一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法
【專利摘要】一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，屬于水產(chǎn)品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，它包括樣品提取、凈化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件及代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱技術(shù)，采用pMRM法能夠準(zhǔn)確測定預(yù)見的代謝產(chǎn)物，并能檢測到低濃度的代謝產(chǎn)物；采用QTrap獨(dú)有的MRM-IDA-EPI工作模式，一次進(jìn)樣，既可得到相應(yīng)代謝產(chǎn)物的MRM色譜圖，又可得到其MS2質(zhì)譜圖。本發(fā)明可以檢測到包括環(huán)丙沙星在內(nèi)的10種代謝產(chǎn)物，其中有兩種新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于環(huán)丙沙星。本發(fā)明填補(bǔ)了我國目前沒有海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物檢測方法的空白，對(duì)研究其它藥物的代謝產(chǎn)物及未知藥物篩查提供了新的借鑒思路。
【專利說明】一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)法檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)屬于第三代喹諾酮類合成抗菌藥物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要抗菌藥物之一，其作用機(jī)理為通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶亞基A的活性，抑制酶的切割與連接功能，使DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成受干擾，從而起到抑菌、殺菌的目的。然而，恩諾沙星的不規(guī)范使用和濫用可以在動(dòng)物體、食品、
[0003]環(huán)境和消費(fèi)者體內(nèi)引起細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康。
[0004]恩諾沙星在環(huán)境中和在動(dòng)物體內(nèi)具有不同的降解或代謝途徑，其在環(huán)境中的降解產(chǎn)物和在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物亦各不相同。研究表明，環(huán)境作用，如介質(zhì)的極性、離子、PH值及與生物分子的結(jié)合等因素，是影響氟喹諾酮類物質(zhì)光化學(xué)特性的關(guān)鍵因素。Li Yan發(fā)現(xiàn)恩諾沙星在水溶液中有包括環(huán)丙沙星在內(nèi)的11種氧化降解產(chǎn)物。Michela發(fā)現(xiàn)土壤中的恩諾沙星在光誘導(dǎo)下有10種降解產(chǎn)物。恩諾沙星的光解產(chǎn)物主要通過三種途徑降解:氧化降解哌嗪側(cè)鏈，脫氟反應(yīng)，氟溶劑分解。大鼠口服恩諾沙星后，在體內(nèi)可檢測到6種代謝產(chǎn)物，包括環(huán)丙沙星、葡糖苷酸恩諾沙星和其它4種代謝產(chǎn)物；恩諾沙星在褐腐真菌(Gloeophyllum striatum)作用下有11種降解產(chǎn)物，其中8種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)得到確定。在毛霉(Mucorramannianus)作用下僅產(chǎn)生3種代謝產(chǎn)物，分別是N-氧化恩諾沙星、N-乙?；h(huán)丙沙星和去乙烯恩諾沙星。在鋸緣青蟹口灌恩諾沙星給藥后血淋巴中發(fā)現(xiàn)3種代謝產(chǎn)物，包括環(huán)丙沙星、羥基化恩諾沙星和加氧恩諾沙星。兔肌注恩諾沙星后，在體內(nèi)檢測到6種代謝產(chǎn)物，包括環(huán)丙沙星、加氧恩諾沙星及其他四種代謝產(chǎn)物。恩諾沙星在食用動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物除環(huán)丙沙星外，關(guān)于其他代謝產(chǎn)物的研究還較少。
[0005]現(xiàn)有報(bào)道研究代謝產(chǎn)物時(shí)主要借助離子阱質(zhì)譜或飛行時(shí)間質(zhì)譜法，通過研究化合物裂解機(jī)制分析代謝產(chǎn)物。離子阱質(zhì)譜具備多級(jí)串級(jí)功能，適合分子結(jié)構(gòu)方面的定性研究，能夠給出分子局部的結(jié)構(gòu)信息，但不能做多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)和中性丟失掃描，無法篩選特征結(jié)構(gòu)分子。由于在篩選未知化合物時(shí)采用一級(jí)質(zhì)譜全掃描，在靈敏度方面有欠缺。飛行時(shí)間質(zhì)譜屬于高分辨質(zhì)譜，可以有助于未知化合物的定性和m/z近似離子的區(qū)別，分析速度快，但價(jià)格昂貴，較精密，維護(hù)成本高。而本發(fā)明采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)法分析海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物，該方法同時(shí)具備多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描(SRM)、中性丟失功能和多級(jí)串級(jí)功能，利用該方法可以檢測海參中恩諾沙星未知代謝產(chǎn)物，根據(jù)給出的母離子與碎片離子的關(guān)系對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法。