抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC?NO.C2013189的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的，本發(fā)明還公開了所述單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體能特異性地與洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白反應(yīng)，而不與其它粘孢子蟲發(fā)生反應(yīng)，也不與洪湖碘泡蟲除殼瓣外的其它結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，可用于制備特異性檢測(cè)洪湖碘泡蟲的試劑盒，具有檢測(cè)特異性高，反應(yīng)靈敏的特點(diǎn)，適用于洪湖碘泡蟲的高通量檢測(cè)。
【專利說明】抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]粘孢子蟲(myxosporea)是養(yǎng)殖魚類常見的寄生蟲，能導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類的重大病害發(fā)生。其中，洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis Liu et Gu, 2012)是異育銀鯽“喉孢子蟲病”的病原，經(jīng)過移行與發(fā)育最終在魚體咽部形成大小不等的孢囊，奪取宿主營(yíng)養(yǎng)、阻塞魚體進(jìn)食和造成機(jī)械壓迫，最終導(dǎo)致魚體死亡。多年來(lái)，該病在湖北省武漢、仙桃、荊州、黃岡及江蘇省鹽城等地區(qū)大面積暴發(fā)，魚種死亡率超過90%，嚴(yán)重危害了異育銀鯽的健康養(yǎng)殖。
[0003]洪湖碘泡蟲成熟胞囊外有一層堅(jiān)硬的生物膜，一般化學(xué)藥物很難滲透其中，至今對(duì)該病尚無(wú)有效的治療辦法?？焖俸蜏?zhǔn)確地診斷是有效開展“喉孢子蟲病”防治的關(guān)鍵。從洪湖碘泡蟲的移行與發(fā)育過程來(lái)看，要想有效防控喉孢子蟲病的發(fā)生，必須在胞囊形成前作出正確診斷并采取有效措施阻斷孢囊形成。但是，目前在養(yǎng)殖生產(chǎn)中最廣泛應(yīng)用的臨床診斷法是基于典型病癥和光學(xué)顯微鏡觀察成熟孢子進(jìn)行診斷，這種方法診斷成本低，也能作出診斷，但致命缺點(diǎn)是診斷結(jié)果嚴(yán)重滯后，即顯微鏡能見成熟孢子和臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)胞囊已經(jīng)形成。因此，建立早期、快速、靈敏的有效診斷技術(shù)對(duì)異育銀鯽“喉孢子病”的防控具有非常重要的意義。
[0004]隨著免疫學(xué)的快速發(fā)展，免疫學(xué)快速診斷技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)的理論研究和臨床診斷等許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。其中，免疫熒光抗體技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物疾病診斷上的應(yīng)用具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，粘孢子蟲病的早期快速診斷有了長(zhǎng)足的發(fā)展，國(guó)外許多對(duì)漁業(yè)有重大危害的粘孢子蟲均發(fā)展了快速免疫診斷技術(shù)，如Ceratomyxa shasta、PKX、M.cerebralis 等。
[0005]然而，粘孢子蟲在免疫原`性方面存在屬特異性和種特異性，國(guó)內(nèi)外建立的免疫診斷技術(shù)及商品檢測(cè)試劑均只適用于特定種類，如腦粘體蟲的免疫熒光診斷技術(shù)，只能特異性診斷腦粘體蟲，對(duì)其他粘孢子蟲無(wú)法識(shí)別。對(duì)于嚴(yán)重危害我國(guó)異育銀鯽的洪湖碘泡蟲，目前尚缺乏種特異性的早期診斷技術(shù)。因此，急需發(fā)展洪湖碘泡蟲的種特異性檢測(cè)技術(shù)，為“喉孢子蟲病”的早期診斷和防治提供重要的依據(jù)，保障異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一個(gè)目的就是針對(duì)以上存在的問題與不足，提供一種抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供能分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述單克隆抗體的制備方法。
[0009]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述單克隆抗體的應(yīng)用。
[0010]為了解決上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體對(duì)洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白有特異性。
[0011]本發(fā)明中所述的“特異性”是指單克隆抗體對(duì)相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性高，抗原的識(shí)別能力就強(qiáng)。因此，上述的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別和結(jié)合洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白。
[0012]所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC N0.C2013189的雜交瘤細(xì)胞株3B7分泌。所述雜交瘤細(xì)胞株3B7已保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年11月15日，分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mouse hybridoma)。
[0013]所述雜交瘤細(xì)胞株3B7是采用洪湖碘泡蟲可溶性蛋白作為抗原免疫小鼠得到的，該可溶性蛋白的SDS-PAGE分析如附圖1所示。
