分析測(cè)試裝置、試劑盒和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分析試驗(yàn)裝置，和用于監(jiān)測(cè)、感測(cè)、閱讀和顯示結(jié)果的方法和試劑盒，通過使用具有諸如電池、閱讀裝置和其它電路的印刷電子元件的裝置和/或通過使用將敏感指示劑pH染料用于測(cè)試的比色工具，或通過兩者。
【專利說明】分析測(cè)試裝置、試劑盒和使用方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分析測(cè)試裝置、試劑盒和使用測(cè)試裝置以感測(cè)、監(jiān)測(cè)、區(qū)分讀數(shù)及顯示 裝置打算測(cè)試的結(jié)果的方法。先前的裝置已經(jīng)可以用來檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品中以非常低濃度存 在的痕量的化學(xué)和/或生物靶標(biāo)，所述樣品包括但不僅僅是生物樣品、材料、有機(jī)或無機(jī)樣 品。痕量的化學(xué)和/或生物靶標(biāo)可以包括生物/化學(xué)產(chǎn)品、片段或整個(gè)目標(biāo)，例如核酸序列、 細(xì)胞、病毒、病原體、化學(xué)品，具有在諸如藥物基因組學(xué)、病原體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)、遺傳傾向確定、 用于臨床試驗(yàn)的遺傳分類、診斷學(xué)、預(yù)測(cè)學(xué)、傳染性疾病的診斷學(xué)和監(jiān)測(cè)、生物防護(hù)、法醫(yī)分 析、親子鑒定、動(dòng)植物育種、食品檢測(cè)、人體鑒定、基因改造的生物體測(cè)試、化學(xué)污染、食品安 全、生產(chǎn)鏈的監(jiān)測(cè)和追蹤以及產(chǎn)品在線監(jiān)測(cè)/控制領(lǐng)域在關(guān)懷/地點(diǎn)/興趣（in point of care/site/interest)和實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用。
[0002] 本發(fā)明通過方法的組合實(shí)現(xiàn)。一種方法是通過使用印刷電子元件來感測(cè)需要測(cè)量 的變化，諸如pH值。測(cè)量反應(yīng)變化的另一種方法是通過使用由使用印刷電子元件檢測(cè)的比 色介質(zhì)(表明顏色變化或變得可見的顏色中的變化），作為檢測(cè)結(jié)果的方法中的一種。此外， 使用印刷電子元件傳感器在集成單元上顯示測(cè)量結(jié)果。
[0003] 現(xiàn)存的一些裝置是例如橫向流動(dòng)裝置和在診斷分析中使用它們的方法。US SN 14/345,276通過全文引用并入本文。US SN 14/345,276公開的方法和裝置對(duì)于檢測(cè)或監(jiān)測(cè) 在提供的樣品中以非常低濃度存在的諸如化學(xué)、生物和材料靶標(biāo)的靶標(biāo)是有用的。然而，US 14/345,276的方法和裝置沒有利用本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒。
[0004] 除了橫向流動(dòng)裝置外，本發(fā)明可以使用紙上的微流體燃料電池。
[0005] 到目前為止，印刷電子元件已經(jīng)用于不同的技術(shù)領(lǐng)域。然而，本發(fā)明的裝置的顯示 方面第一次使用印刷電子元件來顯示測(cè)試的結(jié)果。這些印刷電子元件包括至少一種印刷電 路顯示器和/或印刷形式的電池。同樣已經(jīng)確定感測(cè)監(jiān)視器、差分閱讀單元和/或顯示單元 傾向于具有印刷形式的電子元件。為了讀取打算通過裝置測(cè)量的結(jié)果，這些諸如電路、顯示 器和電池的電子元件全都位于諸如但不限于橫向流動(dòng)裝置的醫(yī)療裝置上。
[0006] 印刷電子學(xué)是通過使用通常的印刷設(shè)備用于在不同的基底上產(chǎn)生電子裝置的印 刷方法。將圖案印刷在材料上，諸如絲網(wǎng)印刷、柔版印刷、凹版印刷、平版印刷和噴墨印刷， 因?yàn)檫@些是典型地低成本過程。然后在基底上使用電子功能的電子或光學(xué)墨水，產(chǎn)生諸如 薄膜晶體管或電阻器的主動(dòng)或被動(dòng)裝置。
[0007] 術(shù)語印刷電子元件意思是其中一種(或多種）墨水包含基于碳的化合物的有機(jī)電 子元件或塑料電子元件。相反地，印刷電子元件，指定過程，以及服從于選定的印刷過程的 特定要求，可以利用任何基于溶液的材料。這包括有機(jī)半導(dǎo)體、無機(jī)半導(dǎo)體、金屬導(dǎo)體和納 米顆粒等。
[0008] 為了制備印刷電子元件，幾乎使用了所有的工業(yè)印刷方法。
[0009] 印刷最重要的好處是低成本。較低的成本使得能夠用于更多的應(yīng)用中。一個(gè)實(shí)例 是RFID系統(tǒng)，其使得能夠在貿(mào)易和運(yùn)輸中非接觸式識(shí)別。同樣，印刷在柔性基底上允許電子 元件放置在彎曲表面上。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷法、基因測(cè)試、血統(tǒng)和品種選擇測(cè)試、基因改造生物體測(cè) 試、病原體檢測(cè)、基因分型、突變檢測(cè)、用于處方或臨床治療的伴侶基因測(cè)試、癌癥類型檢 測(cè)、癌癥的監(jiān)測(cè)和預(yù)后?；驕y(cè)試已經(jīng)廣泛用在臨床應(yīng)用、食品工業(yè)、法醫(yī)測(cè)試、人體鑒定、 病原體流行性監(jiān)視和新疾病菌株的檢測(cè)。這種基因測(cè)試覆蓋了涉及分析物中核酸檢測(cè)和鑒 定的一系列技術(shù)。實(shí)例包括DNA測(cè)序、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA微陣列和限制性片段 長度多態(tài)性(RFLP)為例。本發(fā)明提供用于進(jìn)行此類測(cè)試的改善的方法，或通過使用印刷電 子元件或在使用染料pH指示劑的系統(tǒng)中或兩者皆有。
[0011] 用于檢測(cè)通常以微量形式發(fā)現(xiàn)的核酸的傳統(tǒng)方法需要多種裝置和步驟來處理樣 品、擴(kuò)增目標(biāo)物和檢測(cè)擴(kuò)增物。核酸(DNA或RNA)的擴(kuò)增已經(jīng)很好地建立，并且目前存在各種 用于不同分析需要的方法。即使使用檢測(cè)的電信號(hào)來監(jiān)測(cè)PCR的核苷酸插入的現(xiàn)有反應(yīng)方 法也不使用本發(fā)明的印刷電子元件或比色方法(參見US 788,015B2和US 8，1 14,591B2)。 [0012]基于基于熱循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增已經(jīng)顯示出在檢測(cè)核酸及諸如拷 貝數(shù)變化或單核苷酸多態(tài)性的基因變化中是可靠的。這一方法已經(jīng)很好地建立，因此它常 常是用于諸如臨床和法醫(yī)應(yīng)用的需要非常多規(guī)則的應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法。不論什么核酸擴(kuò)增方 法，除可視化的方法之外，擴(kuò)增產(chǎn)物是不可檢測(cè)的?，F(xiàn)在的核酸可視化方法涉及將熒光探針 附加到擴(kuò)增反應(yīng)中。這些探針包括在Taqman檢測(cè)寡核苷酸和雙鏈DNA螯合劑中的熒光標(biāo)簽、 Sybr Green或?qū)Ψ磻?yīng)產(chǎn)物敏感的其它熒光化學(xué)品。熒光化合物在這種類型的檢測(cè)中是必需 的，因?yàn)榉俟夥肿影l(fā)射大量的質(zhì)子，并且發(fā)射只有在焚光產(chǎn)物存在時(shí)才可檢測(cè)。當(dāng)Taqman檢 測(cè)寡核苷酸的熒光探針雜交到擴(kuò)增產(chǎn)物并且被DNA聚合酶切開或Sybr Green螯合到擴(kuò)增產(chǎn) 物時(shí)，發(fā)射才會(huì)發(fā)生。
[0013]然而，這些熒光化合物對(duì)曝光敏感或需要諸如冷藏的特殊儲(chǔ)存條件。暴露于外界 光中對(duì)熒光化學(xué)品造成不可逆的損害，這種現(xiàn)象稱作光漂白。對(duì)于任何熒光方法，任何發(fā)射 的發(fā)生也需要激發(fā)光源。通常使用UV光源作為激發(fā)光源來激發(fā)熒光探針以產(chǎn)生可測(cè)量的光 發(fā)射。一個(gè)實(shí)例由PATH,Seattle,USA的Paul LaBarre(PloS One V6,第6期，el 9738)公開， 通過引用將其全文并入本文。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸鹽釋放熒光化學(xué)品使其不被淬滅時(shí)，熒光 發(fā)射成為可能。需要UV光源并且由手持UV LED提供。光的強(qiáng)度取決于產(chǎn)物的量以及外界光 條件。在將未知樣品與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照比較的情況下，單一的UV LED將不能夠?yàn)槿?三個(gè)樣品提供均勻照明。在沒有儀器幫助時(shí)，難以區(qū)分陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)。另一擾動(dòng)源是 來自熒光染料的不一致發(fā)射。因?yàn)榘l(fā)射依賴于兩金屬離子結(jié)合之間的交換，該交換是二級(jí) 反應(yīng)而非擴(kuò)增反應(yīng)，它受到來自于通常存在于H)TA血液或其它操作變動(dòng)中的其它金屬螯合 劑的干擾。
[0014]樣品會(huì)抑制或妨礙熒光讀數(shù)的另一個(gè)實(shí)例是當(dāng)溶液不是透明溶液時(shí)，諸如當(dāng)樣品 是未處理的全血。沒有精密儀器，幾乎不可能處理體積少于1微升的樣品。雖然大部分核酸 反應(yīng)在50微升以下，更普遍地在25或10微升進(jìn)行，當(dāng)樣品是渾濁或嚴(yán)重有色時(shí)，熒光方法嚴(yán) 重受限。反應(yīng)前需要大量稀釋或純化步驟。
[0015]用于檢測(cè)核酸的擴(kuò)增方法使用pH敏感系統(tǒng)直接測(cè)量氫離子而非使用熒光染料。這 是通過利用具有離子敏感效應(yīng)晶體管（ISFET)傳感器的CMOS芯片技術(shù)完成的[〃A pH-ISFET based micro sensor system on chip using standard CMOS technology，〃（〃一種使用 標(biāo)準(zhǔn)CMOS技術(shù)的位于芯片上的基于pH-ISFET的微傳感器系統(tǒng)，〃）Haigang Yang等， Systems-0n-Chip for real-time appliction，Proceeding of the Fifth International Workshop, 2005]。氫離子傳感層是CMOS芯片頂層的氮化娃。這項(xiàng)技術(shù)導(dǎo)致 了成本效益好的核酸分析。對(duì)于任何CMOS芯片，電氣性連接是必需的，而且需要芯片的特殊 包裝以允許測(cè)量和擴(kuò)增反應(yīng)。因此，該方法昂貴且具有挑戰(zhàn)性。它昂貴是因?yàn)榕c任何CMOS芯 片的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)都相關(guān)的高成本。它具有挑戰(zhàn)性是因?yàn)橹辽賰蓚€(gè)原因：1.來自通過針孔或 小包裝缺陷的擴(kuò)增液泄漏的短路風(fēng)險(xiǎn)，和2.在例如氮化硅的傳感層和反應(yīng)組分之間的強(qiáng)烈 干擾風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)檫@些挑戰(zhàn)和擔(dān)憂，對(duì)于成本效益好且簡單的基因測(cè)試，并非理想的解決方 案。
[0016] 因此本發(fā)明也涉及到在核酸擴(kuò)增存在時(shí)產(chǎn)生可讀的電子數(shù)據(jù)集或產(chǎn)生顏色差異 的新的方法，裝置和試劑盒。對(duì)于任何反應(yīng)，在反應(yīng)后保持反應(yīng)容器安全密封是至關(guān)重要 的。這是為了防止其它進(jìn)一步的反應(yīng)被之前擴(kuò)增的核酸污染。在向反應(yīng)中加入樣品核酸之 后，用于檢測(cè)或反應(yīng)的任何必需組分應(yīng)該與擴(kuò)增試劑一起密封。盡管已知核酸擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生 pH值下降，但是卻不知道如何能在沒有儀器的幫助下進(jìn)行pH值依賴的核酸擴(kuò)增，諸如檢查 正確的起始pH值和相應(yīng)地執(zhí)行必要的調(diào)整。也不知道如何能進(jìn)行諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)而不使反應(yīng)受到額外的染料組分的抑制。例如，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，在 擴(kuò)增試劑中總是包含10mM Tris或更高濃度。在當(dāng)前的方法中，總緩沖液容量應(yīng)該限制在 5mM以下或優(yōu)選地2mM以下或優(yōu)選地ImM以下，以致于pH值變化不被緩沖液抑制。