本發(fā)明應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)技術(shù)，采用pMRM法準(zhǔn)確測定預(yù)見的代謝產(chǎn)物，采用QTrap獨(dú)有的MRM-1DA-EPI工作模式，在進(jìn)行三重四極桿質(zhì)譜工作的同時(shí)，還能進(jìn)行線性離子阱質(zhì)譜的工作，一次進(jìn)樣，既可得到恩諾沙星在海參體內(nèi)代謝產(chǎn)物的MRM色譜圖，又可得到其代謝產(chǎn)物的MS2質(zhì)譜圖。本方法可以檢測到海參體內(nèi)10種代謝產(chǎn)物，除檢測到恩諾沙星最主要的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星外，還檢測到恩諾沙星的另兩種主要代謝產(chǎn)物，一種為環(huán)丙沙星的同分異構(gòu)體，一種為恩諾沙星的加氫還原產(chǎn)物，且這兩種新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜相應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于環(huán)丙沙星。恩諾沙星在海參體內(nèi)的代謝機(jī)制與其他動(dòng)物體內(nèi)的代謝機(jī)制有差異。
[0007]本發(fā)明是按照以下操作方法完成的:
[0008]一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，樣品經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，用酸化乙腈提取其中的恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物，提取液濃縮后，用乙腈水溶液溶解殘留物，用正己烷除脂，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)法進(jìn)行測定，根據(jù)母離子與碎片離子的關(guān)系，對(duì)樣品中的恩諾沙星及其未知代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，所用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件如下:
[0009](I)色譜條件:
[0010]a)色譜柱:C18 反相色譜柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ；
[0011]b)柱溫:35°C ;
[0012]c)流速:0.35mL/min ；
[0013]d)進(jìn)樣量:IOyL ;
[0014]e)流動(dòng)相:A:0.1% (體積比)甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脫程序見表I ;
[0015](2)質(zhì)譜條件:
[0016]離子源參數(shù):
[0017]a)離子化模式:電噴霧離子源(ESI)；
[0018]b)掃描方式:正離子掃描；
[0019]c)碰撞氣 CAD, Medium ；
[0020]d)氣簾氣 Curtain gas, 35psi ;
[0021]e)霧化氣 Gasl, 30psi ;
[0022]f)輔助加熱氣 Gas2，3Opsi ；
[0023]g)噴霧電壓 IS:5500V ；
[0024]h)離子源溫度 TEM: 500 0C ；
[0025](3)化合物參數(shù):
[0026]恩諾沙星的代謝產(chǎn)物通過MRM-1DA-EPI模式來分析，其中MRM掃描的IDA閾值為500cps，EPI 掃描速率為 1000amu/s，CE 為 40±15eV，DP 為 50V，駐留時(shí)間 20ms ;MRM 離子對(duì)則需根據(jù)恩諾沙星的結(jié)構(gòu)及在體內(nèi)可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，預(yù)測其代謝產(chǎn)物的母離子及碎片離。
[0027]一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，它包括樣品提取、凈化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件和代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析，具體步驟如下:
[0028](I)樣品提取
[0029]樣品加入無水硫酸鈉后，渦旋混合均勻，再加入酸化乙腈超聲波提取，提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，吹干后的殘留物待凈化；[0030](2)凈化
[0031]加入乙腈水溶液渦旋溶解步驟(1)所述的殘留物，再加入正己烷，渦旋混合，靜置分層后，取下層清液，高速離心，過0.22 μ m有機(jī)相微孔濾膜后得到樣品待測液，供液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜_尚子講質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)儀分析測定；
[0032](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0033]精確稱取恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用定容溶液稀釋配制恩諾沙星和環(huán)丙沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS-Qtrap)法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0034]進(jìn)一步，步驟(3)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為稱取的恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為100 μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用定容溶液稀釋配制恩諾沙星及環(huán)丙沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，所述的定容溶液為乙腈與0.1%甲酸水溶液的體積比為1:9。