[0014]所述可溶性蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白有特異性反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3B7，從所述雜交瘤細(xì)胞株3B7的培養(yǎng)上清液中或從注射所述雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取所述單克隆抗體。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，以洪湖碘泡蟲可溶性蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與同系動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，并建立雜交細(xì)胞株。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動(dòng)物，將其脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞。還可以選擇適宜的骨髓瘤細(xì)胞用于融合，例如用來(lái)自大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠的骨髓瘤細(xì)胞。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0016]篩選產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，得到的產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，可以在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)或者在液氮中長(zhǎng)時(shí)間保存。從雜交瘤細(xì)胞收集本發(fā)明的單克隆抗體時(shí)，可以從雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細(xì)胞注入適宜的哺乳動(dòng)物并從動(dòng)物腹水中獲取抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體，后一種方法適于大量獲取抗體。通過上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，例如鹽析、凝膠過濾、親和層析等方法。`
[0017]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種免疫測(cè)定法，所述免疫測(cè)定法采用上述的抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體。
[0018]所述免疫測(cè)定法是間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和間接免疫熒光法(IFAT)。
[0019]本發(fā)明建立的ELISA和IFAT檢測(cè)試劑盒，含有本發(fā)明的單克隆抗體和用于與單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記物(標(biāo)記物可以是放射性同位素、熒光化合物、生物素和酶等物質(zhì))，以及用于檢測(cè)的其他試劑和緩沖液。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，利用上述單克隆抗體，制備相應(yīng)的檢測(cè)產(chǎn)品，是顯而易見的。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:
[0021]I)該單克隆抗體(mAb3B7)可特異地與洪湖碘泡蟲反應(yīng)，而不與其它粘孢子蟲發(fā)生反應(yīng)，從而可以進(jìn)行洪湖碘泡蟲的種特異性檢測(cè)，彌補(bǔ)目前尚無(wú)洪湖碘泡蟲特異性檢測(cè)方法之不足，特異性高，反應(yīng)靈敏。
[0022]2)該單克隆抗體(mAb3B7)僅特異地與洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白發(fā)生反應(yīng)，而不與其它結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)。
[0023]3)本發(fā)明的免疫試劑盒可用于洪湖碘泡蟲的種特異性檢測(cè)，彌補(bǔ)目前尚無(wú)洪湖碘泡蟲特異性檢測(cè)方法之不足，特異性高，反應(yīng)靈敏，成本低，適于高通量檢測(cè)和大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:抗原(洪湖碘泡蟲可溶性蛋白)的SDS-PAGE分析。M:蛋白marker，M.honghuensis:洪湖碘泡蟲可溶性蛋白。
[0025]圖2:抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體3B7的免疫印跡分析(Western_blot)。M:蛋白Marker，mAb3B7:單克隆抗體3B7識(shí)別的蛋白條帶(Mr28000處)。
[0026]圖3:抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體3B7的間接免疫熒光檢測(cè)(IFAT) Ca,b標(biāo)尺為20 ii m ;c標(biāo)尺為10 u m)o a、c:洪湖碘泡蟲突光顯微鏡拍照?qǐng)D；b:洪湖碘泡蟲光學(xué)顯微鏡拍照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0028]實(shí)施例1抗原的制備
[0029]1.1孢子的分離純化
[0030]用剪刀將宿主魚體鰓蓋剪開，用彎頭手術(shù)鑷從咽部剝離完整孢囊；用磷酸緩沖液(PBS，pH7.0)洗滌3次，300rpm，離心5min ;孢囊重懸于少量PBS中，玻璃勻漿器手工勻漿直至漿液較均勻，1000rpm,離心20min，收集沉淀和上清；沉淀用適量PBS重懸，用蔗糖密度梯度(1:1, 1: 2,1: 3,1: 4,1: 5)離心，1000rpm, 15min分離出成熟孢子(位于1:1~1:2之間)；成熟孢子用PBS洗漆兩次,3000rpm,離心IOmin,去上清,沉淀物即為成熟孢子。