[0017] 另一個(gè)與pH染料相關(guān)的問題是染料抑制擴(kuò)增反應(yīng)。pH指示劑染料，諸如溴百里酚 藍(lán)在lmg/mL的濃度時(shí)產(chǎn)生優(yōu)良的顏色強(qiáng)度，但是它完全抑制LAMP反應(yīng)。當(dāng)在核酸擴(kuò)增方法 中使用可溶染料時(shí)，限制染料與擴(kuò)增組分的接觸是至關(guān)重要的。這可通過稀釋或通過限制 分子接觸表面積完成。通過稀釋，限制染料的濃度以致于干擾最小。在更優(yōu)選的方法中，染 料應(yīng)是不溶的，并且染料存在于與擴(kuò)增試劑接觸的固相中，以致于染料與擴(kuò)增試劑的分子 接觸表面積大幅減少。
[0018] 在擴(kuò)增中，在沒有額外的tris緩沖液存在時(shí)，提供穩(wěn)定的起始pH值是可能的。如果 容器保持密封，反應(yīng)中染料的顏色能很多天不改變。
[0019]依賴于Mg離子濃度和擴(kuò)增的起始pH值，擴(kuò)增后的pH值變化或是陽性或是陰性。因 此，控制起始pH值很重要。然后通過加入弱緩沖組分或加入酸/堿來調(diào)整而設(shè)定起始pH值。 當(dāng)pH染料與擴(kuò)增試劑預(yù)混合時(shí)，則更容易在不需要pH計(jì)時(shí)知道起始pH是否正確。
[0020] 由于染料組分可溶或存在于與反應(yīng)接觸的固體表面，因此對(duì)反應(yīng)室的形式?jīng)]有限 制，而ISFET則相反。為了可視化閱讀，容器的至少一部分不是完全不透明的以允許觀察。整 個(gè)過程與任何柜臺(tái)上的反應(yīng)小瓶相匹配而不需要設(shè)計(jì)專有的反應(yīng)盒，諸如Cepheid的Xpert 或BioFire的生物膜陣列的情況。
[0021] 發(fā)明背景
[0022]已經(jīng)使用分析測(cè)試來分析測(cè)試樣品，尤其是用于此類用途的橫向流動(dòng)裝置已經(jīng)用 在即時(shí)測(cè)試應(yīng)用中，因?yàn)樗鼈兪褂煤唵尾⑶沂褂孟鄬?duì)便宜。參見US SN 14/345,276,通過引 用將其全文并入本文。這些已建立的可讀裝置通常依賴于諸如金、乳液或熒光的有色顆粒 以當(dāng)分析物與有色顆粒接觸時(shí)變得可見。使用者觀察得到產(chǎn)生的顏色。這樣，可能因?yàn)槭褂?者對(duì)有色模式的解釋而存在對(duì)如何解釋結(jié)果的不一致。
[0023]為了幫助緩解顏色模式的這一潛在解釋，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)字橫向流動(dòng)分析儀，其中 單獨(dú)的電子閱讀器在橫向流動(dòng)膜測(cè)試區(qū)上掃描和閱讀無論是顏色或熒光的模式。這種類型 儀表的實(shí)例包括ESEQuant橫向流動(dòng)免疫分析閱讀器和IDEXX實(shí)驗(yàn)室的SNAPshot Dx分析器。
[0024] 市售的一些這種類型的裝置具有與它們用途相關(guān)的固有問題。例如，卡式閱讀器 的方法使得這類裝置變得昂貴。在大多數(shù)這種情況下，可將一次性儀表整合入橫向流動(dòng)裝 置的流動(dòng)中。一種此類裝置是Clear Blue驗(yàn)孕裝置，其中可光學(xué)感測(cè)反應(yīng)區(qū)域的有色線以 監(jiān)測(cè)線的出現(xiàn)。這種類型的裝置具有兩個(gè)橫向流動(dòng)分析(LFA)條，具有諸如光學(xué)傳感器、處 理器、LCD(液晶顯示器)和電池的合適的電子元件的印刷電路板(PCB)。這種類型測(cè)試裝置 使用LFA檢測(cè)懷孕標(biāo)記hcG。一個(gè)LFA是校準(zhǔn)控制而另一個(gè)是檢測(cè)條。
[0025] 不幸地，這些類型的裝置相當(dāng)浪費(fèi)，因?yàn)殡娮釉趦H使用一次后就被丟棄。此 外，此類裝置的制造需要許多步驟，因此增加了成本。因此，需要其中此類裝置更容易生產(chǎn) 并且不是僅使用一次后就丟棄的裝置。
[0026] 例如，諸如聚合物和其它分子的導(dǎo)體和半導(dǎo)體材料如今已用在電子元件陣列中。 此類用途包括移動(dòng)服務(wù)中的顯示器，在此類裝置中使用有機(jī)電子元件(和無機(jī)電子元件)代 替?zhèn)鹘y(tǒng)電子元件。
[0027]使用電子元件的一個(gè)實(shí)例是射頻識(shí)別(RFID)，但是仍在尋求開發(fā)加上記憶輸入一 起的快速開關(guān)晶體管和lOOKHz頻率的天線。有機(jī)晶體管可能是為表面提供電子元件以用于 諸如測(cè)試分析的用途的解決方案。
[0028] 對(duì)紙加入有機(jī)電子元件緩和錯(cuò)誤讀數(shù)問題、偽造、破壞和安全問題。
[0029] 本發(fā)明克服這一技術(shù)缺點(diǎn)的一種方法是利用對(duì)晶體管使用和其它使用均兼容的 電子墨水材料。本發(fā)明提供與調(diào)節(jié)電荷輸送的材料系統(tǒng)一起使用的一種機(jī)制或開關(guān)現(xiàn)象， 用在顯示器中以及也用于能量存儲(chǔ)或轉(zhuǎn)化。
[0030] 因?yàn)榧埵侨祟愔圃斓淖疃嗟纳a(chǎn)產(chǎn)品，因此它是用于待使用的有機(jī)/無機(jī)電子元 件的合理基底。紙可以減少許多途徑和材料沉積步驟的使用，形成本發(fā)明的基礎(chǔ)。
[0031] 印刷技術(shù)包括基于薄片的印刷和基于卷軸式的印刷?；诒∑膰娔∷⒑徒z網(wǎng) 印刷通常用于低容量、高精度的工作。凹版印刷、平板印刷和柔版印刷也用于高容量生產(chǎn)。 然而平板印刷和柔版印刷主要用于無機(jī)和有機(jī)導(dǎo)體，凹版印刷特別適用于質(zhì)量敏感層。通 過大規(guī)模印刷方法的手段制備有機(jī)場(chǎng)效應(yīng)晶體管和集成電路。
[0032] 也使用絲網(wǎng)印刷用于制作電子元件，由于具有從膏糊狀材料生產(chǎn)有圖案的厚層的 能力。
[0033] 氣溶膠噴射印刷是利用印刷電子元件的另一種方法。氣溶膠噴射印刷開始于墨水 的霧化，其可加熱至80°C，產(chǎn)生直徑1-2微米級(jí)別的液滴。霧化的液滴夾雜在氣體流中并被 遞送至打印頭。
[0034] 與印刷類似的其它方法包括微觸電印刷和納米壓印平板印刷也是有用的。此處， 通過類似于分別以軟、硬形式?jīng)_壓的方法分別制備Mi和nm尺寸層。常常以減法的方式制備 實(shí)際結(jié)構(gòu)，例如，通過蝕刻遮蔽物沉積或通過剝離方法。例如可以制備用于0FET的電極。
[0035] 使用有機(jī)和無機(jī)材料用于印刷電子元件。墨水材料必須是以例如溶液、分散液或 懸浮液的液體形式可用的，并且它們必須起到導(dǎo)體、半導(dǎo)體、電介質(zhì)或絕緣體的功能。
[0036] 有機(jī)印刷電子學(xué)整合了來自印刷、電子學(xué)、化學(xué)和材料科學(xué)，尤其是來自有機(jī)和聚 合物化學(xué)的知識(shí)和開發(fā)方案。在結(jié)構(gòu)、操作和功能方面，有機(jī)材料在某種程度上不同于傳統(tǒng) 電子元件，其影響裝置和電路設(shè)計(jì)及最優(yōu)化，以及制造方法。
[0037]共輒聚合物的發(fā)現(xiàn)以及它們發(fā)展成可溶材料提供了第一種有機(jī)墨水材料。來自于 這一類的聚合物擁有導(dǎo)電性、半導(dǎo)電性、電致發(fā)光、光電和其它性能。
[0038]有機(jī)半導(dǎo)體包括摻雜有聚(苯乙烯磺酸鹽）的導(dǎo)電聚合物聚（3，4-乙烯二氧噻吩） (poly(3,4-ethylene dioxitiophene)) (PEDOT: PSS)，和聚（苯胺）（PANI)。這些聚合物以不 同配方可商購獲得并且已經(jīng)分別使用噴墨、絲網(wǎng)和平板印刷，或絲網(wǎng)、柔版和凹版印刷來印 刷。在傳感技術(shù)2011第五屆國際會(huì)議標(biāo)題為"基于阻抗測(cè)量具有聚苯胺層的柔性pH傳感器 (Flexible pH sensor with polyaniline layer based on impendance measurement)'' 呈現(xiàn)的摘要中公開了通過阻抗變化利用聚苯胺層用于感測(cè)pH值變化的柔性傳感器的使用。
[0039] 無機(jī)電子元件提供高度有序的層和界面。
[0040] 銀納米顆粒與柔版、平板和噴墨一起使用。金顆粒與噴墨一起使用。
[0041] 其它重要的基底標(biāo)準(zhǔn)是低粗糙度和合適的可濕性，其可在處理前調(diào)整（涂覆、電 暈）。與傳統(tǒng)印刷相反，高吸光率通常是不利的。
[0042] 發(fā)明概述
[0043] 本發(fā)明的目標(biāo)之一是通過利用印刷電子元件來提供醫(yī)療測(cè)試裝置分析、裝置和試 劑盒，其中裝置的電子系統(tǒng)部分是通過使用有機(jī)半導(dǎo)體材料或無機(jī)材料印刷。
[0044] 本發(fā)明提供功能性化學(xué)/有機(jī)場(chǎng)晶體管作為傳感器。此外，本發(fā)明提供功能性可印 刷檢測(cè)電路作為控制器，以及可見形式的結(jié)果閱讀器。
[0045] 此外，本發(fā)明提供通過使用根據(jù)可程序化間隔計(jì)時(shí)器(PIT)水平改變導(dǎo)電性的可 印刷組分和材料來測(cè)量PIT的傳感器裝置。
[0046]在本發(fā)明中有用的有機(jī)材料包括如聚苯胺、聚（3-己基噻吩）、并五苯、聚三芳胺、 5 '，5-二-(7-十二烷基-9H-芴-2基)-2，2 '-雙噻吩、聚乙烯、萘二甲酸酯和/或聚(4，4 '-二癸 基雙噻吩-共聚-2，5噻吩并[2，3_b]噻吩）（poly(4，4 ' didecylbithiopene_c〇-2，5-thieno [2，3-b ] th iophene))的此類材料。在本發(fā)明中有用的無機(jī)材料包括五氧化鉭、氯化銀、銀 漿、硅、二氧化硅、氮化硅、氧化鋁和/或其它礦物半導(dǎo)體、金屬和金屬氧化物。此外，納米顆 粒、納米管和/或石墨烯在本發(fā)明是有用的。
[0047]本發(fā)明的另一目標(biāo)是包括通過印刷方法制造的本發(fā)明的晶體管、電阻器、電容器、 二極管、內(nèi)部連線和其它相關(guān)電子元件。在本發(fā)明中是有用的印刷方法包括原子層沉積、氣 相沉積、噴墨印刷、卷軸式印刷和/或絲網(wǎng)印刷。
[0048]此外，因此本發(fā)明的另一目標(biāo)提供通過利用高容量輸出系統(tǒng)來印刷這些組件的新 方法。例如，基于墨水的卷軸式印刷可以印刷數(shù)百萬的本發(fā)明的電子組件，因此削減了制造 成本并簡化了這些裝置的總體使用。
[0049] 此外，本發(fā)明具有重量輕的優(yōu)勢(shì)并且給組件提供了增強(qiáng)的柔性。柔性傳感器提供 了與此類裝置的橫向流動(dòng)條良好接觸，但是它避免了對(duì)任何此類裝置的膜結(jié)構(gòu)的潛在損 害。此外，因?yàn)橛∷㈦娮釉膶?shí)際重量比通常的印刷電路板(PCB)組件(這些包括印刷電 路板和諸如封裝的邏輯和記憶芯片、電阻器、電感器和電容器的分立元件）更小，更好地保 護(hù)橫向流動(dòng)條免受潛在的損害。
[0050] 本發(fā)明將傳感器整合成諸如在薄片上的單一系統(tǒng)。如此，可通過整合電化學(xué)轉(zhuǎn)變 以懸浮期望的特定物質(zhì)來構(gòu)造單次使用系統(tǒng)。此外，本文提供了隨后可被放大和甚至進(jìn)一 步被解碼以潛在地顯示數(shù)值的任何電子信號(hào)。
[0051] 因此本發(fā)明包含以無需使用許多組件形式印刷的可印刷的電子傳感器系統(tǒng)、晶體 管、感應(yīng)晶體管、控制電路、信號(hào)處理電路、顯示電路、和任選地電池。
[0052] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用以監(jiān)視的印刷的邏輯電路和在一段時(shí)間內(nèi)來自傳感 器的電信號(hào)。
[0053]因此，用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案是pH指示劑方法，其中例如核酸、擴(kuò) 增物的樣品流動(dòng)通過位于基底上的微流體通道，并且當(dāng)它流動(dòng)時(shí)，沿著通道的長度連續(xù)穿 過適合于連續(xù)重復(fù)的基底(substrate)或基底(base)中提供的溫度區(qū)。pH指示劑染料可以 并入所有PCR和本文描述的諸如橫向流動(dòng)裝置的其它實(shí)施方案中。當(dāng)使用這種方法、裝置 和/或試劑盒時(shí)，觀察的解讀是顏色變化、在最初未發(fā)現(xiàn)線的地方出現(xiàn)線或其它圖案，在白 色背景上出現(xiàn)線或線消失以指示陰性結(jié)果，以及指示反應(yīng)結(jié)果解讀的其它觀察。
