魚鱗中作為對于慢性應(yīng)激的生物標記物的糖皮質(zhì)激素的量化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及確定魚類在長時間段內(nèi)經(jīng)歷的應(yīng)激水平，其可以用于評估魚類的福利狀態(tài)。更具體地，本發(fā)明涉及從魚中取樣的鱗片以及其他鈣化組織如耳石、脊和軟鰭條用于量化所述鱗片/基質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素水平的用途。所述糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮的水平在鱗片中隨時間累積并且反映魚類在其生命期間經(jīng)歷的并且影響其應(yīng)激水平的長期的和應(yīng)激性狀態(tài)。因此，本發(fā)明公開了，使用鱗片作為用于所述應(yīng)激激素的準確和精確量化的邏輯可行并且非侵入性的基質(zhì)，以量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法。
【專利說明】魚鱗中作為對于慢性應(yīng)激的生物標記物的糖皮質(zhì)激素的量化
[0001] 發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及確定魚類經(jīng)歷的應(yīng)激水平，其可以用于評估魚類的慢性應(yīng)激狀態(tài)。更 具體地，本發(fā)明涉及從魚中取樣的鱗片以及其他鈣化組織如脊、軟鰭條和耳石用于量化所 述鱗片和其他基質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素水平的用途。所述糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮的水平 在鱗片中隨時間累積并且反映魚類在其生命期間經(jīng)歷的并且影響其應(yīng)激水平的長期的和 應(yīng)激性狀態(tài)。因此，本發(fā)明公開了，使用鱗片作為用于所述應(yīng)激激素的準確和精確量化的邏 輯可行并且非侵入性的基質(zhì)，以量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 全世界范圍內(nèi)，魚類越來越引起公共、科學(xué)和政治的興趣。娛樂和商業(yè)漁場在我們 社會中是重要的：魚類問題在與保護生物學(xué)（1)和環(huán)境保護工作(例如，氣候改變、新型食肉 動物、新型動物-環(huán)境關(guān)系對應(yīng)激的影響以及因此對健康(fitness)的影響）（2、3)有關(guān)的討 論中占據(jù)高度相關(guān)的位置。人類活動（例如，能量生產(chǎn)、船運交通、工業(yè)污染)損害了野生種 群(4)。因此，各種國際性監(jiān)測方案旨在科學(xué)地闡明它們對海洋生態(tài)位(niche)的健康狀態(tài) 的影響。對于淡水種群來說存在相似的情形，因為隨著農(nóng)業(yè)擴張，它們處于土壤侵蝕、肥料 等的威脅下。人類人口持續(xù)膨脹，使得對可持續(xù)食物生產(chǎn)的需求成為全球的首要優(yōu)先問題。 魚肉蛋白質(zhì)是用于人類消耗的最重要的蛋白質(zhì)來源之一。既然漁場在產(chǎn)率方面受限，水產(chǎn) 養(yǎng)殖在世界范圍迅速擴張并且對農(nóng)民施加了日益增加的壓力以最佳、可持續(xù)且動物友好的 方式生產(chǎn)(5、6)。大量的魚類(例如斑馬魚(況1^ &行811)和鏘魚(1116(1&1?1))在生物醫(yī)學(xué)研究中 (例如在骨生理研究中）用作脊椎動物模型和嚙齒動物的替代方案。在全球經(jīng)濟輸出減少的 同時維持該領(lǐng)域中研究驅(qū)動的創(chuàng)新的必要性增加了對魚類的開發(fā)。在最近，隨著大量的魚 類參與到漁場(7)、迅速增長和加強的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)(8、9)、公共水族館（10、11)和科學(xué)研究 實驗室（12)中，與魚類受折磨和福利相關(guān)的倫理學(xué)引起了更多的注意。理解和明白作為魚 類開發(fā)中管理、控制和做決策的基礎(chǔ)的魚類生物學(xué)對來自大量學(xué)科(從分子生物學(xué)到生態(tài)-生理學(xué)）、從多個角度(所有不同的利益相關(guān)者)觀察并且代表高度具體且珍貴的專業(yè)知識 的所包括的那些帶來了明顯的挑戰(zhàn)。在該框架下，用于評估魚類中的應(yīng)激尤其是慢性應(yīng)激 的水平的新型的科學(xué)驗證的生物標記物是最重要的。
[0004] 魚類福利容易被損害，并且產(chǎn)生了共識:適當(dāng)?shù)母＠u估需要基于動物的生理指 標優(yōu)于較不一致的、間接農(nóng)業(yè)相關(guān)的參數(shù)如水質(zhì)。然而，對于用于慢性應(yīng)激的實際、可靠和 驗證的生物標記物存在不足。經(jīng)常使用的、似乎符合邏輯的用于魚類的生物標記物是"應(yīng)激 類固醇"皮質(zhì)醇的血液水平。面對應(yīng)激性刺激的魚類通過激活下丘腦-垂體-腎間組織 (hypothalamic-pituitary-interrenal，HPI_)軸啟動內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)以將皮質(zhì)醇（13、14) 釋放至血液中。皮質(zhì)醇誘發(fā)一系列生理和行為變化（15-17)，這允許魚類應(yīng)對改變的環(huán)境 (18-20)。廣泛識別了短期皮質(zhì)醇行為的適應(yīng)性的值(21、22)。關(guān)于持久性應(yīng)激及其對健康、 生長、和繁殖的主要有害后果所知甚少（19、20)。穩(wěn)健、容易發(fā)揮作用并且科學(xué)驗證的慢性 應(yīng)激生物標記物的定義因此是最重要的。魚類血漿中的糖皮質(zhì)激素水平顯示出晝夜變化 (23)，不顯示魚類對應(yīng)激的終生暴露，并且提供不多于一個在取樣時的皮質(zhì)醇狀態(tài)的快照 (snapshot) (24、25)。此外，血液取樣是侵入性的并且由于網(wǎng)捕、空氣暴露和處理而不可避 免地對魚類造成混亂應(yīng)激(confounding stress)。這使得血衆(zhòng)皮質(zhì)醇在遇到應(yīng)激物之后數(shù) 分鐘水平迅速升高時易于產(chǎn)生偏差（13)。用于促進血液取樣的麻醉劑其本身可以降低或阻 斷HPI軸的活化，從而影響血液中的皮質(zhì)醇釋放并且得到錯誤的結(jié)果（26、27)。限制也適用 于在備選基質(zhì)如黏液(28、29 )、腸內(nèi)容物(29 )、排泄物(30)和水(31、32)中的皮質(zhì)醇的測定。 相關(guān)文獻缺乏關(guān)于適用于慢性應(yīng)激評價的基質(zhì)中的皮質(zhì)醇的數(shù)據(jù)。迄今為止，大多數(shù)研究 僅提出了皮質(zhì)醇，并且關(guān)于一種或多種糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生通路(33)或它們在慢性應(yīng)激中的重 要性的報道很少。魚類記錄了（非)生物事件并且將該歷史儲存在鈣化組織中（34-37)。與鳥 類的羽毛(38)和哺乳動物的毛發(fā)(39)-樣，用于魚類中慢性應(yīng)激評估的理想基質(zhì)應(yīng)該至少 滿足以下標準：（i)糖皮質(zhì)激素的結(jié)合;（ii)緩慢但持久性的生長;和(iii)取樣容易。
[0005] 骨鱗(elasmoid scale)，鈣化皮膚外骨骼結(jié)構(gòu)(40)，同魚類一起生長，并且由非細 胞膠原基質(zhì)組成，其在外層被羥基磷灰石鈣礦物質(zhì)化并且襯有單層具有成骨細胞樣和破骨 細胞樣性質(zhì)的細胞。在移除時，鱗片將會在數(shù)天內(nèi)重新生成（41)。鱗片是內(nèi)分泌刺激的靶 標。在虹鱒魚(rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)的造骨細胞細胞溶質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了高親 和性、低容量的雌二醇-17b結(jié)合(42)，并且已經(jīng)在莫桑比克羅非魚(Mozambique tilapia， Oreochromis mossambicus)和金頭海鯛魚（gilthead sea bream,Sparus auratus)中免疫 組織化學(xué)檢測到雌激素受體(43)。以可忽略的損傷和在不使其皮質(zhì)醇水平由于取樣操作而 混亂的情況下對魚類的應(yīng)激，容易并且迅速地收集鱗片。
[0006] 附圖簡述
[0007] 里i:參與慢性應(yīng)激反應(yīng)的類固醇激素原理通路和分析物。44
[0008] 方法的示意性概述。
[0009] 針對用于驗證的鱗片、脊和軟鰭條的基質(zhì)的最佳量。
[0010] _:鱗片、脊和軟鰭條中皮質(zhì)醇的萃取時間和重復(fù)的優(yōu)化。
[0011] ?5：在稀釋劑中和在基質(zhì)中對魚鱗中皮質(zhì)醇的校準曲線。
[0012]圖6:在處理第42天時的皮質(zhì)醇(nM)、葡萄糖(mM)、乳酸鹽(mM)、總|丐(mM)、和同滲 質(zhì)量摩爾濃度(mOsmol kg<)的血漿分析。觀察值的百分之五十在框的下邊緣和上邊緣(第 一和第三四分位數(shù)）之間出現(xiàn)，并且虛線(whisker)從框延伸至不大于四分位數(shù)間范圍的 1.5倍的最極端觀察值;空心圓表示在所述范圍外部的值。