[0031]L 2可溶性蛋白的制備
[0032]分離純 化后的孢子經(jīng)PBS (pH7.0)洗滌后，用液氮進(jìn)行研磨，然后離心取上清即為孢子可溶性抗原。具體步驟如下:純化后的成熟孢子用PBS洗滌兩次，3000rpm,離心lOmin，去上清；沉淀用少量PBS混勻后倒入研缽，倒入液氮研磨促使殼瓣破裂釋放內(nèi)含物；加少量PBS溶解，12000rpm離心，取上清；用BCA法測(cè)定抗原濃度。
[0033]1.3SDS-PAGE對(duì)洪湖碘泡蟲可溶性蛋白分析
[0034]孢子可溶蛋白加入凝膠上樣緩沖液，沸水中水浴lOmin，冰上冷卻；臨用前12000rpm, 4°C，離心5min，取上清，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(分離膠12%、濃縮膠4%)鑒定洪湖碘泡蟲可溶性蛋白(圖1)。
[0035]實(shí)施例2單克隆抗體的制備
[0036]2.1動(dòng)物免疫
[0037]2.1.1動(dòng)物:雌性，6~8周齡BALB/c小鼠5只(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所)。
[0038]2.1.2抗原:實(shí)施例1中制備的洪湖碘泡蟲可溶性抗原，50 u g/只/次。
[0039]2.1.3免疫途徑及程序:初次免疫:洪湖碘泡蟲可溶性抗原與等體積完全弗氏佐劑充分混勻，形成油包水，于鼠背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射；第二次免疫:3周后，洪湖碘泡蟲可溶性抗原與不完全弗氏佐劑等體積混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。之后隔3周免疫一次(腹腔內(nèi)不含佐劑)，并于免疫后第5~7天取尾靜脈血20 y L，用ELISA法測(cè)抗體效價(jià)；加強(qiáng)免疫:待抗體效價(jià)達(dá)到1:3000時(shí)，尾靜脈加強(qiáng)免疫(不含佐劑)，于3天后取脾臟，進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0040]2.2細(xì)胞融合
[0041]2.2.1飼養(yǎng)細(xì)胞的制備:BALB/c小鼠拉頸處死，75 %酒精中浸泡消毒5min。剖開腹外皮膚，用5mL無(wú)血清1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕輕晃動(dòng)后抽出腹腔液，離心計(jì)數(shù)。用20%小牛血清1640調(diào)整細(xì)胞濃度至0.5~2X105/mL，立即種植于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，0.1mL/孔。
[0042]2.2.2脾細(xì)胞的制備:最后一次加強(qiáng)免疫后第3天，無(wú)菌取小鼠的脾臟，置于無(wú)血清的1640培養(yǎng)液中，用注射器內(nèi)栓將脾臟攆碎，通過尼龍網(wǎng)過濾，制備細(xì)胞懸液。1000rpm離心5min,棄上清后重懸于5mL無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。
[0043]2.2.3骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備:選用小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞，洗滌記數(shù)，調(diào)整濃度為4~5X105/mL，懸浮于無(wú)血清1640培養(yǎng)液中備用。
[0044]2.2.4細(xì)胞融合:將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞以10: I (細(xì)胞數(shù)比)混合，1000rpm離心5min，傾去上清，輕彈沉降下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)塊，使之完全松散。以ImL移液管吸取0.7mL的50% PEG-4000在Imin內(nèi)邊攪拌邊加入，加完后靜置90s。之后以無(wú)血清1640培養(yǎng)液終止融合，開始時(shí)須緩慢加入(lmL/min),而后逐漸加快，邊加邊攪，共加入30mL終止液。整個(gè)融合過程須在37°C水浴下進(jìn)行。SOOrpm離心5min，去除上清，繼續(xù)下一步操作。
[0045]2.2.5細(xì)胞培養(yǎng):將離心后的細(xì)胞團(tuán)塊輕彈至散開。待細(xì)胞完全松散后用HAT培養(yǎng)基重懸，加入到已用飼養(yǎng)細(xì)胞鋪好的96孔板中，每孔200 ii L置于37°C,5*% (體積百分比)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。I周后，在倒置顯微鏡下觀察克隆生長(zhǎng)情況并記錄每孔克隆數(shù)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)孔底1/3面積時(shí)即可吸取培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
`[0046]2.3陽(yáng)性克隆的篩選和亞克隆
[0047]2.3.1ELISA檢測(cè):用包被液將洪湖碘泡蟲可溶性抗原(0.5mg/mL)每孔100 u L包被酶標(biāo)板，置于4°C過夜；用洗滌液將包被好的酶標(biāo)板洗滌3次，每次3min，然后用I %BSA-PBS封閉，每孔200 u L，室溫放置2h ;傾去封閉液，同上洗滌，每孔加入100 u L待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，于37°C孵育Ih ;傾去培養(yǎng)上清，洗滌后每孔加入1: 3000 (工作濃度)稀釋的羊抗鼠IgG-HRP (辣根過氧化物酶)結(jié)合物100 ii L，于37°C孵育lh。將多余的酶結(jié)合物棄去，同上洗滌。每孔加入100 ii L的TMB底物反應(yīng)液，室溫顯色10~30min后，每孔加入50iiL的終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值，吸光值大于陰性孔2倍以上者為陽(yáng)性，選擇陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆。