[0054]雖然上文一般說明為達(dá)到熱循環(huán)設(shè)計(jì)的PCR系統(tǒng)，多種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是已知 的，例如單鏈置換擴(kuò)增(SDA)，并且可同樣依照本發(fā)明監(jiān)測(cè)使用此類技術(shù)的DNA或RNA擴(kuò)增。 [0055]本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供至少一種在與樣品混合前與擴(kuò)增試劑混合的pH指示劑 染料。當(dāng)加入樣品后有擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，pH值變化導(dǎo)致pH指示劑染料的顏色變化。當(dāng)染料固定于 能透過氫離子而不能透過DNA聚合酶或核酸的固體基質(zhì)時(shí)，通過肉眼更容易看到顏色變化。 因?yàn)椴顒e滲透性，通過增加固體基質(zhì)中的染料濃度來增加光強(qiáng)度而不增加抑制反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn) 是可能的。pH指示劑可以是顆?；蚬潭ㄓ陬w粒上。顆粒尺寸不受染料或顏色選擇的限制。顆 粒尺寸只與反應(yīng)容器或條件的選擇相關(guān)。染料也可以固定在膜上或容器表面，使得對(duì)擴(kuò)增 反應(yīng)的干擾最小化。
[0056]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)也是提供用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)例如核酸擴(kuò)增反應(yīng)的pH敏感染料。 染料可在溶液中、在諸如珠子或條的三維物體上，或在容器或隔間里或其組合。
[0057]可有利地使用珠子的用途。珠子是由例如二氧化硅、聚苯乙烯、瓊脂糖或葡聚糖的 任何適合于染料附著的材料合成的球形顆粒?？墒褂煤?殼結(jié)構(gòu)合成顆粒，因此可由順磁性 材料和染料水凝膠形成顆粒。例如二氧化硅的珠子具有較高的密度，如此容易保持珠子在 溶液中的恒定位置或通過反轉(zhuǎn)反應(yīng)小瓶將珠子從溶液中移出。
[0058]本發(fā)明也具有比色感測(cè)的有利用途，作為通過在溶液中或固定于諸如在珠子里的 一種或多種3D結(jié)構(gòu)上使用pH敏感染料來顯現(xiàn)這些分析結(jié)果的一種方法。同樣，該系統(tǒng)可發(fā) 生在反應(yīng)室或容器中，可使用上述的組合。
[0059] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供產(chǎn)生可通過印刷電子裝置或比色機(jī)制觀察的pH 或視覺信號(hào)的橫向流動(dòng)平臺(tái)。由至少三種或更多種方法組合來實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。一種方法是通 過使用由印刷電子光電導(dǎo)體檢測(cè)的比色介質(zhì)(改變顏色或變得可見）。另一種方法是通過導(dǎo) 致不同電壓輸出的印刷電子傳感器（當(dāng)傳感器暴露于不同pH時(shí)記錄變化）；和使用導(dǎo)致在集 成顯示單元上顯示結(jié)果的印刷電子傳感器（當(dāng)傳感器暴露于不同pH時(shí)記錄變化）。在初始基 線和一段時(shí)間內(nèi)獲取讀數(shù)。然后，記錄變化和用受化學(xué)或生物反應(yīng)影響的閾值pH值變化制 成觀察報(bào)告。
[0060] 在本發(fā)明的裝置的優(yōu)選實(shí)施方案中，傳感器是離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管（ISFET)。使 用這種ISFET來感測(cè)PIT和監(jiān)測(cè)pH值。0FET(有機(jī)場(chǎng)效應(yīng)晶體管)也是有用的。
[0061] 因此本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供產(chǎn)生通過印刷電子裝置觀察的pH或視覺信號(hào)的核 苷酸檢測(cè)平臺(tái)（定量的和/或定性的檢測(cè)）。在這個(gè)平臺(tái)上使用的擴(kuò)增方法是等溫或PCR等， 并且通過下面三種方法或更多種組合實(shí)現(xiàn)：
[0062] 1)通過印刷電子光電導(dǎo)體檢測(cè)顏色度量介質(zhì)（諸如pH染料）（改變顏色或變得可 見）；2)導(dǎo)致不同電壓輸出的阻抗印刷電子傳感器（當(dāng)傳感器暴露于不同pH值時(shí)阻抗變化）； 和/或3)導(dǎo)致在集成顯示單元上顯示結(jié)果的阻抗印刷電子傳感器（當(dāng)傳感器暴露于不同pH 值時(shí)阻抗變化）。
[0063] 在本發(fā)明的ISFET的實(shí)施方案中，該裝置具有印刷為差分測(cè)量的電路以監(jiān)測(cè)在對(duì) 照區(qū)、測(cè)試區(qū)和背景區(qū)之間發(fā)生了什么活動(dòng)(見圖1)。
[0064] 本發(fā)明的可選擇的特征使用包含安裝到柔性基底或印刷電路板上的柔性傳感器 組件和ASIC芯片的混合方法。
[0065] 附圖簡述
[0066]圖1:該圖提供了用于測(cè)量在測(cè)試區(qū)傳感器（ISFET1)和背景區(qū)傳感器（ISFET2)之 間的信號(hào)差異的基本差模電路，控制區(qū)是ISFET3。
[0067]圖2:在測(cè)試區(qū)監(jiān)測(cè)pH值變化的本發(fā)明的設(shè)計(jì)。
[0068]圖3:通過顏色變化監(jiān)測(cè)的酶依賴性pH值。
[0069] 圖4:本發(fā)明的pH指示劑，其中1是樣品墊，2是結(jié)合墊，3是層析膜，4是測(cè)試線，5是 對(duì)照線，6是吸收墊，以及8是支撐材料。
[0070] 圖5A:該圖代表利用單獨(dú)組件的先前系統(tǒng)。圖5B:該圖代表僅用幾個(gè)印刷步驟制造 整個(gè)系統(tǒng)的材料的使用。
[0071 ]圖6.對(duì)應(yīng)于pH值范圍的每個(gè)染料薄膜的顏色。
[0072]圖7.照片闡明了pH薄膜在針對(duì)2C19基因型分型的LAMP反應(yīng)中的顏色反應(yīng)。
[0073]圖8.以薄膜、纖維素顆粒和可溶分子的形式測(cè)試K1化學(xué)品。
[0074]圖9.照片顯示在LAMP反應(yīng)前每個(gè)管中的染料顏色。
[0075]圖10.該照片顯示在上排的LAMP反應(yīng)中發(fā)生擴(kuò)增的管中染料顏色變化，而在下排 的LAMP反應(yīng)中沒有發(fā)生擴(kuò)增的管中染料顏色不變。
[0076]圖11A和B.該圖顯示用于擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)試的兩種不同的薄膜。
[0077]圖12.溴百里酚藍(lán)不產(chǎn)生顏色變化，并且pH保持不變。
[0078]圖13.該圖闡明實(shí)施例傳感器和pH測(cè)試結(jié)果。
[0079]圖14.在LAMP反應(yīng)前，每個(gè)管的染料顏色是粉紅色。
[0080]圖15.然后管1至7的染料顏色變成黃色并且管8至10保持粉紅色。
[0081 ]圖16.該圖表顯示陽性和陰性區(qū)別反應(yīng)。
[0082]圖17.這些是顯示在泳道1至7中的LAMP擴(kuò)增的瓊脂糖電泳照片。
[0083]圖18.該圖顯示在反應(yīng)前關(guān)于DNA的陽性或陰性的染料顏色。
[0084]圖19.該圖顯示在反應(yīng)后關(guān)于DNA的陽性或陰性的染料顏色。
[0085]圖20.該圖是反應(yīng)前全血對(duì)染料顏色的影響。
[0086]圖21.該圖是反應(yīng)后全血的作用。
[0087]圖22.該圖顯示在將染料振蕩出溶液后，固定的染料的顏色。
[0088]圖23.該圖是使用瓊脂糖電泳的每個(gè)管中的LAMP反應(yīng)。
[0089]圖24.該圖顯示在染料存在時(shí)的PCR反應(yīng)結(jié)果。
[0090]圖25.該圖是pH指示劑染料物理截留和化學(xué)連接至交聯(lián)聚合物基質(zhì)的示意圖。 [0091]圖26.該圖顯示當(dāng)使用水凝膠片時(shí)在反應(yīng)對(duì)無反應(yīng)之間的顏色差異。
[0092]圖27.該圖顯示pH響應(yīng)的染料結(jié)合的聚氨酯水凝膠在直徑2mm的醋酸纖維素球體 上的實(shí)例。
[0093] 發(fā)明詳述
[0094] 如圖2中所示，本發(fā)明的裝置之一包含結(jié)合墊、吸收墊、測(cè)試線和對(duì)照線。當(dāng)樣品加 載在結(jié)合墊上時(shí)，由于毛細(xì)管作用力（papillary force)，樣品向測(cè)試線移動(dòng)。試劑在結(jié)合 墊中（這可能是樣品收集管）。在中間，兩者在測(cè)試線和對(duì)照線處被印刷監(jiān)視器分開。當(dāng)有分 析物存在時(shí)，在測(cè)試線形成免疫復(fù)合物。對(duì)照線指示存在活性試劑。任選地，條帶包含層析 膜。
[0095] 電子元件的印刷有大量記載，但是在診斷裝置中則沒有。一些用于電子元件印刷 的技術(shù)包括有機(jī)LED顯示器，柔性觸摸屏、RFID超級(jí)電容器和光伏膜。用作顯示部分的有機(jī) LED可用不同顏色或字體顯示是/不是的答案。
[0096] 智能包裝也能用作0LED。本發(fā)明的裝置使用0LED顯示預(yù)設(shè)信息。
[0097] RFID可用于存貨控制和防偽方法。印刷電子元件的集成允許防偽(例如，本發(fā)明可 完成在本地/遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)庫確認(rèn)裝置序列號(hào)以確保該裝置從未被使用或未被盜，也沒有在該 裝置未被批準(zhǔn)的地點(diǎn)被使用）。在本發(fā)明中，該裝置知道其必須檢測(cè)什么目標(biāo)并且展示具有 結(jié)果的目標(biāo)。
[0098] 作為實(shí)例，印刷電子元件上的內(nèi)部連線可使用銀，用作導(dǎo)電墨水。本發(fā)明的電路使 用導(dǎo)電墨水、半導(dǎo)體墨水、摻雜質(zhì)和介電物質(zhì)，包括分配器、比較儀、非門和放大器。
[0099] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的所有引物由Integrated DNA Technologies或Thermo Fisher合成。因?yàn)榉磻?yīng)中pH染料的存在對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成極小的影響，所以不需要改變擴(kuò)增 試劑的構(gòu)成。唯一的例外是鎂離子(Mg 2+)應(yīng)該足夠高，例如1.5mM或優(yōu)選地2mM或更高，如此 使脫氧核苷酸與鎂離子形成復(fù)合物。
[0100] LAMP是使用引物以便與DNA雜交和以便靶向感興趣的特定序列的雙鏈DNA擴(kuò)增過 程。擴(kuò)增是通過以下實(shí)現(xiàn)的：引物與模板DNA形成雜交，自內(nèi)引物延伸，內(nèi)引物稍后通過聚合 酶的鏈置換活性被外引物取代，以及靶序列和新合成鏈的指數(shù)擴(kuò)增。
[0101] 將引物、脫氧核苷酸(dNTP)、反應(yīng)緩沖液、指示劑染料和聚合酶預(yù)混合，除了聚合 酶在最后一步加入以防止非特異性反應(yīng)之外，無特定步驟順序。對(duì)于使用非凍干制劑的反 應(yīng)，上述試劑應(yīng)放置在冷藏箱中以防止非特異性反應(yīng)。如果需要加熱，在密封容器和將容器 放入加熱塊之前，在最后一步加入樣品DNA，例如純化的人類基因組DNA、動(dòng)物DNA、植物DNA、 新鮮人類全血、M)NA、pUC19質(zhì)粒、不同的病毒、任何自然存在或合成的核酸片段、或嵌合的 人造核酸類似物諸如肽核酸（PNA)、嗎啉基和鎖核酸（LNA)、乙二醇核酸（GNA)、蘇糖核酸 (TNA)和合成堿基，或諸如RNA的任何其它核酸模板。在擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)束時(shí)，通過肉眼或通過 簡單照相機(jī)觀察反應(yīng)容器。
[0102] 其它形成本發(fā)明的目標(biāo)包括但不限于脂蛋白的氨基酸序列，例如肽，多肽，糖蛋 白，脂蛋白諸如胎蛋白（AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)』淀粉樣和HIVp24蛋白。
[0103] 此外，在本發(fā)明中使用諸如細(xì)菌莢膜多糖的糖類聚合物和諸如內(nèi)毒素的脂多糖。