[0013] 座:在處理第42天時的下丘腦（erf)、垂體遠側(cè)部(pome)、和腎間組織（star)基因 (平均標準化表達-MNE)的分析?？驁D中的虛線與圖6中相同定義。
[0014] 圖8:在處理42天之后鰓中atplala的基因表達(MNE)?？驁D中的虛線與圖6中相同 定義。
[0015] 型:處理21和42天之后的個體發(fā)育的鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定限 并且CCf3 =檢測能力）。由于展示原因，在框圖中省略了第42天的STRESS的一個值(2.8pmol/ 鱗片）?？驁D中的虛線與圖6中相同定義。
[0016]圖10:個體發(fā)育和再生鱗片的相對collal表達(MNE)相對于血漿皮質(zhì)醇(nM)的袋 狀圖（bagplot)。袋含有全部觀察值的50%。插圖表示21天時的再生鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/ 鱗片）?？驁D中的虛線與圖6中相同定義。
[0017]圖11:在處理第42天時的皮質(zhì)醇(nM)、葡萄糖(mM)、總鈣(mM)、和同滲質(zhì)量摩爾濃 度(mOsmol kg<)的血漿分析。觀察值的百分之五十在框的下邊緣和上邊緣(第一和第三四 分位數(shù))之間出現(xiàn)，并且虛線從框延伸至不大于四分位數(shù)間范圍的1.5倍的最極端觀察值； 空心圓表示在所述范圍外部的值。
[0018]圖12:處理21和42天之后的個體發(fā)育的鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定 限并且CCP =檢測能力）?？驁D中的虛線與圖11中相同定義。
[0019] 圖13:處理21天的再生鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定限并且CCg =檢測 能力）?？驁D中的虛線與圖11中相同定義。
[0020] 發(fā)明描述
[0021] 本發(fā)明涉及在鱗片中獲取了魚類中的糖皮質(zhì)激素分布(profile)，以及這些真皮 骨板中的糖皮質(zhì)激素水平反映魚類隨時間經(jīng)歷的應(yīng)激程度的時間整合的樣品的研究結(jié)果。 鱗片實際上被認為是用于魚類中慢性應(yīng)激監(jiān)測的理想基質(zhì)，因為鱗片容易以非侵入性方式 取樣并且因為鱗片允許方便的樣品制備以用于進一步量化所述鱗片中的糖皮質(zhì)激素水平。 本發(fā)明因此涉及用于量化魚鱗中糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇以評估長時間段期間魚類對應(yīng)激的 暴露的準確、精確和穩(wěn)健的方法。
[0022] 更具體地，本發(fā)明涉及一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包 括：
[0023]-從所述魚中獲得至少一個鱗片，
[0024]-從所述鱗片中萃取糖皮質(zhì)激素，
[0025] _將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化，
[0026] _量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和
[0027] -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
[0028] 術(shù)語"糖皮質(zhì)激素"，當(dāng)（骨）鱗采自屬于真骨魚類（Teleostei)次綱的魚類 (卩18〇68)時意指皮質(zhì)醇，和/或當(dāng)(硬鱗魚)鱗采自屬于軟骨魚綱(〇1011(11'；[01^768)的魚類時 意指皮質(zhì)酮，和/或當(dāng)額外需要檢測可能的額外腎間（extra-interrenal)通路時意指皮質(zhì) 醇的前體如17a-羥基孕酮和/或11-脫氧皮質(zhì)醇和/或皮質(zhì)酮的前體如11-脫氧皮質(zhì)酮，和/ 或意指皮質(zhì)醇的代謝物如可的松、Reichstein's U(或20-二氫可的松）、四氫皮質(zhì)醇和/或 四氫可的松和/或皮質(zhì)酮的代謝物，因為這些代謝物可以影響鱗片中的糖皮質(zhì)激素水平從 而額外需要對它們的檢測。
[0029] 以上指出的糖皮質(zhì)激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下45:
[0030] -皮質(zhì)醇或110，17a
，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0032]-皮質(zhì)酮或110，21-二羥基-4-孕烯-3，20-二酮：
[0034] -17a-羥基孕酮或17a-羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0036] -11-脫氧皮質(zhì)醇或17a，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0038] -11-脫氧皮質(zhì)酮或21-羥基孕-4-烯-3，20-二酮
[0040]-可的松或17a，21 -二羥基-孕-4-烯-3，11，20-三酮：
[0042] -Reichsteir/ s U或20-二氫可的松或 17a，20，21-三羥基-孕-4-烯-3，11-二酮：
[0044]-四氫皮質(zhì)醇或3a，110，17a，21-四羥基-5f3-孕烷-20-酮：
[0046]-四氫可的松或3a，17a，21-三羥基-50孕烷-11，20-二酮：
[0048]因此，本發(fā)明涉及如在此描述的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素是皮質(zhì)醇、17a-羥基孕 酮、II-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、II-脫氧皮質(zhì)酮、可的松、Reichstein' s U、四氫皮質(zhì)醇和/或四 氫可的松。作為被認為反映硬骨魚類中應(yīng)激反應(yīng)的經(jīng)典參數(shù)，皮質(zhì)醇被釋放至血流中使得 結(jié)合入鈣化結(jié)構(gòu)中成為可能，并且因此是用于慢性應(yīng)激研究的首要靶標分析物。在所述方 法中包括其前體17a_羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇以闡明可能的額外腎間通路的存在。因為 魚類中的額外腎間通路的存在目前是未知的，但是因為在人類中存在額外腎上腺通路的跡 象 46,出于將來的研究目的，在所述方法中并入兩種分析物。這種通路的存在可能對我們對 HPI軸和因此對應(yīng)激的理解具有深遠的影響。在所述方法中還包括代謝物可的松、 Reichstein' s U、四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松，因為在水中的外源糖皮質(zhì)激素（來自其他魚 類、人類活動等)可以充當(dāng)可能影響鱗片中糖皮質(zhì)激素分布的內(nèi)分泌干擾劑。
[0049] 術(shù)語"魚類"基本上意指具有鱗片的任何帶有鰓的、有頭類水生動物，但是具體是 指屬于軟骨魚(Chondrichtyes)(軟骨魚類(cartilaginous fish))的分類學(xué)綱或?qū)儆谡婀?魚類(Teleostei)(硬骨魚(bony fish))的分類次綱的魚類。
[0050] 本發(fā)明還具體涉及如上所述的方法，其中所述魚類屬于真骨魚類次綱。
[0051] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述屬于真骨魚類次綱的魚類是屬 于下列各項的魚類：狼?/^4(Moronidae)(例如歐洲海f盧魚(European Sea bass))、鯛科 (Sparidae)(例如海鯛魚(Sea breams))、觸科(Soleidae)(例如觸魚(Solea solea)和塞內(nèi) 加爾觸魚（5〇163 86]16831611818))、鮭科（3311]10111(136)(例如，鮭魚、鱒魚）、所謂的石首魚 (Kingfish)(例如黃尾石首魚）、鯖科(Scombridae)(例如金槍魚）、鱈科(Gadidae)(例如鱈 魚）、鯉科(Cyprinidae)(例如常見的鯉魚、錦鯉）、和麗魚(cichlid fish)(例如莫桑比克以 及尼羅河羅非魚）。
[0052]術(shù)語"鱗片"意指通常發(fā)現(xiàn)于魚皮中的真皮骨板，其顯示出依賴于生長的同心環(huán)或 圓環(huán)。更具體地，術(shù)語"鱗片"是指如在真骨魚類中發(fā)現(xiàn)的"骨鱗(elasmoid scale)"并且是 指如在軟骨魚中發(fā)現(xiàn)的"硬鱗(ganoid scale)"。
[0053]魚類中的術(shù)語"慢性應(yīng)激"意指歸因于處理、差的水質(zhì)、飼養(yǎng)密度、捕食和多種其他 人類因素如風(fēng)車、船只交通、觸摸等隨時間累積并且反映長期的和應(yīng)激性狀態(tài)的應(yīng)激。慢性 應(yīng)激因此是魚類不能完全恢復(fù)的長期狀態(tài)。應(yīng)激因素以及在內(nèi)分泌水平、免疫系統(tǒng)或功能 水平出現(xiàn)的變化的直接作用可以是造成降低所述魚類的福利的（前)病理后果的原因。
[0054] 術(shù)語"從魚中獲得鱗片"意指用例如細鑷子從所述(活的或死的）魚的皮膚移除至 少一個鱗片。所述鱗片可以取自所述魚的身體的任何部分：即，背部、顱腹部 (cranioventral)、中腹部(medioventral)、尾部、左或右側(cè)等。為了使本發(fā)明的方法標準 化，從胸鰭背側(cè)的中背腹區(qū)域取鱗片。因為被移除的鱗片在短時間內(nèi)重新生長，因此這種非 侵入性的樣品收集方式對魚類沒有影響。這些再生的鱗片被證實展現(xiàn)出在經(jīng)歷的應(yīng)激方面 相同的糖皮質(zhì)激素的結(jié)合分布，并且本身提供了額外的工具以在充分限定的時間期限內(nèi)量 化慢性應(yīng)激。
