一種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，屬于分析檢測領域，該方法是取豬毛，將豬毛用有機溶劑洗滌后晾干，將晾干后的豬毛放入裝有有機溶劑的離心管中，并在轉動器上旋轉；經上述處理后將離心管放入離心機中離心，收集上層清夜；將所述上清液用氮氣流濃縮吹干，吹干后用PBS溶液溶解，采用放射免疫測定法測定溶液中皮質醇含量，該方法是一種對豬非侵害性，無應激的檢測其生理狀態(tài)的手段，簡單易行，成本低，對于監(jiān)測豬健康福利狀況具有十分積極的作用。
【專利說明】一種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測領域，具體涉及一種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法。
【背景技術】
[0002]我國是一個養(yǎng)豬大國，但是養(yǎng)殖業(yè)長期以來對“快速”和“高產”的盲目追求帶來一系列嚴重的環(huán)境和社會問題，如養(yǎng)殖環(huán)境惡化、環(huán)境污染嚴重、畜禽流行病頻發(fā)，這不僅造成巨大的經濟損失，而且危及人類的健康。在不規(guī)范的養(yǎng)殖或高強度的集約化養(yǎng)殖模式下，豬經常受到各種應激(斷奶、混群、閹割、運輸?shù)?，長期的應激最終使得豬免疫力和抵抗力下降。經常依賴添加過量的抗生素和各種疫苗來維持動物健康或者生命，不但嚴重影響豬自身健康，而且使得豬肉食品的質量和安全得不到保障，從而威脅人類健康，使我國的畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展受到嚴重的影響。
[0003]動物應激反應的最主要特征是下丘腦-垂體-腎上腺軸
(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis)活性增加。HPA 軸興奮的終端產物是糖皮質激素。應激時，迅速升高的糖皮質激素有助于機體動員能量，應對應激環(huán)境，對動物的生存有重要意義。但一旦應激源長時間存在，HPA軸持續(xù)興奮，血液中的糖皮質激素水平一直保持在高水平，就會對機體產生負面作用，使生長受阻，免疫力下降。
[0004]目前判斷豬應激的方法主要是通過檢測其血液中的皮質醇。該方法在采集血液過程中需要將豬進行保定，采集過程較為困難，同時保定又給豬帶來了新的應激，使測定結果難以給出準確的判斷。因此，目前畜牧業(yè)生產上迫切需要一種簡單、易行，對豬應激較小的，且能夠反映豬皮質醇水平的方法。近年來的人類醫(yī)學研究表明，毛發(fā)中含有皮質醇，并且可以反映應激狀況。但是在豬上，由于其毛發(fā)特性與人類的差異，毛發(fā)粗硬，附有油脂以及其他雜物，使得其處理過程等比較復雜，并且由于種間的差異豬毛中皮質醇含量與人類也不相同，目前關于豬毛發(fā)中皮質醇含量的測定尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述技術問題提供一種從豬毛中提取和測定皮質醇的方法，該方法是一種非侵害性，無應激的檢測手段，簡單易行，成本低，對于監(jiān)測豬健康福利狀況具有十分積極的作用。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn):
[0007]—種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，該方法包括以下步驟:
[0008]I)取豬毛，用有機溶劑洗滌后晾干；
[0009]2)將晾干后的豬毛和有機溶劑混合，得到混合物；
[0010]3)將所述的混合物360°旋轉后，放入離心機中離心，收集上層清夜；
[0011]4)將所述的上層清液用氮氣流濃縮吹干，吹干后用PBS溶液溶解，溶解后采用放射免疫測定法測定皮質醇含量。
[0012]步驟I)中所述豬毛的長度為0.8?1.2mm。步驟I)中所述洗滌的次數(shù)為3次。[0013]步驟I)中所述有機溶劑為無水甲醇，步驟2)中所述的有機溶劑為無水甲醇。
[0014]步驟2)中豬毛與有機溶劑的質量比為1:3.5?4.5。
[0015]步驟3)中所述的360°旋轉是在轉動器中進行，旋轉的速度為28?32rpm，旋轉的時間為22?24h。
[0016]步驟3)中所述離心是以轉速為4500rpm的速度轉動12?18分鐘,所述步驟3)中的離心是在溫度為20°C的條件下進行。
[0017]所述步驟4)中PBS溶液的ΡΗ=7.4，濃度為0.lmol/L。
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]隨著動物福利問題受到越來越廣泛的關注，采集豬的毛發(fā)，并進行皮質醇的提取和檢測，是一種對豬非侵害性，無應激的檢測手段，簡單易行，成本低，對于監(jiān)測豬健康福利狀況具有十分積極的作用。皮質醇是反映機體應激狀態(tài)的一個重要指標，目前反映豬的皮質醇水平都是通過檢測其血液中皮質醇含量，以往的研究表明中國地方豬種太湖豬血液皮質醇含量顯著高于外來豬品種(78.29±6.89vs47.88±4.73，P〈0.05)，利用本方法我們檢測了豬毛發(fā)中皮質醇，其結果與血液結論一致，表明用該方法檢測可以基本反映動物機體的皮質醇水平。另一方面采集豬血液需要將豬進行固定，采集過程中豬會盡力反抗，給豬造成較大的應激，也使得檢測值易出現(xiàn)較大的波動，而采集豬毛發(fā)對其沒有應激，樣本采集方便，這無疑給豬健康福利狀況的監(jiān)測提供了極大的幫助。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此:
[0021]本發(fā)明技術方案中采用放射免疫測定法測定溶液中皮質醇含量參照Vaccinationinhibits TLR2transcription via suppression of GR nuclear translocationand binding to TLR2promoter in porcine lung infected with Mycoplasmahyopneumoniae[J].Veterinary Microbiology, 2013, 167(3-4):425-433。
[0022]儀器:I125放射免疫試劑盒測定溶液中皮質醇含量n0.DlOPZB，Beijing NorthInstitute of Biological Technology (北京北方生物技術研究所)，China.[0023]旋轉器的型號:H5100-230Vser.N0.: 11090975,廠家:Labnetinternational, Inc.[0024]實施例1
[0025]I)選取體重，年齡相當?shù)奶i和長白豬，各5頭，分別采集頸部相同部位的豬毛，豬毛的長度為0.8?1.2mm ;各取200mg豬毛,用IOml無水甲醇洗漆3遍,每遍不超過3分鐘，可在振蕩器上振蕩洗滌；
[0026]2)將洗滌后的豬毛晾干，并與Iml無水甲醇混合，得到混合物；
[0027]3)將所述的混合物在轉速為30rpm的轉動器上360°旋轉24h，之后在溫度為20°C的條件下放入離心機，離心機的轉速為4500rpm/min，離心15分鐘后收集上層清夜；
[0028]4)將收集的上層清夜用氮氣流濃縮吹干后，用PBS溶液溶解(PH=7.4,0.1M)，體積為150ul，采用放射免疫測定法測定溶液中皮質醇含量，
[0029]具體測定步驟如下:
[0030]1.根據(jù)試劑盒提供的標準品，將O標準用Iml蒸餾水溶解，其余標準分別加入0.5ml蒸餾水溶解。溶解15分鐘后搖勻方可使用。溶解后其濃度分別為O，10，50，100，200，500ng/ml，分別標記為S0, SI, S2, S3, S4, S5。另取50 μ I SO標準品標記為NSB管。
[0031]2.NSB管，各稀釋完成的標準品及樣品上樣量都為50μ 1，依次加入100 μ II125-Cor.標記物。
[0032]3.往NSB管中單獨加入100 μ I蒸餾水，其他管都加入100 μ I兔抗-Cor.抗體。
[0033]4.搖勻，37°C溫育45分鐘。
[0034]5.各個管中再依次加入500 μ I驢抗兔免疫分離劑,充分搖勻后，室溫放置15分鐘，3500rpm/min,4°C離心15分鐘,吸棄上清,測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。
[0035]計算公式:設SO管為B0,各標準管或樣品管計數(shù)為B,非特異管計數(shù)為NSB,
[0036]B/BO=(B-NSB)/(BO-NSB)X100%
[0037]再取1git計算:
[0038]Logit=In[(B/BO)/(1-B/B0)]
[0039]以標準濃度取log值為橫坐標，對應的1git值為縱坐標作圖。
[0040]對數(shù)據(jù)進行分析，結果如表1，其中，毛發(fā)皮質醇含量為平均值。
[0041]表1為不同品種豬的毛發(fā)皮質醇含量測定
[0042]
【權利要求】
1.一種從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，該方法包括以下步驟: 1)取豬毛，用有機溶劑洗滌后晾干； 2)將晾干后的豬毛和有機溶劑混合，得到混合物； 3)將所述的混合物360°旋轉后，離心并收集上層清夜； 4)將所述的上層清液用氮氣流濃縮吹干，吹干后用PBS溶液溶解，溶解后采用放射免疫測定法測定皮質醇含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:步驟I)中所述豬毛的長度為0.8?1.2mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:步驟I)中所述有機溶劑為無水甲醇，步驟2)中所述的有機溶劑為無水甲醇。
4.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:所述步驟O中洗滌的次數(shù)為3次。
5.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:步驟2)中豬毛與有機溶劑的質量比為1:3.5?4.5。
6.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:步驟3)中所述的360°旋轉是在轉動器中進行，旋轉的速度為28?32rpm，旋轉的時間為22?24h。
7.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:步驟3)中所述的離心是以轉速為4500rpm的速度轉動12?18分鐘。
8.根據(jù)權利要求1或7所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:所述步驟3)中的離心是在溫度為20°C的條件下進行。
9.根據(jù)權利要求1所述的從豬毛中提取和檢測皮質醇的方法，其特征在于:所述步驟4)中PBS溶液的PH=7.4，濃度為0.lmol/L。
【文檔編號】G01N33/53GK103776997SQ201410064922
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2014年2月26日
【發(fā)明者】楊曉靜, 黃燕平, 馬文強, 趙茹茜 申請人:南京農業(yè)大學