[0104] 使用本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒診斷的特殊的病毒和/或細(xì)菌疾病包括但不限 于乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、皰疹病毒、HIV、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、蝦 白斑綜合癥、貓白血病毒等。與這些診斷相關(guān)并形成本發(fā)明的裝置、試劑盒和方法的蛋白質(zhì) 包括重組核蛋白、扎伊爾埃博拉病毒的糖蛋白和S基因蛋白；乙型肝炎核心多表位;抗-HCV 免疫球蛋白G和重組B病毒糖蛋白。
[0105]通過本發(fā)明診斷的細(xì)菌疾病包括梅毒、衣原體和淋病。
[0106] 當(dāng)使用凍干試劑時(shí)，第一步是在加入樣品目標(biāo)前，用水重懸干燥的試劑。剩余步驟 按照非凍干反應(yīng)中描述的相同順序。
[0107] 本發(fā)明的實(shí)施例也提供了用于通過使用比色方法測(cè)量和電子印刷方法測(cè)量pH值 變化的裝置、試劑盒和方法。
[0108] 存在用于PCR監(jiān)測(cè)的具有集成驅(qū)動(dòng)器（加熱器）的用硅制造的納升反應(yīng)室，參見例 如Iordanov等人，"用于DNA復(fù)制的傳感納升反應(yīng)室（Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication)"，IEEE(2004)229_232(通過引用將其全文并入本文） 存在。如Iordanov等人在上文提及的文章中指明，未處理的娃和標(biāo)準(zhǔn)娃相關(guān)材料是Taq聚合 酶的抑制劑。因此，當(dāng)使用例如硅鍺或彩色硅的硅或硅相關(guān)材料(下文中為"娃"）制造用于 核酸擴(kuò)增的室或通道時(shí)，通常會(huì)覆蓋上材料以防止硅降低聚合酶效率，例如SU8、聚甲基丙 烯酸甲酯(PMMA)、Perspex?或玻璃。
[0109] 用于PCR的微制造硅玻璃芯片也在Shoffher等人的Nucleic Acid Res.(1996)24， 375-379中描述，通過引用將全文并入本文。使用標(biāo)準(zhǔn)光刻法程序制造硅芯片并蝕刻成115y m的深度。將Pyrex?玻璃蓋放置在每個(gè)硅芯片頂部并使硅和玻璃結(jié)合。有但僅有少數(shù)表面的 實(shí)例用于本發(fā)明。其它的包括氧化硅。
[0110] 作為替代方案，用于PCR監(jiān)測(cè)的樣品可流動(dòng)通過微流體裝置的通道或室。因此，例 如，樣品可流動(dòng)通過連續(xù)穿過適合于變性、引物熱處理和引物延伸的PCR階段的不同溫度區(qū) 域的通道或室。
[0111] 因此，在用于實(shí)施本方法的一實(shí)施方案中，用于核酸擴(kuò)增的樣品流動(dòng)通過基底上 的微流體通道，并且當(dāng)它流動(dòng)時(shí)，沿著通道的長度連續(xù)穿過適合于連續(xù)重復(fù)的基底 (substrate)或基底(base)提供的溫度區(qū)?？蓪H指示劑染料并入上文描述的所有PCR實(shí)施 方案中。
[0112] 雖然上文通常舉例說明為實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)設(shè)計(jì)的PCR系統(tǒng)，很多等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是 已知的，例如單鏈置換擴(kuò)增(SDA)，并且可依據(jù)本發(fā)明同樣監(jiān)測(cè)使用此類技術(shù)的DNA或RNA擴(kuò) 增。
[0113] LAMP是使用引物以便與DNA雜交和以便靶向感興趣的特定序列的雙鏈DNA擴(kuò)增過 程。擴(kuò)增是通過以下實(shí)現(xiàn)的：引物與模板DNA形成雜交，自內(nèi)引物延伸，內(nèi)引物稍后通過聚合 酶的鏈置換活性被外引物取代，以及靶序列和新合成鏈的指數(shù)擴(kuò)增。
[0114] 提供的下述實(shí)施例是作為本發(fā)明的說明并不限于本發(fā)明。
[0115] 實(shí)施例1
[0116] pH檢測(cè)裝置和使用該裝置的方法，該裝置具有pH敏感傳感器、用于計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度 的控制電路，和顯示器像素，該裝置的電子元件全部使用卷軸式印刷或絲網(wǎng)印刷。將這些印 刷在諸如柔性塑料的電介質(zhì)材料上。該裝置的生產(chǎn)避免因裝置損毀的浪費(fèi)并且以大生產(chǎn)量 生產(chǎn)。該裝置作為LFA是有用的，其中線的觀察指示反應(yīng)結(jié)果。
[0117] 實(shí)施例2
[0118] 將實(shí)施例1的印刷電子元件放置在LFA條帶頂部，其中pH敏感傳感器、控制電路(計(jì) 算信號(hào)強(qiáng)度）和顯示器像素全部通過卷軸式印刷或絲網(wǎng)印刷印刷。將這些電子組件印刷到 諸如柔性塑料的電介質(zhì)上。
[0119] 具體地，為了測(cè)量pH值，印刷電子系統(tǒng)與層析介質(zhì)接觸。監(jiān)測(cè)pH值的變化，為通過 在10分鐘和30分鐘測(cè)量pH值變化的速率。除其他外，可加入膠水作為中間層。
[0120] 實(shí)施例3
[0121] 印刷感測(cè)器也包括印刷電池為電路供電，或作為可選特征，紐扣電池。電池材料的 選擇應(yīng)不具有火災(zāi)危險(xiǎn)或化學(xué)危險(xiǎn)品的性質(zhì)。優(yōu)選地，電池包括自測(cè)功能。
[0122] 印刷傳感器包含顯示監(jiān)視器(例如，0LED有機(jī)發(fā)光二極管）以指示結(jié)果(是/不是/ 失敗等）。這種印刷傳感器具有做簡單計(jì)算的能力。作為可選元件，傳感器具有通信模塊(例 如RFID)以將患者的信息和結(jié)果上傳至基站(諸如膝上型PC、定制化基站、觸摸板、智能手機(jī) 或其組合）。
[0123] 另一任選元件是能夠從基站(例如，膝上型PC、定制化基站、觸摸板、智能手機(jī)或其 組合)下載患者信息的傳感器，如此該特別裝置被'烙'上患者的ID。任選地將這些通信加密 至有線系統(tǒng)或無線系統(tǒng)。
[0124] 將所有傳感器組件整合入連續(xù)的印刷生產(chǎn)過程(例如，卷軸式）中。分別進(jìn)行傳感 器和LFA的裝配。
[0125] 此外，如果外界溫度不在確定可接受范圍內(nèi)，存在溫度傳感器以補(bǔ)償/調(diào)整/阻止 裝置的使用。
[0126] 存在用于PCR監(jiān)測(cè)的具有集成驅(qū)動(dòng)器（加熱器）的用硅制造的納升反應(yīng)室，參見例 如Iordanov等人，"用于DNA復(fù)制的傳感納升反應(yīng)室（Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication)"，IEEE(2004)229_232(通過引用將其全文并入本文）。 如Iordanov等人在上文提及的文章中指明，未處理的娃和標(biāo)準(zhǔn)娃相關(guān)材料是Taq聚合酶的 抑制劑。因此，當(dāng)使用例如硅鍺或彩色硅的硅或硅相關(guān)材料（下文中為"硅"）制造用于核酸 擴(kuò)增的室或通道時(shí)，通常會(huì)覆蓋上材料以防止硅降低聚合酶效率，例如SU8、聚甲基丙烯酸 甲酯(PMMA)、Perspex?或玻璃。
[0127] 用于PCR的微制造硅玻璃芯片也在Shoffher等人的Nucleic Acid Res.(1996)24， 375-379中描述，通過引用將全文并入本文。使用標(biāo)準(zhǔn)光刻法程序制造硅芯片并蝕刻成115y m的深度。將Pyrex?玻璃蓋放置在每個(gè)硅芯片頂部并使硅和玻璃結(jié)合。有但僅有少數(shù)表面的 實(shí)例用于本發(fā)明。其它的包括氧化硅。
[0128] 作為替代方案，用于PCR監(jiān)測(cè)的樣品可流動(dòng)通過微流體裝置的通道或室。因此，例 如，樣品可流動(dòng)通過連續(xù)穿過適合于變性、引物熱處理和引物延伸的PCR階段的不同溫度區(qū) 域的通道或室。
[0129] 因此，在用于實(shí)施本方法的一實(shí)施方案中，用于核酸擴(kuò)增的樣品流動(dòng)通過基底上 的微流體通道，并且當(dāng)它流動(dòng)時(shí)，沿著通道的長度連續(xù)穿過適合于連續(xù)重復(fù)的基底 (substrate)或基底(base)提供的溫度區(qū)?？蓪H指示劑染料并入上文描述的所有PCR實(shí)施 方案中。
[0130] 雖然上文通常舉例說明為實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)設(shè)計(jì)的PCR系統(tǒng)，很多等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是 已知的，例如單鏈置換擴(kuò)增(SDA)，并且可依據(jù)本發(fā)明同樣監(jiān)測(cè)使用此類技術(shù)的DNA或RNA擴(kuò) 增。
[0131 ] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的所有引物由Integrated DNA Technologies或Thermo Fisher合成。因?yàn)榉磻?yīng)中pH染料的存在對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成極小的影響，所以不需要改變擴(kuò)增 試劑的構(gòu)成。唯一的例外是鎂離子(Mg 2+)應(yīng)該足夠高，例如1.5mM或優(yōu)選地2mM或更高，如此 使脫氧核苷酸與鎂離子形成復(fù)合物。
[0132] LAMP是使用引物以便與DNA雜交和以便靶向感興趣的特定序列的雙鏈DNA擴(kuò)增過 程。擴(kuò)增是通過以下實(shí)現(xiàn)的：引物與模板DNA形成雜交，自內(nèi)引物延伸，內(nèi)引物稍后通過聚合 酶的鏈置換活性被外引物取代，以及靶序列和新合成鏈的指數(shù)擴(kuò)增。
[0133] 將引物、脫氧核苷酸(dNTP)、反應(yīng)緩沖液、指示劑染料和聚合酶預(yù)混合，除了聚合 酶在最后一步加入以防止非特異性反應(yīng)之外，無特定步驟順序。對(duì)于使用非凍干制劑的反 應(yīng)，上述試劑應(yīng)放置在冷藏箱中以防止非特異性反應(yīng)。如果需要加熱，在密封容器和將容器 放入加熱塊之前，在最后一步加入樣品DNA，例如純化的人類基因組DNA、新鮮人類全血、入 DNA、pUC19質(zhì)粒的或任何其它核酸模板。在擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)束時(shí)，通過肉眼或通過簡單照相機(jī) 觀察反應(yīng)容器。
[0134] 當(dāng)使用凍干試劑時(shí)，第一步是在加入樣品目標(biāo)前，用水重懸干燥的試劑。剩余步驟 按照非凍干反應(yīng)中描述的相同順序。
[0135] 實(shí)施例4
[0136] 與無機(jī)場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FET)相似，0FET具有源極，漏極和柵電極。在源極和漏極之 間的通道電流由場(chǎng)效應(yīng)摻雜產(chǎn)生的柵電壓調(diào)節(jié)。與硅FET相比，0FET顯示出相對(duì)較低的載體 移動(dòng)性和穩(wěn)定性，但是在柔性、生物相容性、大面積和溶液可加工性方面顯示更好的性能。 因此，0FET適合于在一次性傳感器中應(yīng)用。
[0137] 表1總結(jié)了基于0FET的化學(xué)和生物傳感器的實(shí)例。
[0138] 表1總結(jié)了基于0FET的化學(xué)和生物傳感器的實(shí)例。
[0140] 實(shí)施例5
[0141] 本發(fā)明的診斷試劑盒的實(shí)施例包括含有層析介質(zhì)的橫向流動(dòng)裝置。這種層析介質(zhì) 包括：（a)位于檢測(cè)區(qū)上游的樣品加載區(qū)；（b)位于樣品加載區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)， 其中報(bào)告載體區(qū)包含能與分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體。本發(fā)明的報(bào)告載體包含載體和一 種或多種高效酶盒。將高效酶盒或高效酶定義為能催化反應(yīng)以使得速率超過1000/秒/酶盒 的酶的組合。在酶學(xué)中該數(shù)值也稱作周轉(zhuǎn)率或Kcat;和(c)檢測(cè)區(qū)，其中檢測(cè)區(qū)包含用于分 析物的捕獲組分和指示劑。樣品在應(yīng)用區(qū)域測(cè)試樣品接觸，其中測(cè)試樣品從樣品加載區(qū)沿 著層析介質(zhì)移動(dòng)通過報(bào)告載體區(qū)至檢測(cè)區(qū)并越過檢測(cè)區(qū)。向測(cè)試區(qū)加入底物，其中底物在 包含報(bào)告載體的高效酶分析物存在時(shí)經(jīng)歷反應(yīng)，并且在檢測(cè)區(qū)中產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于裝置完成測(cè)試 樣品中分析物存在或不存在的指示劑反應(yīng)。