[0055] 因為單個鱗片的重量取決于魚種類，以及取決于魚的年齡，并且在幼魚中是較小 的鱗片，所需的鱗片的數(shù)量取決于這兩種因素。由于這種原因，使用相當(dāng)于例如l〇〇mg的鱗 片的標準化的量的鱗片將本發(fā)明的方法標準化，盡管試驗指出也可以使用較小的量(如80、 60、40、20、10、5、111^等的鱗片）。相當(dāng)于10011^的鱗片的鱗片的數(shù)量通常為約40至80個鱗片， 如60個鱗片，但是應(yīng)當(dāng)清楚的是，考慮如上所述的兩種因素，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10個或多個鱗片進行本發(fā)明的方法。
[0056] 本發(fā)明因此還涉及如上所述的方法，其中所述從所述魚中獲得至少一個鱗片是從 所述魚中獲得40至80個之間的鱗片。
[0057] 術(shù)語"從所述鱗片萃取糖皮質(zhì)激素"涉及任何從所述鱗片分離/萃取糖皮質(zhì)激素的 方法。本發(fā)明的典型但是非限制性的萃取方法包括將糖皮質(zhì)激素從水相萃取至有機相中。 例如可以使用的萃取溶劑是甲醇、2-丙醇、乙腈、二乙醚等。然而，甲醇是優(yōu)選的溶劑。
[0058] 因此，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述萃取糖皮質(zhì)激素通過加入甲醇作為 萃取溶劑進行。本發(fā)明的萃取的實例如下:將均化的鱗片樣品〇.lg±〇.〇〇lg稱重至l〇ml試 管中。隨后，添加8ml甲醇作為萃取溶劑并且添加10此的0.5yg I/1的皮質(zhì)醇-d4溶液作為內(nèi) 部標準品。將樣品渦旋混合30s，在室溫下置于60rpm的架空搖床上lh，并且以3500g在7°C離 心10分鐘。取全部上清液，在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，并且在5ml H20/Me0H(80: 20;v/v)中重構(gòu)以用于隨后的固相萃取(SPE)。
[0059] 術(shù)語"將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化"涉及任何使得本發(fā)明的糖皮質(zhì)激 素純或者更純以及濃或更濃和/或盡可能多地消除雜質(zhì)的方法。
[0060] 更具體地，本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中所述用甲醇萃取之后進行SPE(固 相萃?。１景l(fā)明的純化步驟的非限制性實例如下:在用3ml甲醇接著3ml超純水調(diào)節(jié)C18SPE 柱之后，加載如以上得到的樣品。將柱用4.5ml H20/Me0H(65:35;v/v)洗滌并且將殘留的化 合物用2.5ml H2〇/MeOH(20:80;v/v)洗脫至10ml試管中并且在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸 發(fā)干燥。最終在小瓶中將樣品在1〇〇此H 20/Me0H(80:20;V/v)中重構(gòu)并且借助與串聯(lián)質(zhì)譜 法偶聯(lián)的超高效液相色譜法(UPLC-MS/MS)進行分析。
[0061] 術(shù)語"量化所述純化的糖皮質(zhì)激素"是指任何確定在如上所述的在萃取/純化之后 得到的糖皮質(zhì)激素的量的方法。
[0062] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述萃取和純化的糖皮質(zhì)激素的量 化通過與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法（OmPLC-MS/MS) 47'與紫外線檢測偶聯(lián)的高效液 相色譜法(HPLC-UV)和與二極管陣列檢測偶聯(lián)的高效液相色譜法(HPLC-DAD) 49_5<)、或與熒光 檢測偶聯(lián)的高效液相色譜法(HPLC-FL)5142、氣相色譜法(GC) 5344、（放射性）（酶)免疫測定 (RIA)5546(EIA)5H8或基于傳感器的技術(shù)5!M5°進行。
[0063] 本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中所述與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法是超高 效液相串聯(lián)質(zhì)譜法。
[0064] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述免疫測定是放射性免疫測定或 酶免疫測定。
[0065] 術(shù)語"將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)"是指應(yīng)激的硬骨魚產(chǎn)生 被釋放至血流中的皮質(zhì)醇的事實。當(dāng)這種應(yīng)激負荷時間延長時，皮質(zhì)醇在這個延長的時間 段內(nèi)在血液中循環(huán)。考慮到鱗片的結(jié)構(gòu)，特定百分比的這種生物活性和自由循環(huán)的皮質(zhì)醇 結(jié)合至鱗片中。在鱗片隨時間生長時，這隨時間提供了量化皮質(zhì)醇以及因此量化應(yīng)激負荷 的機會。了解到這一點，可以分析暴露于不同應(yīng)激負荷的魚類的鱗片的糖皮質(zhì)激素。例如， 暴露于較小應(yīng)激負荷的魚類（即，每2天限制(confinement)在減小的體積(如"原始"體積的 25%)30分鐘）具有1.70yg kg<的平均皮質(zhì)醇量，而在高度應(yīng)激的魚類（即，每2天限制在10 體積％30分鐘，+追捕5分鐘，+每周一次空氣暴露1分鐘）中，平均皮質(zhì)醇量為3.44yg kg-1。
[0066] 本發(fā)明因此基本上涉及從魚中取樣的魚鱗用于測定或量化所述魚的慢性應(yīng)激水 平的用途。
[0067] 本發(fā)明涉及如上所述的用途，其中所述量化/測定通過根據(jù)上述方法的方法進行。
[0068] 鱗片是用于慢性應(yīng)激量化的最重要基質(zhì)，因為它們以非侵入性方式收集的。然而， 在某些情況下，可以使用其他鈣化基質(zhì)如耳石、脊和鰭條，以及用于慢性應(yīng)激量化的基質(zhì)。 后一種量化可以以與以上對于鱗片描述的相同的方式進行。具體地，將脊和鰭條用剪子剪 斷并且通過將它們切成小塊進行均化，而將耳石用手術(shù)刀移除并且通過使用研缽研磨進行 均化。
[0069] 軟鰭條是柔性的、區(qū)段化的，并且在通過將新的區(qū)段加入至尖端而延長的遠端部 分支。脊不是區(qū)段化的而是與基部融合并且展現(xiàn)出連續(xù)生長。耳石是內(nèi)耳中平衡器官的一 部分并且主要由霰石(aragonite)形式的結(jié)晶碳酸鈣和被稱為otoline的纖維狀、膠原蛋白 狀蛋白質(zhì)組成。當(dāng)不存在身體生長時，它們顯示出徑向沉積并且維持的可容易辨識的每日 增量。軟鰭條和鱗片當(dāng)它們損失或受損時可以迅速重新生成。
[0070] 本發(fā)明因此還涉及從魚中取樣的其他鈣化基質(zhì)如脊、鰭條或耳石用于量化所述魚 的慢性應(yīng)激水平的用途。
[0071] 本發(fā)明因此還涉及一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括：
[0072] -從所述魚中獲得至少一個脊、鰭條或耳石，
[0073]-從所述脊、鰭條或耳石中萃取糖皮質(zhì)激素，
[0074]-將從所述脊、鰭條或耳石中萃取的糖皮質(zhì)激素純化，
[0075] _量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和
[0076] -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
[0077] 現(xiàn)在將通過以下非限制性實施例說明本發(fā)明。
[0078] 實施例1:用于量化歐洲海魚盧魚(Dicentrarchus labrax)的鱗片中糖皮質(zhì)激素的 UPLC-MS/MS方法的開發(fā)和驗證
[0079]方法和材料 [0080]儀器、材料、和試劑
[0081]在Acquity UPLC-MS/MS Premier XE上使用Acquity Ultra Performance LC BEH C18(l ? 7um; 2.1x100mm)柱(Waters，Milford，美國）進行色譜分析。將樣品用Turbovap?氮蒸 發(fā)器（Biotage，瑞典）蒸發(fā)干燥。從Grace Davison Discovery Sciences(Lokeren，比利時） 獲得用于固相萃?。⊿PE)的 Grace Pure? SPE C18-Max(500mg、6ml)柱。從 VWR International BVBA(LeuVen，比利時）獲得作為萃取溶劑的高效液相色譜法(HPLC)-梯度 級甲醇（Hipersolv Chromanorm)，同時使用來自Biosolve BV(Valkenswaard，荷蘭）的無水 甲醇LC-MS以及甲酸ULC-MS級和來自Millipore(Billerica，美國）的Milli-Q梯度Q-Gard 2 的超純水作為流動相溶劑。
[0082]化合物、標準品、和溶液
