反應(yīng)，將活性端基胺基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上，之后用無(wú)水乙醇沖洗過(guò)夜，然后用氮?dú)獯蹈?，?20° C下烘烤2小時(shí)，進(jìn)行老化處理，以使涂層固化； 3)分子刷聚合物pOEGMA涂層的制備:步驟2)制備的毛細(xì)管用4_6mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液沖洗lh，之后用二氯甲烷沖洗2h，再用甲醇沖洗過(guò)夜，然后用POEGMA合成溶液沖洗24h，接著在氮?dú)猸h(huán)境下用甲醇沖洗I h，最后用除氧的蒸餾水沖洗I h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，所述步驟3)中合成pOEGMA合成溶液的制備方法為:在圓底燒瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸餾水，氮吹10 min,稱180 mg聯(lián)卩比唳加入上述混合物中，持續(xù)攪拌,再加入75mg的溴化亞銅以及4.3ml的OEGMA單體，攪拌均勻，在移入毛細(xì)管前再次氮吹15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，其特征在于:步驟I)所述毛細(xì)管指內(nèi)徑為5-350微米的石英毛細(xì)管。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛細(xì)管涂層的制備方法，其特征在于:步驟I)中以8-10 μ 1/h的流速通I mol/L H2SO4沖洗；步驟2)中以8-10 μ 1/h的流速通體積比為8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液；步驟3)以10 μ 1/h的流速通4-6 mL含41μ L三乙胺和37 μ L溴異丁酰溴的二氯甲烷溶液，以10 μ Ι/h的流速通pOEGMA合成溶液。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK103808786SQ201410067416
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】郭隆華, 黃蓉, 邱彬, 林振宇, 陳國(guó)南 申請(qǐng)人:福州大學(xué)