[0035](4)實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件
[0036]色譜條件如下:
[0037]a)色譜柱:C18 反相色譜柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ；
[0038]b)柱溫:35°C ；
[0039]c)流速:0.35mL/min ；
[0040]d)進(jìn)樣量:IOyL ;
[0041]e)流動(dòng)相:A:0.1%甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脫程序見表1 ;
[0042]表1流動(dòng)相梯度洗脫條件
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于樣品經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，用酸化乙腈提取其中的恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物，提取液濃縮后，用乙腈水溶液溶解殘留物，用正己烷除脂，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜法進(jìn)行測定，根據(jù)母離子與碎片離子的關(guān)系，對(duì)樣品中的恩諾沙星及其未知代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，所用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件如下: (1)色譜條件: a)色譜柱:C18反相色譜柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ； b)柱溫:35°C；
c)流速:0.35mL/min ； d)進(jìn)樣量:10yL; e)流動(dòng)相:A:0.1% (體積比)甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脫程序見表1 ; (2)質(zhì)譜條件: 離子源參數(shù): a)離子化模式:電噴霧離子源； b)掃描方式:正離子掃描； c)碰撞氣CAD, Medium ；
d)氣簾氣Cu rtain gas, 35psi ; e)霧化氣Gasl,30psi ； f)輔助加熱氣Gas2，30psi； g)噴霧電壓IS:5500V ； h)離子源溫度TEM: 500 0C ； (3)化合物參數(shù): 恩諾沙星的代謝產(chǎn)物通過MRM-1DA-EPI模式來分析，其中MRM掃描的IDA閾值為500cps，EPI 掃描速率為 1000amu/s，CE 為 40±15eV，DP 為 50V，駐留時(shí)間 20ms ;MRM 離子對(duì)則需根據(jù)恩諾沙星的結(jié)構(gòu)及在體內(nèi)可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，預(yù)測其代謝產(chǎn)物的母離子及碎片離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于它包括樣品提取、凈化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件和代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析，具體步驟如下: (1)樣品提取 樣品加入無水硫酸鈉后，渦旋混合均勻，再加入酸化乙腈超聲波提取，提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，吹干后的殘留物待凈化? (2)凈化 加入乙腈水溶液渦旋溶解步驟(1)所述的殘留物，再加入正己烷，渦旋混合，靜置分層后，取下層清液，高速離心，過0.22 μ m有機(jī)相微孔濾膜后得到樣品待測液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜儀分析測定； (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用定容溶液稀釋配制恩諾沙星和環(huán)丙沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件 色譜條件如下: a)色譜柱:C18反相色譜柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ； b)柱溫:35°C；
c)流速:0.35mL/min ； d)進(jìn)樣量:10yL; e)流動(dòng)相:A:0.1%甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脫程序見表1 ; 表1流動(dòng)相梯度洗脫條件
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測海參中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于步驟(3)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為稱取的恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為100 μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用定容溶液稀釋配制恩諾沙星及環(huán)丙沙星 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，所述的定容溶液為乙腈與0.1%甲酸水溶液的體積比為1:9。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103743809SQ201410028583
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】邢麗紅, 孫偉紅, 李兆新, 翟毓秀, 郭江濤, 郭萌萌, 吳海燕, 唐錫招 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所