[0083]僅使用具有分析許可的產(chǎn)品。皮質(zhì)醇、可的松、17a-羥基孕酮、和11-脫氧皮質(zhì)醇來 自Sigma_Aldrich(Diegem，比利時）。四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松來自Sequoia Research Products Ltd(Pangbourne，英國）。使用來自 CDN Isotopes(Pointe_Claire，加拿大）的皮 質(zhì)醇-ck作為內(nèi)部標準品。
[0084]在甲醇中制備lmg ml/1的全部化合物和內(nèi)部標準品的單獨的儲存標準溶液并且在 4°C儲存。通過將10yl的0.5yg L-1的皮質(zhì)醇-ck溶液分別添加至0.5yL、lyL、2.5yL、5yL、和10 此的在100此出0/]\^011(80:20 ;￥八）中的1邱1/1標準溶液，分別制備在0.00511^1/1至0.111^ 廠 1范圍內(nèi)的校準標準品。在使用100mg的樣品時，這對應(yīng)于在基質(zhì)中5yg kg^1至lOOyg kg^1 的范圍。
[0085] 取樣
[0086] 從使用2-苯氧乙醇深度麻醉并且通過脊髓橫切殺死的處死歐洲海鱸魚 (Dicentrarchus labrax)中取樣全部|丐化結(jié)構(gòu)。所有魚重約100g。用細鑷子將來自胸鰭背 側(cè)的左中背腹區(qū)域的六十個鱗片從皮膚移除。使用剪子從尾鰭獲取四根背脊和六個軟鰭 條。從打開的頭顱中取兩個矢狀(sagittal)耳石。將所有樣品用超純水沖洗并且在室溫下 在面巾紙上風(fēng)干。
[0087] 樣品制備
[0088] 使用剪子將鱗片、脊、和軟鰭條切成細塊。將耳石在研缽中研磨。將剪子和研缽用 乙醇沖洗，接著用超純水沖洗，并且用面巾紙干燥。將均化的樣品0.1g±0.001g稱重至l〇ml 試管中。隨后，添加8ml甲醇作為萃取溶劑并且添加10此的0.5yg I/1的皮質(zhì)醇_d4溶液作為 內(nèi)部標準品。將樣品渦旋混合30s，在室溫下置于60rpm的架空搖床上lh，并且以3500g在7°C 離心10分鐘。取全部上清液，在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，并且在5ml H20/Me0H (80:20;￥八）中重構(gòu)。在用31111甲醇接著31111超純水調(diào)節(jié)(：183?￡柱之后，加載樣品。將柱用 4.5ml H20/Me0H(65:35; v/v)洗滌并且將殘留的化合物用2.5ml H20/Me0H(20:80; v/v)洗脫 至10ml試管中并且在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥。最終在小瓶中將樣品在100yL H 20/Me0H( 80:20; v/v)中重構(gòu)并且借助UPLC-MS/MS進行分析。
[0089] LC-MS/MS 分析
[0090] 使用流動相A和B的梯度洗脫將糖皮質(zhì)激素分離。流動相A是超純水與0.1%甲酸的 混合物，而流動相B是甲醇與0.1%甲酸的混合物。最初，以20% (v/v)的流動相B開始梯度洗 脫。隨后，在1.5分鐘時將流動相B增加至56%，在6.5分鐘時增加至63%，在7.5分鐘時增加 至99.1 %，之后將其保持在99.1 %至8分鐘，并且最終在9分鐘時減小至20 %并且以這種方 式保持至10分鐘。將流量保持恒定在0.4ml分鐘4，得到了 10分鐘的運行時間。將樣品在7 °C 在自動取樣器中冷卻。將注射體積設(shè)定為4〇yL，同時將柱溫維持在30°C。
[0091]在以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式使用的質(zhì)譜儀上進行色譜分析從而實現(xiàn)最佳靈敏度和 選擇性。對于每個靶標分析物，測定兩個前體片段離子躍迀。通過以1〇此mirT1的流量直接 輸注在甲醇+0.1 %甲酸中的1 Oyg I/1標準溶液來優(yōu)化儀器參數(shù)。兩個前體片段離子躍迀的 使用允許測定兩個躍迀之間的比率，其與相對保留時間一起用于根據(jù)Commi s s i 〇n Decision No.2002/657/EC61的要求鑒別和確認每個分析物的特性。質(zhì)譜儀以正離子電噴霧 離子化模式(ESI+)使用。所有化合物作為其質(zhì)子加合物[M+H]+進行分析。將MS檢測器設(shè)置設(shè) 定為以下值：120 °C的源溫度，在800L h-1的氣流下300 °C的去溶劑化溫度，50L h-1的錐孔氣 流，和3kV的毛細管電壓。在1.11.1(T2毫巴的壓力下使用氬作為碰撞氣體。在表1中給出了具 有所有化合物的保留時間、前體離子、產(chǎn)物離子、錐孔電壓、和碰撞能量的指標的優(yōu)化的 UPLC-MS/MS 條件。
[0092] 表1.每個化合物的優(yōu)化的UPLC-MS/MS條件
[0094]使用來自Waters的Quan/Targetlynx軟件進行數(shù)據(jù)分析；分析結(jié)果報告為值(yg kg一〇±擴展的測量不確定度(yg kg-D以及2的包含因數(shù)(k)(95%置信區(qū)間）。
[0095] 驗證
[0096]通過分別集中（pooling)來自在相似條件下飼養(yǎng)的51、51、57、和118只魚的鱗片、 脊、軟鰭條、和耳石來制備每種鈣化結(jié)構(gòu)的驗證樣品。不存在認證的參考材料、實驗室間比 較試驗或任何其他用于上述分析物/基質(zhì)組合的驗證方法，并且因此使用向驗證樣品的標 準添加來完成驗證。對于每種鈣化結(jié)構(gòu)，對在1至50yg kg<范圍內(nèi)的五個濃度水平測試五 次，并且其在一個月的時間段內(nèi)的四個不同日期在內(nèi)部再現(xiàn)性（intra-reproducibi 1 i ty) 條件下重復(fù)，即由兩個人使用不同溶液和一個UPLC-MS/MS系統(tǒng)。所有驗證實驗由授權(quán)人員 在具有校準的設(shè)備和受控溶液的受控環(huán)境中根據(jù)標準EN IS0/IEC 17025: 2005的要求進 行62。使用由不同校準標準品、空白、陰性和陽性對照（均在稀釋劑中）組成的標準化工序完 成分析。通過評估化合物和片段的（相對)保留時間和相對離子強度來評價每種化合物的結(jié) 果。根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求測定和評價所有驗證參數(shù):真實性、 精確度、工作范圍、線性度、判定限(CCa)、檢測能力(CCP)、靈敏度、和選擇性。
[0097]在內(nèi)部再現(xiàn)性條件下測定所有化合物的表觀回收率以及精確度(可重復(fù)性和實驗 室內(nèi)再現(xiàn)性），對于每個濃度水平得到20個分析，以及每種化合物和基質(zhì)總計100個分析。由 于低濃度水平，進行Dixon異常值檢驗 63以及Grubbs64檢驗以檢測可能的異常值。判定限(CC a)以校準曲線的截距加2.33倍實驗室內(nèi)再現(xiàn)性的標準差計算(a = l%)，而檢測能力(C〇3) 以CCa的濃度加1.64倍實驗室內(nèi)再現(xiàn)性的標準差計算⑴= 5%)。擴展測量不確定度基于真 實性和實驗室內(nèi)再現(xiàn)性的驗證數(shù)據(jù)并且使用兩種不同的方法，通過線性加和和通過二次加 和或Nordtest法測定。此外，在方法進行期間監(jiān)測方法的穩(wěn)健性和分析物在稀釋劑中以及 在基質(zhì)中的穩(wěn)定性。最終，通過線性加和以及通過二次加和或Nordtest法 4742測定擴展測量 不確定度(在文獻中對優(yōu)選方法不一致）。
[0098] 結(jié)果
[0099] 魚鱗中的皮質(zhì)醇、其前體17a_羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇、可的松和關(guān)鍵代謝物四 氫皮質(zhì)醇和四氫可的松的即^：-1^/^3量化方法在￡~130/此(：17025 :2005認證環(huán)境中進行 并且根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求驗證。作為被認為在大多數(shù)魚類中 反映應(yīng)激反應(yīng)的經(jīng)典參數(shù)，皮質(zhì)醇被釋放至血流中使得結(jié)合入鈣化結(jié)構(gòu)中成為可能，并且 因此是用于慢性應(yīng)激研究的靶標分析物。在分析中包括其前體17a-羥基孕酮和11-脫氧皮 質(zhì)醇以涵蓋對可能的額外腎間通路的檢測。還包括代謝物四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松，因為 外源糖皮質(zhì)激素(在水中）可以起內(nèi)分泌干擾劑的作用并且影響所研究的鈣化結(jié)構(gòu)的糖皮 質(zhì)激素分布。還針對脊、軟鰭條、和耳石測試和驗證了所述方法。說明了鱗片取樣的便利性。
[0100] 方法開發(fā)
[0101] 取樣和樣品制備
[0102] 對于每種鈣化結(jié)構(gòu)，確定用于取樣的位置。鱗片是后變態(tài)發(fā)育魚類中的中胚層骨 元件。在從魚的各個側(cè)邊(例如，背部、顱腹部、中腹部、或尾部)取的鱗片中，或者從左側(cè)和 側(cè)選取的鱗片之間，沒有發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇含量的差異。應(yīng)當(dāng)避免側(cè)線的鱗片，因為它們結(jié)構(gòu)上不 同。處于容易程度和將來研究的目的（考慮到水產(chǎn)養(yǎng)殖中的適用性），鱗片選自胸鰭背側(cè)的 中背腹區(qū)域。其中發(fā)現(xiàn)海鱸魚中的脊在第一背鰭的顱部中（8至10根脊）。脊不是區(qū)段化的， 而是在基部融合南區(qū)因此比軟鰭條更具剛性。在脊中在其需要在該組織中隨時間更好地精 細調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇結(jié)合的基部發(fā)現(xiàn)了較高濃度的糖皮質(zhì)激素。此外，除了遠端部之外的所有脊 均被上皮覆蓋。在從背部、顱腹部、中腹部、和尾部的鰭中取的軟鰭條中，沒有發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇含 量的差異。考慮到水產(chǎn)養(yǎng)殖中的適用性，軟鰭條選自尾鰭。選擇矢狀耳石，因為它們最大并 且最容易移除。