[0142] 實(shí)施例6
[0143] 本發(fā)明的診斷試劑盒的實(shí)施例在層析介質(zhì)中使用酶輔助擴(kuò)增方法檢測(cè)分析物存 在或不存在。分析物是諸如能被抗體或抗體類似物識(shí)別的抗原的生物標(biāo)記。在這個(gè)實(shí)施例 中，報(bào)告載體具有隨后結(jié)合至分析物和高效酶上的第一抗體。捕獲組分包括在與第一抗體 不同的表位與分析物結(jié)合的第二抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體共價(jià)交聯(lián)至高效酶。
[0144] 報(bào)告載體包含鏈霉親和素和生物素化的高效酶和生物素化的抗體。第一抗體通過 非共價(jià)鏈霉親和素-生物素相互作用結(jié)合或關(guān)聯(lián)至高效酶。
[0145] 實(shí)施例7
[0146] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，分析物是核酸序列。在這個(gè)實(shí)施例中，報(bào)告載體包含 雜交至目標(biāo)核酸序列的一部分的第一核酸序列，是與第一核酸相關(guān)聯(lián)的高效酶。第一核酸 共價(jià)交聯(lián)至高效酶。報(bào)告載體包含鏈霉親和素和生物素化的高效酶和生物素化的第一核 酸。第一核酸通過非共價(jià)鏈霉親和素-生物素相互作用關(guān)聯(lián)至高效酶。
[0147] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中報(bào)告載體結(jié)合HIV的p24蛋白。在另一個(gè)應(yīng)用中，報(bào)告載 體結(jié)合HIV核酸。底物是液體溶液，作為裝置的部分。溶液將在最后階段加到條帶上。
[0148] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試線（圖4中的4)也包含pH顏色指示劑。在分析物存在時(shí)，線 (圖4中的4)的顏色變化。在C線（圖4中的5)上也有相同的pH顏色指示劑。在報(bào)告載體存在 時(shí)，顏色變化。在圖11中能找到實(shí)施方案的實(shí)施例。
[0149] 在一個(gè)實(shí)施方案中，pH顏色指示劑是放置在測(cè)試線和對(duì)照線頂部的薄膜。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，pH顏色指示劑在測(cè)試線和對(duì)照線的位置印刷至層析介質(zhì)中。
[0150] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物溶液包含pH指示劑。由于pH值變化，在分析物存在時(shí)測(cè) 試線（圖4中的4)的顏色出現(xiàn)。在報(bào)告載體存在時(shí)，對(duì)照線（圖4中的5)的顏色變化。在圖2中 也顯示了反應(yīng)的實(shí)施例。
[0151] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)是人類丙型肝炎病毒的核心蛋白。對(duì)核心蛋白的第一 表位具有特異性的第一抗體連接至報(bào)告載體。對(duì)核心蛋白的第二表位具有特異性的第二抗 體固定在層析介質(zhì)的檢測(cè)區(qū)。公開的方法檢測(cè)至少〇.5pg的蛋白或更多。蛋白質(zhì)包括諸如但 不限于HIV、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、皰疹病毒 作為實(shí)例的病毒蛋白；腫瘤蛋白（針對(duì)前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA);針對(duì)卵巢癌的 癌抗原125(CA 125);針對(duì)甲狀腺髓樣癌的降鈣素;針對(duì)肝癌的a-胎蛋白（AFP);和針對(duì)諸如 睪丸癌和卵巢癌的生殖細(xì)胞腫瘤的人類絨毛膜促性腺激素(HCG);諸如人類心肌肌鈣蛋白T 或I的心血管疾病蛋白、或肺蛋白、肝蛋白、腎臟蛋白和諸如的定粉樣蛋白的神經(jīng)蛋白；諸如 那些用于檢測(cè)梅毒、衣原體和淋病的細(xì)菌蛋白。
[0152] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)是針對(duì)心肌梗死的人心肌肌鈣蛋白T和/或心肌和/或 肌鈣蛋白I。診斷試劑盒包含印刷電子傳感器和控制電路以為快速測(cè)量提供定量結(jié)果。試劑 盒的敏感性也被用于高敏感性心肌肌鈣蛋白I的分析。
[0153] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一段時(shí)間內(nèi)電子傳感器產(chǎn)生連續(xù)pH值讀數(shù)以產(chǎn)生時(shí)間依 賴的pH值曲線。通過比較不同測(cè)試區(qū)、控制區(qū)和層析介質(zhì)上除測(cè)試區(qū)或控制區(qū)之外的任何 其它點(diǎn)的曲線，在閾值查看檢測(cè)的是/否的答案。相似的，通過比較測(cè)試區(qū)、控制區(qū)好在層析 介質(zhì)上的除測(cè)試/控制區(qū)外的另一點(diǎn)的曲線，執(zhí)行半定量或定量測(cè)量。此外，當(dāng)隨著時(shí)間監(jiān) 測(cè)和記錄反應(yīng)過程時(shí)，也記錄了反應(yīng)的差別讀數(shù)。
[0154] 實(shí)施例8
[0155] K1薄膜是與1-羥基_4-[4-(羥乙基磺?；?_苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀結(jié)合的20微 米厚度的纖維素膜。
[0156] K2薄膜是與4-[4-(2_羥乙基磺?；?-苯偶氮基]_2,6_二甲氧基苯酚結(jié)合的20微 米厚度的纖維素膜。
[0157] K1溶液是丨-羥基-4-[4-(羥乙基磺?；?-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀。
[0158] K1顆粒是與1-羥基_4-[4-(羥乙基磺?；?_苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀結(jié)合的直徑 50微米的纖維素微粒Avicel ?PH-101.。
[0159] 使用不同的染料形式檢測(cè)：
[0160]在分析中使用了三種不同形式的K1染料:K1薄膜、K1顆粒和可溶的K1。分析顯示染 料形式和LAMP反應(yīng)的兼容性。建立LAMP反應(yīng)以使用p450 2C19野生型引物組和K562基因組 DNA。將約300份拷貝的lng K562與反應(yīng)組分混合。在反應(yīng)前，每個(gè)管均包括染料。反應(yīng)在63 攝氏度維持30分鐘，觀察反應(yīng)的顏色。
[0163] 該照片顯示了 pH薄膜在LAMP反應(yīng)中針對(duì)2C19基因型分型的顏色反應(yīng)。照片是在 LAMP反應(yīng)后拍攝的。在圖中，順序是K1薄膜野生型(A)或突變體(D);K1粉末野生型(B)或突 變體(E);K1溶液野生型(C)或突變體(F)。
[0164]表2總結(jié)了在LAMP反應(yīng)中提供的K1染料的色值和pH值。
[0166] 以薄膜、纖維素顆粒和可溶分子的形式測(cè)試K1化學(xué)品。（見圖8的上表）。使用顏色 面板將2C19基因型分型的顏色變化轉(zhuǎn)變成數(shù)字。圖表顯示了pH值變化(起始pH-結(jié)束pH)和 顏色變化(起始顏色-結(jié)束顏色）。當(dāng)顏色變化或pH值變化的閾值維持在1時(shí)，有LAMP反應(yīng)的 樣品與沒有LAMP反應(yīng)的樣品是不同的。pH值變化與顏色變化100 % -致。
[0167] 實(shí)施例9
[0168] 建立反應(yīng)以使用p450 2C19野生型引物組和K562基因組DNA。將約300份拷貝的lng K562與這些反應(yīng)組分混合。在反應(yīng)前，每個(gè)管均包括pH指示劑染料。在陰性對(duì)照樣品中，用 2.8mM的（脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸）的混合物替換dNTP。反應(yīng)在 63攝氏度維持30分鐘，觀察反應(yīng)的顏色。
[0170] 在每個(gè)管中，在LAMP反應(yīng)前，將不同的染料薄膜(K1和K2)或可溶的pH指示劑(溴百 里酚藍(lán)，0.1mg/mL)與擴(kuò)增試劑混合。針對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)試兩種不同的薄膜。反應(yīng)建立的照片 和結(jié)果顯示在圖9和10中。通過使用譯碼面板將顏色變化轉(zhuǎn)變成值。編譯的值顯示在表3中。 為了顯現(xiàn)顏色差異和擴(kuò)增對(duì)未擴(kuò)增，值繪制在圖8中。
[0171] 結(jié)果顯示在模板存在時(shí)的顏色變化。
[0172]照片顯示了在LAMP反應(yīng)前，每個(gè)管中染料的顏色。在照片中，管是有模板(A)和沒 有模板(D)的K1薄膜LAMP反應(yīng)，有模板(B)和沒有模板(E)的K2薄膜，有模板(C)和沒有模板 (F)的溴百里酚藍(lán)溶液。
[0173] 圖9和圖10顯示在LAMP反應(yīng)中發(fā)生擴(kuò)增的管中（上排)染料顏色變化，而在LAMP反 應(yīng)中沒有發(fā)生擴(kuò)增的管中（下排)染料顏色保持不變。在照片中，管是有模板(A)和沒有模板 (D)的K1薄膜LAMP反應(yīng)，有模板(B)和沒有模板(E)的K2薄膜，有模板(C)和沒有模板(F)的溴 百里酚藍(lán)溶液(見圖10)。
[0174] 表3顯示與LAMP反應(yīng)相關(guān)的顏色結(jié)果和pH值。
[0176] 針對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)試兩種不同的薄膜。將兩種不同的pH指示劑固定在纖維素薄膜 上。使用其自身的顏色面板將每種薄膜的顏色變化轉(zhuǎn)變成數(shù)字。表3顯示了pH值變化(起始 pH-結(jié)束pH)和顏色變化(起始顏色-結(jié)束顏色）。在所有三種染料薄膜中，LAMP反應(yīng)的值明顯 區(qū)別于沒有LAMP反應(yīng)的值。pH值變化與顏色變化100 % -致。在圖12中，使用瓊脂糖電泳分 析每個(gè)管中的樣品。
[0177] 顏色變化的強(qiáng)度非常強(qiáng)，如此可容易通過裸眼確定結(jié)果。當(dāng)使用可溶性染料(溴百 里酚藍(lán)，O.lmg/mL)作為指示劑時(shí)，也存在明顯的顏色變化。這顯示使用可溶性染料是可能 的。
[0178] 然而，在較高濃度，染料抑制反應(yīng)。當(dāng)將可溶的K1染料與LAMP反應(yīng)混合時(shí)，也觀察 到相似情況?？扇苄曰瘜W(xué)品易于干擾和抑制擴(kuò)增。
[0179] 溴百里酚藍(lán)不會(huì)產(chǎn)生顏色變化而且pH值保持在8.5不變(見圖13)。
[0180] 實(shí)施例10
[0181] 建立反應(yīng)以使用A引物組（圖22)和人基因組DNA。將DNA模板稀釋至代表1、10、100、 1，000、10，000，、100，000、1，000，000 和 10，000000 份拷貝的 ADNA 的多種濃度。在反應(yīng)前，每 個(gè)管中包括K2薄膜。陰性對(duì)照不包含ADNA。反應(yīng)在63攝氏度維持30分鐘，觀察反應(yīng)的顏色。 當(dāng)有擴(kuò)增時(shí)，K2薄膜顏色從深紫紅色變成淡黃色。在本分析中，敏感顯示的極限為10份拷 貝。
[0183] 管1至7的染料顏色變成黃色。管8至10保持粉紅色。結(jié)果顯示檢測(cè)限是10份拷貝的 入DNA(見圖14和15)。
[0184] 表4
[0186] 提供了不同拷貝數(shù)的反應(yīng)的色值和pH值的結(jié)果。
[0187] 在LAMP反應(yīng)前，每個(gè)管中染料的顏色是粉紅色。每個(gè)管對(duì)應(yīng)一ADNA濃度(見圖14)。
[0188] 管1至7的染料顏色變成黃色。管8至10保持粉紅色。結(jié)果顯示檢測(cè)限是10份拷貝的 入DNA(見圖15)。
[0189] 表5:提供了不同拷貝數(shù)的反應(yīng)的色值和pH值的結(jié)果。
[0190]圖表顯示可容易區(qū)分陽性和陰性反應(yīng)的區(qū)別。使用K2薄膜的檢測(cè)顯示低至10份拷 貝的ADNA(見圖16)。
[0191] 瓊脂糖電泳照片顯示LAMP擴(kuò)增發(fā)生在泳道1至泳道7,其中拷貝數(shù)分別是10,000， 000、1，000，000、00，000、10，000、1，000、100 和 10。泳道 8 對(duì)應(yīng)于單拷貝的 ADNA，其中沒觀察 到擴(kuò)增。泳道9和泳道10是無ADNA的反應(yīng)。
[0192] 實(shí)施例11
[0193] 在每個(gè)管中，在LAMP反應(yīng)前，將可溶pH指示劑(溴百里酚藍(lán)，0.1mg/mL)、Kl薄膜和 pH測(cè)試紙(Merck Millipore cat#l .09543.0001，非滲出紙)與擴(kuò)增試劑混合。
[0194] 建立反應(yīng)以使用p450 2C19野生型引物組和K562基因組DNA。將約300份拷貝的lng K562與反應(yīng)組分--50mM KCl、5mM MgS〇4、5mM NH4CUIM Betaine、lmg/mL BSA、0.1%吐溫 20、2.8mM dNTP(脫氧腺苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸和脫氧胞苷三磷酸）、 1.6yM FIP和BIP、0.8yM Loop-F和Loop-B、0.2yM F3和B3、和32U的Bst聚合酶在50yL反應(yīng)中 混合。在加入Bst、K562或全血前，將pH值調(diào)整至8.0。在陰性對(duì)照樣品中，用2.8mM的(脫氧腺 苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸）的混合物替換dNTP。在另一個(gè)面板中，將從手 指扎針采集的2yL的新鮮全血加入到每個(gè)管中。反應(yīng)在63攝氏度維持30分鐘，觀察反應(yīng)的顏 色。
[0195] 除了K1薄膜，所有的在全血存在時(shí)，看出擴(kuò)增對(duì)非擴(kuò)增的之間的差別是非常有挑 戰(zhàn)性的。由于可簡單和容易地將渾濁的全血溶液從K1薄膜上移除，可像照片中顯示的那樣 監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增。
[0196] 照片顯示了在反應(yīng)前有（陽性）或沒有（陰性)純化的DNA的染料顏色。反應(yīng)使用純 化的DNA作為模板。從左至右，管包含染料:溴百里酚藍(lán)(A和B)、K1薄膜(C和D)，和pH測(cè)試紙 (E和F)。在pH8時(shí)，管A和B是淡藍(lán)色、管C和D(K1薄膜）是深紫紅色，和管E和F(Merck-Millipore的pH紙）是褐綠色。
[0197] 照片顯示了在反應(yīng)后有（陽性)或沒有（陰性)DNA模板的染料顏色。當(dāng)反應(yīng)中有DNA 模板時(shí)，染料顏色變化。管B (溴百里酚藍(lán))從淡藍(lán)色變成黃色。管D(K1薄膜)從深紫紅色變成 橙色。管F (pH紙)從褐綠色變成淡黃色。
[0198] 照片顯示在反應(yīng)前全血對(duì)染料顏色的作用。將具有模板DNA的管標(biāo)記上正號(hào)，而將 沒有加DNA的管標(biāo)記上負(fù)號(hào)。每個(gè)管包含2此新鮮全血。從左至右，管包含溴百里酚藍(lán)(A和 B)、K1薄膜(C和D)，和pH測(cè)試紙(E和F)。在pH8時(shí)，溴百里酚藍(lán)是淡藍(lán)色，K1薄膜是深紫紅色， 和由于不同顏色的混合Merck-Mi 11 ipore的pH紙難于確定顏色。
[0199] 照片顯示反應(yīng)后的全血作用?？扇苋玖箱灏倮锓铀{(lán)(A和B)的顏色在全血存在時(shí)變 得不能辨別。
[0200] 照片顯示在將染料振蕩出溶液后，固定的染料的顏色。在K1薄膜(C和D)和pH紙(E 和F)的情況中，可將血從固定的染料移除。移除的過程不需要使用者打開管，因此沒有污染 的風(fēng)險(xiǎn)。在移除血后，pH紙的顏色也難于區(qū)分?jǐn)U增(F)和不擴(kuò)增(E)。這是因?yàn)榧埖亩嗫诐B水 結(jié)構(gòu)困住血。K1薄膜的顏色是唯一顯示無擴(kuò)增(C，色值=3)和擴(kuò)增(D，色值=1)之間明顯差 別的反應(yīng)。
[0201 ]每個(gè)管中的LAMP反應(yīng)使用瓊脂糖電泳。BTB是溴百里酚藍(lán)(見圖23)。
[0202] 實(shí)施例12 [0203] PCR實(shí)施方案
[0205]在PCR中使用用于監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增的指示劑染料薄膜。薄膜與PCR反應(yīng)條件相配。在 一個(gè)實(shí)施例中，通過使用包含丙型肝炎病毒核心lb基因的質(zhì)粒裝配分析。在PCR反應(yīng)前，用 染料薄膜設(shè)置反應(yīng)。調(diào)整每個(gè)反應(yīng)的pH值在8.0-8.2之間。熱循環(huán)程序遵循在94攝氏度2分 鐘的初始變性步驟，具有三步模塊的55次重復(fù):94攝氏度30秒，65攝氏度20秒和72攝氏度15 秒。反應(yīng)最后一步在72攝氏度維持2分鐘后結(jié)束反應(yīng)。在管從機(jī)器中取出后觀察管顏色。 [0206]結(jié)果顯示有擴(kuò)增的管(黃色)和沒擴(kuò)增的管(粉紅色)之間的不同顏色差異。
[0207]在圖33中，提供了染料存在時(shí)的PCR反應(yīng)結(jié)果。K1薄膜顯示在A、C、E和G中，而K2薄 膜顯示在B、D、F和H中。在PCR反應(yīng)前，所有的薄膜顯示橙色。在PCR反應(yīng)后，無擴(kuò)增的管(E和 F)顯示粉紅色。發(fā)生擴(kuò)增的具有質(zhì)粒模板的管顯示黃色(G和H)。
[0208] 實(shí)施例13
[0209] -直以來都希望開發(fā)不需要樣品準(zhǔn)備和從樣品到最終結(jié)果不需要超過2步和對(duì)于 結(jié)果解釋不需要儀器的能夠檢測(cè)基因的分析。本發(fā)明提供了滿足這些要求的方法?；蛟?直接從指尖扎針采血的全血存在時(shí)擴(kuò)增。通過使用固定染料監(jiān)測(cè)擴(kuò)增來檢測(cè)基因的存在。 這導(dǎo)致將所有這些步驟減少至一步。
[0210] 首先，將水從預(yù)定體積容器加載至一個(gè)或多個(gè)包含凍干擴(kuò)增試劑的反應(yīng)容器中， 在指示劑染料存在時(shí)將諸如全血的樣品加載至反應(yīng)容器中。
[0211] 為了防止污染，在任何核酸擴(kuò)增后，容器應(yīng)該保持儀器保持牢固密封。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng) 為非澄清溶液如全血擴(kuò)增時(shí)，在沒有任何儀器的幫助下，擴(kuò)增結(jié)果通常難以讀取。為了克服 來自與樣品一起帶入的懸浮膠體顆?；蛴猩衔锏母蓴_，通常通過稀釋或加熱或兩者預(yù) 處理樣品。實(shí)施例涵蓋了無儀器的常規(guī)檢測(cè)，諸如DNA螯合熒光染料、Y0-PR0-1或Sybr Green(Genome Letters，2，l 19-126,2003)、金屬螯合染料、|丐黃綠素和羥基萘酸藍(lán) (Biotechniques，46，167-172，2009)。
[0212] 本發(fā)明證明染料化學(xué)品（K1和K2)共價(jià)連接到安裝在擴(kuò)增發(fā)生的容器中的水凝膠 3D物體上。從我們公開的內(nèi)容顯示，使用與K1或K2結(jié)合的薄膜允許肉眼容易讀取核酸擴(kuò)增 結(jié)果。然而，沒有打開反應(yīng)容器，并不總是容易在容器中將溶液從薄膜分離，因?yàn)楸∧ぺ呄?于粘住容器壁。3D物體通過將指示劑染料和容器之間的接觸表面最小化解決了該問題。
[0213] 3D物體是球體，如此使3D物體和反應(yīng)之間的接觸面積最小化?？赏ㄟ^對(duì)諸如聚苯 乙烯球體、纖維素球體或其他材料制成的球體的球體涂上水凝膠層形成3D球體。選擇不同 顏色的球體以加強(qiáng)指示劑顏色染料的對(duì)比度以促進(jìn)肉眼更好地讀取顏色變化。
[0214] 本發(fā)明也描述其中染料是受外部磁場(chǎng)影響的指示劑球體或3D染料指示劑物體的 設(shè)計(jì)。當(dāng)將順磁或鐵磁的材料嵌入3D物體或球體時(shí)，控制染料的位置是可能的，如此在沒有 渾濁溶液的干擾下可觀察染料并且在容器安全密封時(shí)可如此操作。在水凝膠涂層前，植入 就像將鐵針壓入聚合物球體一樣簡單。
[0215] 然而在另一個(gè)實(shí)施方案中，3D物體是在外部磁力影響下能形成3D物體簇的小顆粒 的聚集。顆粒是具有相當(dāng)于球體的微米直徑或其它適于容易進(jìn)行磁力操作的尺寸。
[0216] 水凝膠由聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）（PHEMA)、聚氨酯(PU)、聚（乙二醇）（PEG)、聚 乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯 (PEGDA)、聚（乙烯醇）（PVA)、聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP)或聚酰亞胺(PI)制成。
[0217]染料是任何反應(yīng)性乙烯基磺?；玖匣騪H指示劑染料。
[0218]水凝膠是通過使用聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）形成的，水凝膠與K2染料結(jié)合，K2 染料也稱作4-[4-(2_羥乙基磺酰基)-苯偶氮基]_2,6_二甲氧基苯酚的指示劑染料（乙烯基 磺?；玖希?。
[0219] 材料是
[0220] 1)2-羥乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)、聚（乙二醇)二甲基丙烯酸酯、2,2_二甲氧基-2- 苯基乙酮、4-[4-(2_羥乙基磺?；?-苯偶氮基]_2,6_二甲氧基苯酚(pH指示劑染料）、硫酸、 氫氧化鈉和碳酸鈉
[0221] 水凝膠的制備
[0222] 在表6中給出了在水凝中使用的試劑的化學(xué)成分。
[0223] 表6:用于水凝膠形成的試劑的化學(xué)成分。
[0225] 表5:用于水凝膠形成的試劑的化學(xué)成分
[0226] 在稱量后將所有的試劑一起加入并經(jīng)受10分鐘的攪拌以獲得均勻的混合物。該混 合物是澆鑄至玻璃培養(yǎng)皿中的溶劑。該培養(yǎng)皿經(jīng)受UV照射3min，其中實(shí)行了聚合和交聯(lián)反 應(yīng)。在UV下，DMPA(光引發(fā)劑）發(fā)生分解，每個(gè)光引發(fā)劑分子產(chǎn)生兩個(gè)自由基。自由基引發(fā) HEMA聚合以形成PHEMA，并且同時(shí)也激活聚（乙二醇)二甲基丙烯酸(交聯(lián)劑）以實(shí)行PHEMA鏈 的分子間的交聯(lián)反應(yīng)。3min后，將水凝膠從培養(yǎng)皿上剝離并浸入DI水中l(wèi)hr以保證除去所有 的副產(chǎn)物和未反應(yīng)的試劑。
[0227] 用4-[4-(2_羥乙基磺?；?_苯偶氮基]-2,6_二甲氧基苯酚對(duì)PHEMA水凝膠進(jìn)行化 學(xué)著色
[0228] 在一個(gè)典型固定程序中，將100mg指示劑染料與lg濃硫酸徹底混合(用杵在研缽里 搗)并在室溫放置30min。這使得指示劑染料的2-羥乙基磺?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)變成磺酸基。然后將 混合物倒入900mL蒸餾水中并用1.6mL 32%的氫氧化鈉溶液中和。然后，將25.0g碳酸鈉溶 解在100mL水中并且隨后加入5.3mL的32 %的氫氧化鈉溶液。在這個(gè)階段，將PHEMA水凝膠層 放入該染色液中。在堿性條件下，染料磺酸基轉(zhuǎn)變成化學(xué)反應(yīng)性的乙烯基磺?；苌?，并 且同時(shí)發(fā)生乙烯基磺?；鶊F(tuán)和聚合物反應(yīng)基團(tuán)（例如，PHEMA水凝膠的羥基基團(tuán)）的邁克 爾加成。12h后，將有色層從染色浴中移出并用蒸餾水洗滌幾次。
[0229] 在這個(gè)階段，染料分子化學(xué)連接至交聯(lián)聚合物基質(zhì)。同樣由于水凝膠吸收水溶液 的能力，染料被物理性加載至基質(zhì)中。這是如下文所示的染料結(jié)合至聚合物的非共價(jià)類型。 在充分洗滌后，染料停止從水凝膠中浸出，并且在這個(gè)階段將有色水凝膠切成小塊以用于 核酸測(cè)試。
[0230] 實(shí)施例14
[0231] 建立反應(yīng)以使用A引物組和ADNA。在水凝膠片存在時(shí)，將約100億拷貝的ADNA與反 應(yīng)組分混合（管2)。在陰性對(duì)照樣品中（管1)，用2.8mM的（脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷 酸、脫氧胞苷三磷酸）的混合物替換dNTP。反應(yīng)在63攝氏度維持30分鐘，觀察反應(yīng)的顏色。水 凝膠片為約2_X4mmXlmm。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，很顯然在所有四種脫氧核苷酸存在時(shí)，水凝膠 片從紫紅色變成橙色，而當(dāng)缺失脫氧胸苷三磷酸阻止LAMP反應(yīng)時(shí)，顏色保持紫紅色。