[0103] 就邏輯可行性和分析性能的最佳組合而言，通過摻加不同量的樣品（即來自相同 的魚的不同數(shù)量的鱗片、脊和軟鰭條，以及5yg kg^1的靶標分析物)對每種鈣化結(jié)構(gòu)確定用 于分析的基質(zhì)的最佳的量。在圖3中給出了鱗片、脊和軟鰭條的結(jié)果。考慮到將來在水產(chǎn)養(yǎng) 殖和野生中的適用性，選擇O.lg的每種鈣化結(jié)構(gòu)用于驗證。
[0104] 圖3.針對用于驗證的鱗片、脊和軟鰭條的基質(zhì)的最佳量
[0105] 為了移除已知含有內(nèi)源65以及外源糖皮質(zhì)激素的黏液，用超純水對所有樣品進行 強力洗滌。
[0106] 測試四種具有不同萃取效率的溶劑：甲醇、2-丙醇、乙腈、和二乙醚。對于鱗片以及 脊和軟鰭條中各種糖皮質(zhì)激素，甲醇得到最佳結(jié)果;在耳石中，溶劑之間沒有看到明顯的差 異(數(shù)據(jù)未示出）。
[0107] 接下來，測試利用甲醇溫育的時間依賴性（15、60、120min和16h)以及重復(fù)萃取。對 于魚鱗中的皮質(zhì)醇來說，在溫育60min之后沒有看到萃取的改善。沒有看到第二次萃取的改 善，也沒有看到15min 2次循環(huán)的組合(相對于60min的1次循環(huán)）的改善。在圖4中給出了鱗 片、脊、和軟鰭條的結(jié)果。
[0108] 圖4.鱗片、脊和軟鰭條中皮質(zhì)醇的萃取時間和重復(fù)的優(yōu)化
[0109] 因為需要高通量和成本有效的方法，將鱗片中的萃取用8ml甲醇在架空搖床上在 室溫下標準化lh。
[0110] SPE 操作
[0111] C18相SPE筒成功用于從生物樣品如血漿66、尿液67、排泄物 68中萃取糖皮質(zhì)激素，并 且因此選擇這種柱類型以優(yōu)化本研究中來自鈣化結(jié)構(gòu)的所選糖皮質(zhì)激素的萃取和純化。
[0112] Grace Pure?SPE C18-Max(500mg、6ml)柱是在二氧化娃系支持物上具有聚合結(jié)合 的17.1%碳負載的反相吸附劑。選擇反相萃取操作，是因為其以適度的極性與來自極性樣 品基質(zhì)的非極性化合物結(jié)合。500mg的床尺寸得到25mg的吸附保持容量?？紤]到鱗片中以及 其他鈣化結(jié)構(gòu)中糖皮質(zhì)激素的預(yù)測的濃度范圍，這種保持容量將足以結(jié)合所有目標分析 物。針對溶劑類型和體積優(yōu)化SPE的調(diào)節(jié)、樣品加載、洗滌、和洗脫步驟。利用3ml甲醇以活化 吸附劑配體接著利用3ml超純水以平衡吸附劑床的調(diào)節(jié)步驟得到了最佳結(jié)果(皮質(zhì)醇的平 均回收率>90% )。對于兩種溶劑來說最小體積為2.5ml，而使用超過3ml的體積的試驗未改 善純化。其中將蒸發(fā)的樣品在5ml H20/Me0H(80: 20; v/v)中重懸的樣品加載步驟得到了最 佳結(jié)果。在其中超純水和/或甲醇的比例變化的溶劑組合得到了非最佳的結(jié)果。對于糖皮質(zhì) 激素回收率來說，利用4.5ml H20/Me0H(65: 35; v/v)的柱的洗滌得到了最佳結(jié)果。較高的甲 醇濃度導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的洗脫，而較低的甲醇濃度引起噪聲的增加。將殘留的化合物用 2.5ml H20/Me0H(20:80; v/v)洗脫至10ml試管中。分別地，較低的洗脫體積或超純水的增加 未回收所有的糖皮質(zhì)激素，而就成本有效性而言，并且因為其從基質(zhì)洗脫更多的干擾化合 物，較高的洗脫體積或甲醇的增加是非最佳的。在蒸發(fā)之后，在小瓶中將樣品在l〇〇yL H20/ 1^011(80:20;￥八）中重構(gòu)并且借助1(：-1^/^3進行分析。選擇在100此中重構(gòu)以具有雙倍 (duplo)注射的可能性。在其中超純水與甲醇的比例改變的溶劑組合得到了非最佳的結(jié)果， 因為優(yōu)化了用于色譜分析的梯度從而以出0/^011(80:20 ;￥八)開始。在高達1120/也011(20: 80; v/v)的濃度中的重構(gòu)是可能的，但是對色譜峰的形狀具有負面影響。
[0113] 色譜分析
[0114] 在使用Acquity Ultra Performance LC BEH C18( 1 ? 7um;2? lxlOOmm)柱優(yōu)化色譜 分析的第一步中，使用質(zhì)譜儀以正離子(Esr)和負離子(Esn電噴霧離子化模式調(diào)節(jié)所有 化合物以及內(nèi)部標準品。在Esr中得到的結(jié)果得到了小峰但是較少的噪聲，而ESI+得到了整 體上更好的結(jié)果并且選擇其用于進一步測試。
[0115] 在第二步中，測試使用超純水和非極性溶劑如甲醇和乙腈連同0.1%甲酸的不同 梯度體系。首先，測試使用超純水和乙腈的梯度:較高的乙腈起始濃度得到了較短的保留時 間并且僅看到皮質(zhì)醇、可的松和17a-羥基孕酮的分離;運行緩慢增加乙腈濃度的梯度導(dǎo)致 了 17a-羥基孕酮峰的喪失，以及12min的運行時間，使得乙腈不適合作為流動相。隨后，測試 使用超純水和甲醇的梯度:在運行甲醇濃度從緩慢到非?？焖僭黾臃秶鷥?nèi)的不同梯度之 后，所有化合物完全分離并且測試不同添加劑的可變濃度。使用0.5%乙酸得到了比pH 3.0 的2mM甲酸銨或pH 5.0的乙酸銨更好、但是比0.1 %甲酸差的結(jié)果。隨后，優(yōu)化甲酸的濃度并 且選擇〇. 1 %甲酸;歸因于來自使用其他添加劑的方法的遺留物(carry-over )，較低的甲酸 濃度導(dǎo)致不穩(wěn)定的結(jié)果。最終，分別將柱溫和流量優(yōu)化為30°C和0.4ml mirT1，以具有l(wèi)Omin 的總運行時間。
[0116] 在最后一步中，優(yōu)化MS/MS方法:針對最佳靈敏度增加駐留時間以確保橫跨所有化 合物的每個離子的峰的點由至少20個數(shù)據(jù)點組成并且因此優(yōu)化MS框架窗口。
[0117] 驗證
[0118] 在公開的文獻中不能得到鱗片(或任何其他鈣化結(jié)構(gòu)）中的糖皮質(zhì)激素的濃度值， 這使得我們選擇在lyg kg"1至50yg kg<范圍內(nèi)的初步工作。
[0119] 低于、等于和高于CCP水平的魚鱗中皮質(zhì)醇的表觀回收率范圍為88. 14%至 98.85%，全部在根據(jù)Commission Decision NO.2002/657/EC的要求的80%至 110%性能標 準內(nèi)。無需考慮集中的驗證樣品的均質(zhì)化不是最佳的（即，其不是均勻的粉末，而是一灘非 常細的碎片）的事實，魚鱗中的皮質(zhì)醇的可重復(fù)性范圍為12.36%至17.15%。實驗室內(nèi)再現(xiàn) 性范圍為14.63%至20.02%。在表2中給出了魚鱗中被分析的化合物的真實性、精確度和測 量不確定度的結(jié)果。
[0120] 表2:魚鱗中所有化合物的真實性的值(表觀回收率AR，百分數(shù)）、精確度(可重復(fù)性 CVr和實驗室內(nèi)再現(xiàn)性CV R)的變化值系數(shù)(CV，百分數(shù))和擴展測量不確定度(U，百分數(shù)）
[0123] 1使用線性加和分別利用2(95%置信區(qū)間）和3(99%置信區(qū)間）的包含因數(shù)(k)的 擴展測量不確定度的計算
[0124] 2使用二次加和(Nordtest法)利用2的包含因數(shù)(k)(95%置信區(qū)間）的擴展測量不 確定度的計算
[0125] 3對合格離子的不足的反應(yīng)
[0126] 因為在將來的研究中基質(zhì)匹配的校準曲線實際上是不可行的，對于每種鈣化結(jié)構(gòu) 中的所有化合物，通過比較在5yg kg^1至50yg kg^1范圍內(nèi)的從稀釋劑中的校準曲線到基質(zhì) 匹配的校準曲線的數(shù)據(jù)來確定可能的基質(zhì)影響。圖5表明對于魚鱗中的皮質(zhì)醇沒有明顯影 響（考慮到樣品的生物學(xué)變異），但是因為稀釋劑和基質(zhì)中的校準曲線通常是分開的，使用 稀釋劑中的校準曲線的量化是可能的。
[0127] 圖5.在稀釋劑中和在用于魚鱗中的皮質(zhì)醇的基質(zhì)中的校準曲線
[0128] 隨后，使用由在5iig kg<至lOOiig kg<范圍內(nèi)的五個校準點組成的稀釋劑中的四 倍校準曲線測試每種鈣化結(jié)構(gòu)中的所有化合物的反應(yīng)的線性度，在實驗室內(nèi)再現(xiàn)性條件下 分析。當(dāng)在該范圍內(nèi)評估線性度時，對于所有化合物來說，未發(fā)現(xiàn)低于0.99的判定系數(shù)(R 2) 值。此外，計算的模型對于所有化合物表現(xiàn)出正態(tài)分布。在表3中給出魚鱗中所有化合物的 線性度、CCa，和C邙的結(jié)果。
[0129] 表3:魚鱗中所有化合物的校準曲線的判定系數(shù)(R2)以及判定限(CCa，yg kg<)和 檢測能力(Cdyg kg"1)的值
[0132]通過對空白基質(zhì)樣品制備稀釋系列來確定方法的靈敏度，當(dāng)考慮到預(yù)測的工作范 圍時，得到了對魚鱗中的所有化合物具有良好靈敏度的方法。通過分析空白和摻加的樣品 證實了方法的選擇性。在摻加的樣品中，所有化合物在預(yù)測的保留時間出現(xiàn)，伴隨它們的兩 個離子躍迀。將離子比與標準注射比較，并且發(fā)現(xiàn)其根據(jù)Commission Decision No .2002/ 657/EC的要求是可接受的。此外，未觀察到干擾峰。
[0133] 在方法開發(fā)期間通過改變最佳值針對所有重要步驟如萃取和SPE純化測試方法的 穩(wěn)健性。
[0134] 對于魚鱗中的皮質(zhì)醇、其前體（17a-羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇）、可的松和代謝物 (四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松）的1^(^5/^方法在￡~150/此(：17025 :2005認證環(huán)境中開發(fā) 并且根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求驗證，并且被證實適用于其預(yù)期的 目的。此外，針對三種其他鈣化結(jié)構(gòu)，即脊、軟鰭條和耳石，測試和驗證所述方法。
[0135] 實施例2:應(yīng)激的與未應(yīng)激的海6盧魚(Dicentrarchus labrax)的鱗片中糖皮質(zhì)激 素水平的
[0136] 方法和材料(參見實施例1)
[0137] 實驗設(shè)置
[0138] 試驗存在3個條件的2次重復(fù):對照（低應(yīng)激、中應(yīng)激和高應(yīng)激）。應(yīng)激是在3周的時 間段期間隨機施用的各種類型應(yīng)激物(擁擠、追捕和空氣暴露）的組合。在一天的多個不可 預(yù)測的時刻，如指出的施用應(yīng)激物：
[0139] ?低應(yīng)激:每2天限制(25體積％)30min
[0140] ?中應(yīng)激:每2天限制(25體積％ )30min，追捕5min
[0141] ?高應(yīng)激:每2天限制（10體積％ )30min，追捕5min，每周一次空氣暴露lmin
[0142] 根據(jù)Gorissen等人69使用RIA在96孔板中一式兩份測量血漿皮質(zhì)醇。一抗顯示與皮 質(zhì)醇100%的交叉反應(yīng)性，與11-脫氧皮質(zhì)醇0.9%的交叉反應(yīng)性，與皮質(zhì)酮0.6%的交叉反 應(yīng)性，和與11-脫氧皮質(zhì)酮、孕酮、17-羥基孕酮、睪酮和雌二醇<0.01 %的交叉反應(yīng)性。除了 "非特異性孔(non-specifics)"之外的所有孔接收100iil皮質(zhì)醇抗體(皮質(zhì)醇抗體[xm210] 單克隆和純化的IgG(Abcam);在50mM NaH⑶3、50mM NaH2⑶3、0.02%NaN3，pH = 9.6*l: 2000)并且在4°C溫育過夜。之后一天，將板用200yl/孔的洗滌緩沖液（100mM Tris、0.9% 他(：1、0.02%似似）洗滌三次。隨后，通過向每個孔添加10(^1封閉緩沖液（10011^1>18、 0.9%他(：1、0.02%似吧、0.25%普通牛血清)來封閉非特異性位點。將板覆蓋并且在37°(：溫 育一小時。隨后，將l〇yl標準品（4pg-2048pg皮質(zhì)醇/10yl含有100mM Tris、0.9%NaCl、 0.1%8_苯胺基-1-萘磺酸、0.02%NaN3的測定緩沖液)或10yl未稀釋的血漿或灌流介質(zhì)添 加至指定孔。非特異性孔和B0接收10yl測定緩沖液。在添加標準品和樣品之后，將90iU (333Bq)的3h-氫化可的松(PerkinElmer，美國，在測定緩沖液中1:10，000)溶液添加至所有 孔。將板在室溫下溫育四小時，或者在4°C儲存過夜。之后將板用洗滌緩沖液洗滌三次。在最 終的洗滌步驟之后，所有孔接收200yl的"Optiphase hisafe-3閃爍液體"（PerkinElmer，美 國）并且將其覆蓋。使用Microbeta Plus(Wallac/PerkinElmer，美國）通過3min計數(shù)/孔量 化0發(fā)射。內(nèi)和外測定變化分別為12.5和3.5%。
[0143] 結(jié)果
[0147] 實施例3:鯉魚(Cyprinus carpio L.)的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0148] 方法和材料(還參見實施例1并且進一步)
[0149] 實驗設(shè)置
[0150] 利用鯉魚的試驗存在4個條件的2次重復(fù)，各自具有6條魚:對照（未應(yīng)激的）、地塞 米松(dexamethasone)(應(yīng)激通路的抑制）、皮質(zhì)醇(應(yīng)激通路的活化)和通過以隨機施用方 式提供6周的各種應(yīng)激物誘導(dǎo)的應(yīng)激。
[0151] 方法
[0152] 實驗步驟根據(jù)荷蘭法規(guī)并且由當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準。在Nijmegen的Radboud大學(xué) 飼養(yǎng)常見的鯉魚(Cyprinus carpio L.)以確保歷史。將維持在12:12h光亮:黑暗下、每天以 體重的0.9%喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生長中的成年魚（在第21天時：340 ±92g和 24.6 ± 2.4cm;在第42 天時：377 ± 108g 和 25.4 ± 2.5cm)在 20.0 ± 0.4 °C 保持6 周。分別設(shè)置四 組，每組2個重復(fù)的箱，每個140-L箱6只魚。留下CTR組的魚不受打擾。DEX和⑶RT組接收以 500mg kg"1摻加的飼料。使STRESS組每天應(yīng)激一次;應(yīng)激物的類型、持續(xù)時間和時機隨機應(yīng) 用并且包括：網(wǎng)捕（15-60min)、空氣暴露（l-3min)、溫度下降（高達5°C )、追捕(高達lOmin) 和限制(在具有低水位的桶中）。在整個實驗期間，沒有注意到受損害的健康和行為的跡象。 在42天之后，將魚在2-苯氧基-乙醇(0.1 % v/v)中麻醉并且處死，從尾部血管取血并收集鱗 片(個體發(fā)育的和21天再生的鱗片）。分析血漿的皮質(zhì)醇69、葡萄糖 '乳酸鹽'總鈣71、和同 滲質(zhì)量摩爾濃度7()。從側(cè)線背側(cè)的標準化的排對鱗片進行取樣。使用eeflal rps5和肌動 蛋白作為參比基因評估靶基因的MNE72。使用線性混合模型在SAS 9.4(SAS Institutelnc.， Cary，NC)中以處理、取樣日期和它們的相互作用（在適當(dāng)時）作為固定影響對所有參數(shù)建 模。在模型中引入箱的隨機截距以校正魚在箱中的聚集。進行Dunnett檢驗以將處理組與對 照比較。
[0153] 結(jié)果
[0154] 1)原理的控制和實驗設(shè)置的執(zhí)行
[0155]在6周的試驗期間，我們比較了不受打擾的（CTR)和每日應(yīng)激的（STRESS)鯉魚。地 塞米松(DEX)或皮質(zhì)醇(C0RT)喂食的魚類分別充當(dāng)對于鱗片中結(jié)合皮質(zhì)醇的陰性和陽性對 照。在所有處理中，所提供的喂食量在5分鐘內(nèi)消耗，如通過條件因素 73表明的，所有魚保持 臨床健康，并且未觀察到死亡。通過每日（PH、溫度、溶解氧)或每周（亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨） 監(jiān)測維持足夠的水質(zhì)?？梢耘懦蕴瞧べ|(zhì)激素(作為從飼料泄漏的結(jié)果)對所觀察到的效 果的影響。借助內(nèi)部開發(fā)和驗證的(參見鱗片皮質(zhì)醇)超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)分析皮質(zhì)醇、其前體和代謝物，揭示在喂食之后2.5h內(nèi)水中提高的皮質(zhì)醇濃度恢復(fù) 至基線。
[0156]通常用作應(yīng)激指標的五個血液參數(shù)的結(jié)果確認，可以分別認為DEX魚類是陰性對 照并且C0RT魚類是陽性對照（圖6)。血漿皮質(zhì)醇在C0RT組(C0RT相對于CTR: P<0.0001)中提 高，確認了皮質(zhì)醇從飼料吸收到血液中；在STRESS魚中，皮質(zhì)醇水平與陰性對照沒有區(qū)別， 表明了后者不適用于慢性應(yīng)激評估。次要應(yīng)激參數(shù)血漿葡萄糖(反映了預(yù)測的糖皮質(zhì)激素 作用（糖原異生））在DEX(DEX相對于CTR:P<0.0001)中增加，而C0RT(C0RT相對于CTR:P = 0.2004)和STRESS(STRESS相對于CTR:P = 0.0531)沒有顯著差異，與DEX的更強效的作用一 致。血漿乳酸鹽在DEX(DEX相對于CTR:P<0.0001)和C0RT(C0RT相對于CTR:P = 0.0004)中增 加，但是在STRESS (STRESS相對于CTR :P = 0.4224)中不顯著，與DEX和CORT的下游效應(yīng)一致。 血漿總鈣和同滲質(zhì)量摩爾濃度不受影響，表明處理未超過魚類的恢復(fù)力(resilience)并且 不產(chǎn)生痛苦(distress)。我們得出結(jié)論：（i)CTR、DEX和C0RT處理引起了預(yù)期的糖皮質(zhì)激素 作用；（ii)在STRESS魚類的血漿中，沒有觀察到HPI軸的活化的跡象；（iii)血漿參數(shù)是慢性 應(yīng)激的差的預(yù)測物，因為它們在給定時刻反映出不多于一張的應(yīng)激反應(yīng)的快照。