[0233]在圖26中提供了當(dāng)使用水凝膠片時(shí)在反應(yīng)對(duì)無反應(yīng)之間的顏色差異。
[0236] 在直徑2mm的醋酸纖維素球體上pH響應(yīng)的染料結(jié)合的聚氨酯水凝膠的實(shí)施例。
[0237] 核殼水凝膠顆粒的pH反應(yīng)。涂覆水凝膠的醋酸纖維素與pH指示劑染料共價(jià)連接， 并且展示了染料的顏色。在PH7時(shí)，顏色是黃色。在pH8.5時(shí)，顏色是紫紅色。
[0238] A引物組
[0245] CYP2C19 引物組
[0246] 2C19_F3 5'-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT C-3'
[0247] 2C19_B3 5'-AGG GTT GTT GAT GTC CAT-3'
[0248] 2C19_FIP ?野生5，-CCG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3'
[0249] 2C19_BIP?野生5，-CGG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
[0250] 2C19_FIP.Mut 5'-CTG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCT AG-3'
[0251] 2C19_BIP.Mut 5'-CAG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
[0252] 2C19_LF 5'-GAT AGT GGG AAA ATT ATT GC-3'
[0253] 2C19_LB 5，-CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TT-3'
[0254] 引物序列
[0256] 實(shí)施例15
[0257] 制造裝置，其中電子印刷傳感器和檢測(cè)電路并使用。建立具有三層的pH傳感器。一 層是儲(chǔ)藏底物或待測(cè)試分析物的層。它也包含至少兩個(gè)電極，每個(gè)均被pH傳感材料覆蓋。在 本實(shí)施例中，使用聚苯胺。最后，有作為絕緣體以在電極和底物或分析物之間設(shè)置屏障的第 三層。
[0258] 電阻器和電池也是系統(tǒng)或裝置的部分。
[0259] 為了測(cè)量在本實(shí)施例中測(cè)量的電阻變化，使用分配器電路以使值作為電壓變化而 測(cè)量。
[0260] 使用該裝置測(cè)量特別使用的pH水平。如果需要是需要測(cè)量pH值范圍，使用多于一 個(gè)的分配器電路。此外，為了測(cè)量潛在的線性或其它反應(yīng)，取多個(gè)時(shí)間讀數(shù)。
[0261] 實(shí)施例16
[0262] 使用聚苯胺作為覆蓋兩個(gè)平面光電導(dǎo)體的薄膜。聚苯胺薄膜作為顏色對(duì)照濾光 器。該裝置的一個(gè)光電導(dǎo)體作為對(duì)照，并且它的聚苯胺薄膜不接觸測(cè)量pH值變化的分析物。 另一個(gè)光電導(dǎo)體是裝置的測(cè)試部分，并且它的聚苯胺薄膜與分析物反應(yīng)并且基于pH反應(yīng)改 變顏色。也提供用于電池的電壓分配器。聚苯胺在酸性pH是綠色，在堿性pH是藍(lán)色。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 醫(yī)療測(cè)試裝置，所述裝置包括：印刷電子電路、顯示器和電池、傳感器、監(jiān)視器、閱讀 和顯示單元，其中至少一種電子元件是印刷的或其中所述裝置使用比色介質(zhì)來檢測(cè)在測(cè)量 化學(xué)或生物反應(yīng)中的顏色變化。2. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述裝置是集成測(cè)試橫向流動(dòng)裝置。3. 如權(quán)利要求2所述的集成測(cè)試橫向流裝置，其中所述電子元件是使用有機(jī)半導(dǎo)體材 料印刷的。4. 如權(quán)利要求3所述的集成測(cè)試橫向流裝置，其中所述有機(jī)半導(dǎo)體材料是聚(3-己基噻 吩）、并五苯、聚三芳胺、5 '，5-二-(7-十二烷基-9H-芴-2-基)-2，2 ' -雙噻吩、聚乙烯、萘二甲 酸酯、聚(4，4 '二癸基雙噻吩-共聚-2，5噻吩并[2，3-b]噻吩）、聚苯胺或其組合。5. 如權(quán)利要求2所述的集成測(cè)試橫向流裝置，其中所述電子元件是使用無機(jī)材料印刷 的。6. 如權(quán)利要求5所述的集成測(cè)試橫向流裝置，其中所述無機(jī)材料是五氧化鉭、氯化銀、 銀漿、硅、二氧化硅、氮化硅、氧化鋁、礦物半導(dǎo)體、金屬、金屬氧化物或其組合。7. 用于包含層析介質(zhì)的裝置的診斷試劑盒，所述裝置包括：（i)位于檢測(cè)區(qū)上游的樣品 加載區(qū)；（ii)位于樣品加載區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能與 分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體，并且其中所述裝置包含所述報(bào)告載體、載體和一種或多種 高效酶盒;和(iii)檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包含所述分析物的捕獲組分和指示劑。8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其還包括:具有測(cè)試樣品的樣品加載區(qū)，其中所述測(cè)試 樣品從所述樣品加載區(qū)沿著所述層析介質(zhì)移動(dòng)通過所述報(bào)告載體區(qū)至所述檢測(cè)區(qū)并越過 所述檢測(cè)區(qū)。9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其還包括:具有測(cè)試樣品的樣品加載區(qū)，其中所述測(cè)試 樣品在加載至樣品加載區(qū)之前與所述報(bào)告載體混合。10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其還包括：向所述檢測(cè)區(qū)加入底物，其中所述底物在包 含報(bào)告載體的高效酶分析物存在時(shí)反生反應(yīng)，并在所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述測(cè)試樣品 中所述分析物存在或不存在的指示劑響應(yīng)。11. 在層析介質(zhì)中使用酶輔助擴(kuò)增方法檢測(cè)分析物存在的診斷試劑盒，所述試劑盒包 括:作為生物標(biāo)記的分析物、識(shí)別所述生物標(biāo)記的實(shí)體;具有與分析物結(jié)合的第一實(shí)體的報(bào) 告載體;和捕獲組分。12. 如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其中所述生物標(biāo)記是抗原，所述捕獲組分是在與 所述第一抗體不同的表位與分析物結(jié)合的第二抗體。13. 如權(quán)利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述第一抗體共價(jià)交聯(lián)至高效酶。14. 如權(quán)利要求13所述的診斷試劑盒，其中所述報(bào)告載體包括鏈霉親和素和生物素化 的高效酶和生物素化的抗體，其中所述第一抗體通過非共價(jià)的鏈霉親和素-生物素相互作 用與所述高效酶相關(guān)聯(lián)。15. 如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其中所述分析物是核酸序列。16. 如權(quán)利要求15所述的診斷試劑盒，其中所述報(bào)告載體包括與靶核酸序列的一部分 雜交的第一核酸序列，并且其中所述高效酶與所述第一核酸相關(guān)聯(lián)。17. 如權(quán)利要求16所述的診斷試劑盒，其中所述第一核酸共價(jià)交聯(lián)至所述高效酶。18. 如權(quán)利要求17所述的診斷試劑盒，其中所述報(bào)告載體包括:鏈霉親和素和生物素化 的高效酶和生物素化的第一核酸，并且其中所述第一核酸通過非共價(jià)的鏈霉親和素-生物 素相互作用與所述高效酶相關(guān)聯(lián)。19. 如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其中所述報(bào)告載體結(jié)合HIV的p24蛋白、HBV、HCV、 HPV或皰疹病毒;梅毒、衣原體、淋病的細(xì)菌蛋白的核酸或蛋白質(zhì)；脂蛋白或其核酸;糖蛋白 或其核酸。20. 如權(quán)利要求11所述的診斷試劑盒，其中所述報(bào)告載體結(jié)合HIV核酸。21. 用于測(cè)量化學(xué)或生物反應(yīng)的方法，所述方法包括:使用包含至少一種選自電路、顯 示器、電池、傳感器、監(jiān)視器、閱讀單元、顯示單元的電子元件的印刷電子裝置，加入分析物； 觀察反應(yīng);讀取結(jié)果;所述裝置具有數(shù)據(jù)輸入和數(shù)據(jù)輸出機(jī)制以及動(dòng)力輸入機(jī)制。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述裝置是橫向流動(dòng)裝置或微流體裝置。23. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述裝置使用比色介質(zhì)來檢測(cè)顏色的變化或使化學(xué) 或生物反應(yīng)可視化。24. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述比色介質(zhì)是pH敏感指示劑染料。25. 如權(quán)利要求24所述的裝置，其中所述pH敏感染料是在溶液中；固定在一個(gè)或多個(gè)3D 結(jié)構(gòu)上；固定在反應(yīng)室或容器中；或其組合。26. 用于測(cè)試pH值變化的方法，所述方法包括:使用權(quán)利要求25所述的裝置來測(cè)量所述 pH值變化。27. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH敏感染料固定在一種或多種3D結(jié)構(gòu)上。28. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH敏感染料固定在反應(yīng)室或容器中。29. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH敏感染料是固定在溶液中，或一個(gè)或多個(gè)3D 結(jié)構(gòu)上，或在反應(yīng)室或容器中，的組合。30. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述印刷電子元件是納米顆粒、納米管、石墨烯或其 組合。31. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述印刷電子元件是通過原子層沉積、氣相沉積、噴 墨印刷、卷軸式印刷、絲網(wǎng)印刷或其組合印刷的。32. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其還包括:晶體管、控制電路、信號(hào)電路、顯示電路、電池、 用于數(shù)據(jù)記錄的輸入和輸出以及電源。33. 用于測(cè)量pH值變化的裝置，其中所述裝置包括:包含測(cè)試線、對(duì)照線和結(jié)合墊的印 刷傳感器系統(tǒng)。34. 如權(quán)利要求33所述的裝置，其還包括吸收墊。35. 如權(quán)利要求32所述的裝置，其中所述裝置提供是/不是半定量或定量顯示;在之前 沒有發(fā)現(xiàn)線的地方出現(xiàn)線;在白色背景上出現(xiàn)線;不同圖案的出現(xiàn);顏色變化;線的消失;或 其組合。36. 如權(quán)利要求33所述的裝置，其中顯示具有與分析結(jié)果相關(guān)的文本信息的至少一個(gè) 發(fā)光二極管或發(fā)光二極管陣列。37. 醫(yī)療測(cè)試裝置，所述裝置包括：印刷電池、印刷傳感器和上傳信息的通信模塊，其中 所述通信模塊將信息上傳至基站。38. 包括層析介質(zhì)的集成測(cè)試橫向流動(dòng)裝置，其具有位于檢測(cè)區(qū)上游的樣品加載區(qū)；報(bào) 告載體區(qū);檢測(cè)區(qū)，其中報(bào)告載體位于所述樣品加載區(qū)和所述檢測(cè)區(qū)之間。39. 如權(quán)利要求38所述的裝置，其中所述報(bào)告載體包括載體和一種或多種高效酶。40. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其中在層析介質(zhì)中通過酶輔助擴(kuò)增方法檢測(cè)分析物存 在或不存在。41. 如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述分析物是被抗體識(shí)別的生物標(biāo)記抗原。42. 