[0157] 根據(jù)以上得出，慢性應(yīng)激的魚類中的血漿皮質(zhì)醇值未提供對于所經(jīng)歷的應(yīng)激來說 足夠的讀數(shù)。然而，圖7顯示，內(nèi)分泌應(yīng)激軸是最確定被活化的。下丘腦、垂體遠側(cè)部、和腎間 組織各自的關(guān)鍵基因erf (STRESS相對于CTR:P = 0.0002)、pomc( STRESS相對于CTR:P< 0.0001)、和star(STRESS相對于CTR:P = 0.0140)的表達確實顯著上調(diào)。由顯著降低的pome 表達(DEX相對于CTR: P = 0.0236)表明了負糖皮質(zhì)激素反饋。
[0158] 在血漿皮質(zhì)醇的水平不可見的慢性應(yīng)激的第二條證據(jù)是編碼鰓Na+/K+-ATP酶的al 亞基的基因的上調(diào)74(圖8)。在DEX (DEX相對于CTR: P = 0.0001 )、CORT (C0RT相對于CTR: P < 0.0001)和STRESS(STRESS相對于CTR:P = 0.0215)魚類中，發(fā)現(xiàn)了顯著增強的表達水平，表 明了皮質(zhì)激素作用。
[0159]總而言之，結(jié)果表明，STRESS組的魚類是慢性應(yīng)激的。我們之后著手于骨鱗中皮質(zhì) 醇的量化。
[0160] 2)作為慢性應(yīng)激的生物標記物的魚類的個體發(fā)育鱗片中的皮質(zhì)醇
[0161] 利用驗證的 UPLC-MS/MS 方法（根據(jù) Commission Decision No. 2002/657/EC 的要 求)在NBN EN IS0/IEC 17025監(jiān)管環(huán)境中分析五個(第21天）至六個(第42天)鱗片的皮質(zhì) 醇。所有CTR和DEX魚類顯示出低于檢測能力(CCf3)的鱗片皮質(zhì)醇值；12只C0RT魚中的10只在 第21天顯示出高于CCf3的值并且全部在第42天高于CCf3; 11只STRESS魚中的7只在第21天顯 示出高于CC0的值并且全部在第42天高于C〇3(圖9)。在對處理進行比較時，在第21天，對于 ⑶RT魚類（C0RT相對于CTR: P<0.0001)發(fā)現(xiàn)了明顯的累積；在第42天，對于STRESS魚類 (STRESS相對于CTR: P = 0.0001)發(fā)現(xiàn)了明顯的累積。當(dāng)在從21至42天的處理內(nèi)進行比較時， 分別在STRESS(P = 0.0031)和C0RT(P = 0.0026)魚類中發(fā)現(xiàn)了鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這些 發(fā)現(xiàn)與預(yù)測的鱗片中皮質(zhì)醇隨時間的結(jié)合和累積一致，并且驗證了鱗片皮質(zhì)醇含量為慢性 應(yīng)激的生物標記物。與通過DEX阻斷內(nèi)源皮質(zhì)醇產(chǎn)生的預(yù)測效果一致，我們發(fā)現(xiàn)在DEX處理 的魚類的鱗片中沒有皮質(zhì)醇結(jié)合。另一方面，喂食皮質(zhì)醇和使魚類物理應(yīng)激增強了鱗片皮 質(zhì)醇水平。
[0162] 總而言之，個體發(fā)育鱗片中皮質(zhì)醇的結(jié)果確認了，鱗片中的皮質(zhì)醇反映了魚類隨 時間經(jīng)歷的應(yīng)激水平。我們著手于作為用于慢性應(yīng)激量化的額外工具的再生鱗片中皮質(zhì)醇 的量化及其與最充足的基質(zhì)蛋白質(zhì)膠原蛋白la的基因表達水平的相關(guān)性。
[0163] c)在個體發(fā)育鱗片之后，皮質(zhì)醇還在再生鱗片中積累
[0164] 在移除個體發(fā)育鱗片之后21天，在每只魚5個再生鱗片中測定皮質(zhì)醇濃度（圖10)。 發(fā)現(xiàn)collal的MNE在個體發(fā)育鱗片中受到抑制并且與高血漿皮質(zhì)醇水平相關(guān)，與糖皮質(zhì)激 素對骨形成的公知的抑制效果一致。如由在所有處理中相似的collal表達所示出的，在再 生鱗片中，造骨細胞(形成鱗片的成骨細胞樣細胞 75)似乎對糖皮質(zhì)激素反饋不敏感。形態(tài)學(xué) 上，發(fā)現(xiàn)CTR、STRESS、和⑶RT的再生鱗片是相似的，而DEX魚類的鱗片的面積、周長和隆起 (ridge)的數(shù)量顯示出明顯更低的值，表明受打擾的和延緩的再生。在第42天，在再生和個 體發(fā)育鱗片取樣時CORT魚類中的高皮質(zhì)醇血漿水平與高鱗片皮質(zhì)醇含量相關(guān)，并且這確認 了游離的皮質(zhì)醇在鱗片中結(jié)合。此外，STRESS魚類中的再生鱗片皮質(zhì)醇含量似乎還沒有明 顯高于CTR但是低于C0RT，表明基質(zhì)中皮質(zhì)醇的最大隔離（sequestering)尚未未達到。在此 應(yīng)當(dāng)注意所分析的基質(zhì)的極其低的量(平均4mg的鱗片）。觀察到C0RT魚類(C0RT相對于CTR: P<0.0001)中鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這個發(fā)現(xiàn)與鱗片中皮質(zhì)醇隨時間的結(jié)合和累積一 致，并且可以得到較高的血漿皮質(zhì)醇水平，因此再次確認了我們關(guān)于個體發(fā)育鱗片的發(fā)現(xiàn)。 再生鱗片的結(jié)果證實了個體發(fā)育鱗片的結(jié)果，以及因此證明了鱗片中的皮質(zhì)醇反映魚類隨 時間經(jīng)歷的應(yīng)激水平的事實。
[0165] 實施例4:羅非魚(莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus))的鱗片中糖皮質(zhì) 激素水平的量化
[0166]方法和材料(參見實施例1并且進一步)
[0167] 實驗設(shè)置
[0168] 利用羅非魚的試驗存在4個條件的2次重復(fù)，各自具有6條魚:對照（未應(yīng)激的）、地 塞米松(dexamethasone)(應(yīng)激通路的抑制）、皮質(zhì)醇(應(yīng)激通路的活化)和通過以隨機施用 方式提供的各種應(yīng)激物6周誘導(dǎo)的應(yīng)激。
[0169] 方法
[0170] 實驗操作根據(jù)荷蘭法規(guī)并且由Radboud大學(xué)動物倫理委員會（Animal Ethics Committee of the Radboud University)批準（許可編號：RU-DEC2013-192)。在Nijmegen 的Radboud大學(xué)飼養(yǎng)常見的羅非魚（莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus))以確保 歷史。將維持在12:12h光亮:黑暗下、每天以體重的0.9%喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生 長中的成年魚（在第21天時：321 ±37g和26.0 ± 0.9cm;在第42天時：328 ±38g和26.5 土 0.9cm)在20.0 ± 0.4 °C保持6周。分別設(shè)置兩組，每組2個重復(fù)的箱，每個140-L箱6條魚。留下 CTR組的魚不受打擾。使STRESS組每天應(yīng)激一次;應(yīng)激物的類型、持續(xù)時間和時機隨機應(yīng)用 并且包括：網(wǎng)捕（15-60min)、空氣暴露（l-3min)、溫度下降（高達5°C)、追捕(高達10min)和 限制(在具有低水位的桶中）。在整個實驗期間，沒有注意到受損害的健康和行為的跡象。在 42天之后，將魚在2-苯氧基-乙醇(0.1 % v/v)中麻醉并且處死，從尾部血管取血并收集鱗片 (個體發(fā)育的和21天再生的鱗片）。分析血漿的皮質(zhì)醇、葡萄糖7()、總鈣 71、和同滲質(zhì)量摩爾濃 度7()。從側(cè)線背側(cè)的標準化的排對鱗片進行取樣并且使用超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)分析。
[0171] 結(jié)果
[0172]原理的控制和實驗設(shè)置的執(zhí)行
[0173] 在6周的試驗期間，我們比較了不受打擾的（CTR)和每日應(yīng)激的（STRESS)羅非魚。 在所有處理中，所提供的喂食量在5分鐘內(nèi)消耗，如通過條件因素 73表明的，所有魚保持臨床 健康，并且未觀察到死亡。通過每日（pH、溫度、溶解氧）或每周（亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨）監(jiān)測 維持足夠的水質(zhì)?？梢耘懦蕴瞧べ|(zhì)激素(作為從飼料泄漏的結(jié)果)對所觀察到的效果的 影響。借助內(nèi)部開發(fā)和驗證的UPLC-MS/MS分析皮質(zhì)醇、其前體和代謝物，揭示在喂食之后 2.5h內(nèi)水中提高的皮質(zhì)醇濃度恢復(fù)至基線。
[0174] 分析通常用作應(yīng)激指標的四個血液參數(shù)（圖11)。血漿皮質(zhì)醇在STRESS組(STRESS 相對于CTR:P = 0.0014)中提高，表明了后者適用于急性應(yīng)激評估。次要應(yīng)激參數(shù)血漿葡萄 糖(反映了預(yù)測的糖皮質(zhì)激素作用(糖原異生））在STRESS(STRESS相對于CTR:P = 0.0006)中 增加并且差異顯著。血漿總鈣和同滲質(zhì)量摩爾濃度不受影響，表明處理未超過魚類的恢復(fù) 力并且不產(chǎn)生痛苦(distress)。我們得出結(jié)論：（i)在STRESS魚類的血漿中觀察到HPI軸的 活化的跡象時，STRESS處理引起了預(yù)期的糖皮質(zhì)激素作用;并且（ii)血漿參數(shù)是慢性應(yīng)激 的差的預(yù)測物，因為它們在給定時刻反映不多于一張的應(yīng)激反應(yīng)的快照。
[0175] 作為慢性應(yīng)激的生物標記物的魚類的個體發(fā)育鱗片中的皮質(zhì)醇
[0176] 利用驗證的 UPLC-MS/MS 方法（根據(jù) Commission Decision No. 2002/657/EC(EC， 2002)的要求)在NBN EN IS0/IEC 17025(EN IS0/IEC，2005)監(jiān)管環(huán)境中分析五個(第21天） 至六個(第42天)鱗片的皮質(zhì)醇。
[0177] 在第21天，所有CTR和STRESS魚類顯示出低于判定限(CCa)的鱗片皮質(zhì)醇值，而在 第42天，STRESS魚類的水平大多高于CCa(圖12)。
[0178] 在對處理進行比較時，在第21天，對于STRESS魚類(STRESS相對于CTR: P = 0.0590) 發(fā)現(xiàn)了接近明顯的累積;在第42天，對于STRESS魚類(STRESS相對于CTR: P = 0.0515)發(fā)現(xiàn)了 接近明顯的累積。當(dāng)在從21至42天的處理內(nèi)進行比較時，在CTR(P = 0.3962)中發(fā)現(xiàn)了鱗片 皮質(zhì)醇沒有明顯增加，而在STRESS(P = 0.0020)魚類中發(fā)現(xiàn)了鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這些 發(fā)現(xiàn)與預(yù)測的鱗片中皮質(zhì)醇隨時間的結(jié)合和累積一致，并且進一步驗證了鱗片皮質(zhì)醇含量 為慢性應(yīng)激的生物標記物。與對照組中的預(yù)測效果一致，我們發(fā)現(xiàn)CTR魚類(CTR21相對于 CTR42: P = 0.0770)的鱗片中沒有明顯的皮質(zhì)醇結(jié)合。另一方面，使魚類物理應(yīng)激增強了鱗 片皮質(zhì)醇水平（STRESS21 相對于STRESS42 :P<0 ? 0001)。
[0179] 總而言之，個體發(fā)育鱗片中皮質(zhì)醇的結(jié)果確認了我們最初在鯉魚中的發(fā)現(xiàn)，鱗片 中的皮質(zhì)醇反映了魚類隨時間經(jīng)歷的應(yīng)激水平。我們著手于作為用于慢性應(yīng)激量化的額外 工具的再生鱗片中皮質(zhì)醇的量化。
[0180] 在個體發(fā)育鱗片之后，皮質(zhì)醇還在再生鱗片中積累
[0181] 在移除個體發(fā)育鱗片之后21天，在每只魚5個再生鱗片中測定皮質(zhì)醇濃度(圖13)。
[0182] 觀察到STRESS魚類（STRESS相對于CTR:P = 0.0105)中再生鱗片皮質(zhì)醇的明顯增 加。在第42天取樣再生和個體發(fā)育鱗片時STRESS魚類中的高皮質(zhì)醇血漿水平與高鱗片皮質(zhì) 醇含量相關(guān)，并且這確認了我們的假設(shè)，游離的皮質(zhì)醇結(jié)合在鱗片中。這個發(fā)現(xiàn)與預(yù)測的鱗 片中皮質(zhì)醇隨時間的結(jié)合和累積一致，具有高的血漿皮質(zhì)醇水平，因此再次確認了我們關(guān) 于個體發(fā)育鱗片的發(fā)現(xiàn)。再生鱗片的結(jié)果證實了個體發(fā)育鱗片的結(jié)果以及我們之前關(guān)于鯉 魚的發(fā)現(xiàn)，并且因此確認了鱗片中的皮質(zhì)醇反映魚類隨時間經(jīng)歷的應(yīng)激水平的事實。
[0183] 血漿中以及備選基質(zhì)如排泄物、黏液和水中的皮質(zhì)醇的測定不適用于慢性應(yīng)激的 評估。我們示出了，鱗片皮質(zhì)醇含量高度適用于魚類中慢性應(yīng)激的量化，這種想法使得鱗片 皮質(zhì)醇成為與魚類相關(guān)的科學(xué)和行業(yè)(例如，生理學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、行為研究等）中具有 高潛在影響的創(chuàng)新的和超過現(xiàn)有技術(shù)水平的生物標記物。對于鯉魚和對于羅非魚給出的發(fā) 現(xiàn)適用于所有具有骨鱗的魚類(例如，鯉魚）。在較廣泛的意義上，盾鱗(例如，鯊魚)和硬鱗 (例如，舞魚）也是適合的，使這種生物標記物的用途擴展到其他輻鰭亞綱 (8(：1：；[110卩丨6巧〖1311)物種和甚至軟骨魚綱（011011(11'；[011丨5^11)物種。最后，這種用于慢性應(yīng)激 監(jiān)測的新型工具具有可能用于大范圍的政府、學(xué)術(shù)和工業(yè)環(huán)境的巨大價值，如對動物友好 的水產(chǎn)養(yǎng)殖做決策(例如再循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的基于動物的優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)量的改善）、野生 魚類種群的監(jiān)測（例如基于生態(tài)學(xué)的種群動態(tài)）、在公共水族館和在動物試驗中的魚類福 利。保證了用于對魚類鱗片中皮質(zhì)醇的現(xiàn)場分析的經(jīng)濟上、邏輯上、且廣泛適用的可行的測 定的開發(fā)。
[0_ 實施例5:鮭魚的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0185] 方法和材料(參見實施例1)
[0186] 實驗設(shè)置
[0187] 針對鮭魚中的慢性應(yīng)激，在與美國的拓展合作框架內(nèi)，盲法分析大鱗大麻哈魚 (Chinook salmon)的十二只樣品(預(yù)應(yīng)激和應(yīng)激(1小時限制））的鱗片糖皮質(zhì)激素。
[0188] 莖里
[0190] 實施例6:海鯛魚和海鱸魚的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0191] 方法和材料(參見實施例1)
[0192] 實驗設(shè)置
[0193] 利用海f盧魚（歐洲海f盧魚（Dicentrarchus labrax))和海鯛魚（赤鯛（Pagrus pagrus))測試魚類的調(diào)節(jié)的影響(第一天與第3天）。
[0194] 莖里
[0195] 海鱸魚
[0199] 參考文獻
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【主權(quán)項】
1. 一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括： -從所述魚中獲得至少一個鱗片， _從所述鱗片中萃取糖皮質(zhì)激素， -將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化， -量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和 -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，糖皮質(zhì)激素是皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、17α-羥基孕酮、11-脫氧 皮質(zhì)醇、11-脫氧皮質(zhì)酮、可的松、20-二氫可的松、四氫皮質(zhì)醇和/或四氫可的松。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中所述魚屬于真骨魚類(Teleostei)的次綱。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述從所述魚中獲得至少一個鱗片是從所述魚 中獲得40至80個之間的鱗片。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述萃取糖皮質(zhì)激素通過加入甲醇作為萃取溶 劑進行。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述用甲醇萃取之后進行固相萃取。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述萃取的糖皮質(zhì)激素的量化通過與串聯(lián)質(zhì)譜 法偶聯(lián)的液相色譜法、與紫外線偶聯(lián)的高效液相色譜法、二極管陣列或熒光檢測、氣相色譜 法、放射性免疫測定、酶免疫測定或基于傳感器的技術(shù)進行。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法是超高效液 相串聯(lián)質(zhì)譜法。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述免疫測定是放射性免疫測定或酶免疫測定。10. 從魚中取樣的魚鱗用于量化所述魚的慢性應(yīng)激水平的用途。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述量化通過根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法進 行。12. 從魚中取樣的脊、鰭條或耳石用于量化所述魚的慢性應(yīng)激水平的用途。13. -種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括： -從所述魚中獲得至少一個脊、鰭條或耳石， -從所述脊、鰭條或耳石中萃取糖皮質(zhì)激素， -將從所述脊、鰭條或耳石中萃取的糖皮質(zhì)激素純化， -量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和 -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
【文檔編號】G01N33/50GK105899950SQ201480068751
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月17日
【發(fā)明人】約翰·阿茲, 薩拉·德·賽杰
【申請人】根特大學(xué), 農(nóng)業(yè)漁業(yè)研究所