如權(quán)利要求41所述的裝置，其中所述報(bào)告載體包括與所述分析物和高效酶結(jié)合的 第一抗體;并且所述捕獲組分包括在與所述第一抗體不同的表位與所述分析物結(jié)合的第二 抗體。43. 如權(quán)利要求42所述的裝置，其中所述報(bào)告載體是鏈霉親和素、生物素化的高效酶、 生物素化的抗體和/或其組合。44. 如權(quán)利要求43所述的裝置，其中所述分析物是核酸序列。45. 如權(quán)利要求41所述的裝置，其中所述報(bào)告載體結(jié)合HIV核酸。46. 如權(quán)利要求24所述的裝置，包括:是1-羥基-4-[4-(羥乙基磺?；?-苯偶氮基]_萘_ 2_磺酸鉀或4-[4-(2_羥基乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚的指示劑染料，或任 何反應(yīng)性乙烯基磺酰基染料或其組合。47. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述指示劑染料混合在所述反應(yīng)試劑中。48. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH指示劑染料是反應(yīng)前擴(kuò)增試劑的部分。49. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH指示劑染料在反應(yīng)后加入。50. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述pH指示劑固定于細(xì)顆粒微粒、薄膜或三維物體 上。51. 如權(quán)利要求50所述的裝置，其中所述顆粒是由聚合物、多孔性顆?；蚝?殼顆粒制 成的微顆粒，并且其中所述染料共價(jià)結(jié)合所述微顆粒。52. 如權(quán)利要求51所述的裝置，其中所述顆粒由聚合物、多孔性顆粒或核-殼顆粒制成。53. 如權(quán)利要求52所述的裝置，其中一種或多種顆粒作為離散的顆粒、結(jié)合至少一種或 多種顆粒是可行的。54. 如權(quán)利要求50所述的裝置，其中所述三維物體受外部磁力影響。55. 如權(quán)利要求50所述的裝置，其中所述薄膜是與所述pH指示劑染料共價(jià)結(jié)合的膜。56. 如權(quán)利要求50所述的裝置，其中所述三維物體是由水凝膠制成或是包覆在毫米或 微米尺寸的非水凝膠三維物體表面。57. 如權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述三維物體與非水凝膠材料混合來增加質(zhì)量密 度，以增強(qiáng)所述非水凝膠材料的有色背景引入的顏色強(qiáng)度。58. 如權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述三維物體是受外部磁力影響形成三維物體簇 的小顆粒的聚集。59. 如權(quán)利要求58所述的裝置，其中所述三維物體是一個(gè)或多個(gè)毫米顆粒，并且其中所 述毫米顆粒受外部磁力影響在反應(yīng)容器中移動(dòng)。60. 如權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述水凝膠由聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯） (PHEMA)、聚氨酯(PU)、聚（乙二醇）（PEG)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基 丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚（乙烯醇）（PVA)、聚（乙烯基吡咯烷酮） (PVP)、或聚酰亞胺(PI)、或其組合制成。61. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中一種或多種指示劑染料用作起始pH值的指示劑。62. 如權(quán)利要求61所述的裝置，其中一種或多種pH指示劑與每種受制于不同pKa的pH指 示劑一起使用。63. 如權(quán)利要求61所述的裝置，其中使用至少兩種pH指示劑來給出所述起始pH值超出 范圍的指示。64. 如權(quán)利要求61所述的裝置，其中在反應(yīng)前沒有線存在的地方出現(xiàn)了線或其它圖案 表明觀察到化學(xué)或生物反應(yīng)。65. 如權(quán)利要求61所述的裝置，其中比色變化表明觀察到化學(xué)或生物反應(yīng)。66. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中使用擴(kuò)增方法來進(jìn)行反應(yīng)，并且所述方法是熱循環(huán) 法或等溫法。67. 如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述熱循環(huán)法是PCR，實(shí)時(shí)PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR。68. 如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述等溫法是環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增（LAMP)、鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)、核酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、SMART (Nucl. Acids Res. 29: e54,2001)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、交叉引物擴(kuò)增(CPA)、滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA)、分支滾環(huán)擴(kuò)增(RAM)、切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)、切口酶介導(dǎo)擴(kuò)增(NEMA，CN100489112 C)、等溫鏈擴(kuò)增（ICA)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)、信標(biāo)輔助檢測(cè)擴(kuò)增(BAD AMP)、引物生成滾環(huán) 擴(kuò)增(PG-RCA)、或其它核酸擴(kuò)增方法，其中所述擴(kuò)增不需要熱循環(huán)。69. 檢測(cè)核酸擴(kuò)增的試劑盒，所述試劑盒包括：（a)-個(gè)或多個(gè)容器，（b)擴(kuò)增試劑，和 (c)至少一種pH指示劑。70. 如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其中所述pH指示劑是1-羥基-4-[4-(羥乙基磺?；?-苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀或4- [ 4-( 2-羥乙基磺?；?-苯偶氮基]-2，6-二甲氧基苯酚，或任 何反應(yīng)性乙烯基磺?；玖匣蚱浣M合。 71. pH檢測(cè)裝置，其包括:控制用于計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度的電路的pH敏感傳感器組件，和顯示 器像素組件，其中所述組件印刷在電介質(zhì)材料上。72. 如權(quán)利要求71所述的裝置，其中所述電介質(zhì)材料是軟質(zhì)塑料。73. 用于檢測(cè)化學(xué)或生物樣品中比色變化的裝置，所述裝置包括： a. 電子印刷在電極上的至少兩個(gè)光電導(dǎo)體； b. 覆蓋一個(gè)光電導(dǎo)體的有機(jī)膜，其中覆蓋一個(gè)光電導(dǎo)體的一個(gè)膜充當(dāng)對(duì)照并且不與測(cè) 試介質(zhì)相互作用； c. 檢測(cè)另一個(gè)光電導(dǎo)體顏色變化的PH測(cè)量裝置； d. 電池;和 e ·數(shù)據(jù)和動(dòng)力輸入和輸出。74. 如權(quán)利要求73所述的裝置，其中用作所述膜的有機(jī)材料是聚丙氨酸，并且其中pH值 變化反映為顏色變化。75. 通過使用根據(jù)pH值變化測(cè)量導(dǎo)電率的印刷電子元件測(cè)量pH值變化的裝置，所述裝 置包括： a. 隔間或?qū)樱渲蟹胖弥辽賰蓚€(gè)電極，并且其中所述電極是印刷電極，并且其中放置底 物或分析物； b. 其后，包含印刷pH傳感材料的第二隔間或?qū)?和 c. 具有絕緣性以在所述印刷電極和所述底物或分析物之間造成屏障的第三隔間或?qū)印?6. 如權(quán)利要求75所述的裝置，其還包括分配器電路，以記錄轉(zhuǎn)化為可測(cè)量電壓的電 阻。77. 如權(quán)利要求76所述的裝置，其中所述電壓變化是以電泳和/或電層析方式顯示。78. 用于感測(cè)化學(xué)和/或生物反應(yīng)的方法，所述方法包括： a. 檢測(cè)電信號(hào)輸出； b. 監(jiān)測(cè)當(dāng)化學(xué)和/或生物反應(yīng)中的pH值變化時(shí)的電信號(hào)；其中用于所述反應(yīng)電子檢測(cè) 的檢測(cè)組件和監(jiān)測(cè)組件中的至少一種在實(shí)體上。79. 如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述化學(xué)和/或生物反應(yīng)的檢測(cè)是在單一區(qū)域;使 用差分輸出；或在反應(yīng)期間的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量pH。80. 如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述反應(yīng)是PCR反應(yīng)、實(shí)時(shí)PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR。81. 如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述反應(yīng)是比色反應(yīng)。82. 如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述反應(yīng)是等溫反應(yīng)。83. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述等溫反應(yīng)是單鏈置換擴(kuò)增(SDA)、DNA擴(kuò)增、RNA 擴(kuò)增或其組合。84. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述敏感指示劑染料是與所述擴(kuò)增試劑一起凍干 的。85. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中使用至少兩種pH指示劑來給出所述起始pH超出范 圍的指示。86. 如權(quán)利要求85所述的方法，其中每種敏感指示劑染料用作所述起始pH值的指示劑。87. 如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述等溫方法為環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增（LAMO)、鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)、核酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、SMART (Nucl. Acids Res. 29: e54,2001)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、交叉引物擴(kuò)增(CPA)、滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA)、分支滾環(huán)擴(kuò)增(RAM)、切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)、切口酶介導(dǎo)擴(kuò)增(NEMA，CN100489112 C)、等溫鏈擴(kuò)增（ICA)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)、信標(biāo)輔助檢測(cè)擴(kuò)增(BAD AMP)、引物生成滾環(huán) 擴(kuò)增(PG-RCA)、或其它核酸擴(kuò)增方法，其中所述擴(kuò)增不需要熱循環(huán)。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK105899947SQ201480057144
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年8月28日
【發(fā)明人】歐昌沛, 薩格爾·考沙爾, 阿卜杜勒·魯布·阿卜杜勒·拉曼, 溫斯頓·王·二世, 高章琦, 馬奎斯·卡蒂亞
【申請(qǐng)人】克雷多生物醫(yī)學(xué)私人有限公司