[0048]2.3.2雜交瘤細(xì)胞的亞克隆(單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)):有限稀釋法進(jìn)行克隆化。飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備同2.2.1，將ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞從培養(yǎng)板內(nèi)輕輕洗脫計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)液連續(xù)稀釋細(xì)胞懸液成30個(gè)細(xì)胞/mL接種在鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，0.1mL/孔。培養(yǎng)10天左右，雜交瘤細(xì)胞集落長(zhǎng)至孔底1/3面積時(shí)，開始測(cè)定上清中抗體活性。對(duì)有抗體活性的陽(yáng)性細(xì)胞孔再克隆，共進(jìn)行3次。
[0049]經(jīng)上述重復(fù)進(jìn)行ELISA篩選及亞克隆，最后篩選出I株能穩(wěn)定分泌抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為mAb3B7，保藏號(hào)為CCTCC N0.C2013189。
[0050]2.4單克隆抗體大星制備和初步純化
[0051]2.4.1小鼠腹水的制備及收集:將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，選取20~22g BALB/c雌性小鼠，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2 X IO7/只，10~14天后待小鼠腹部明顯膨脹后，收集腹水。將收集的腹水3000rpm離心5min，取上清，-20°C儲(chǔ)存。
[0052]2.4.2腹水的初步純化:采用鹽析法,取腹水2mL加入潔凈的離心管中，加2mL生理鹽水混勻；逐滴加入4mL飽和硫酸銨，4°C靜置2h或過夜；5000rpm離心30min,沉淀再用50%飽和硫酸銨洗滌2次；用2mLPBS使沉淀溶解，將此蛋白質(zhì)溶液加入透析袋中，對(duì)PBS緩沖液4°C透析過夜，期間換液2~3次。
[0053]實(shí)施例3單克隆抗體的鑒定
[0054]3.1抗體亞類
[0055]使用鼠單克隆抗體亞類檢測(cè)試劑盒(Sigma)測(cè)定。將羊抗鼠IgGl, IgG2a, IgG2b,IgG3，IgA和IgM分別用包被液I: 1000稀釋，IOOii L/孔包被，4°C過夜或37°C孵育2h ;用洗滌液PBST洗滌3次，3min/次，每孔加入100 u L待檢測(cè)的單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C孵育Ih;同上洗滌3次，加入I: 5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多價(jià)免疫球蛋白(G、A、M)抗體，每孔100 u L，37°C孵育Ih ;同上洗滌3次，每孔加入新鮮配置的TMB底物溶液100 u L，37°C避光孵育20min ;每孔加入50 u L2M H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD450吸光值，以陽(yáng)性反應(yīng)孔包被的亞類類別為待測(cè)上清的抗體類別。鑒定結(jié)果表明，本發(fā)明制備的抗體亞類為IgGl。
[0056]3.2ffestern-Blot 檢測(cè)
[0057]孢子可溶蛋白加入凝膠上樣緩沖液，沸水中水浴lOmin，冰上冷卻；臨用前12000rpm, 4°C,離心5min取上清，用于Western-blot分析；蛋白樣品經(jīng)12%SDS_PAGE膠(Bio-Rad Min1-Protein電泳系統(tǒng))電泳分離；電泳結(jié)束后按照Mini Trans-Blot電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)操作指南裝配轉(zhuǎn)膜Sandwich，安裝電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，以80V電壓冰浴轉(zhuǎn)膜40min，將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 iim的PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜緩沖液配方:25mM Tris pH8.3，192mM甘氨酸，20%甲醇；麗春紅染色3min，標(biāo)出Marker，其余的膜用TBST溶液(25mM Tris pH7.5，150mMNaCl，0.05%Tween-20)洗膜3次，每次IOmin ；5%脫脂奶粉(溶于TBST中)室溫封閉Ih ；以I: 500~1000稀釋比例(根據(jù)抗體效價(jià)調(diào)整)將抗血清稀釋于TBST (含1%脫脂奶粉和0.l%Tween-20)中，室溫孵育Ih ；TBST洗膜3次，每次15min ;以1: 1000稀釋比例加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育Ih ；TBST(TBS溶液中加入0.l%TWeen-20)洗膜3次，每次15min，采用ECL (化學(xué)發(fā)光法)系統(tǒng)曝光存圖。
[0058]結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明制備的單抗腹水與洪湖碘泡蟲可溶性抗原在約Mr28000處有特異性反應(yīng)條帶。
[0059]3.3間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定抗體的特異性和親和性
[0060]將洪湖碘泡蟲(M.honghuensis)和吳李碘泡蟲(M.wulii)可溶性抗原用包被液稀釋至I ii g/mL的濃度100 u L/孔包被酶標(biāo)板，4°C過夜或37°C孵育2h ;用洗滌液PBST洗滌3次，3min/次；拍干后用含1% BSA的PBST封閉，37°C濕盒作用Ih ;同上洗滌3次，加入倍比稀釋的單抗腹水，稀釋度為 I: 400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200，37°C孵育Ih ;同上洗滌3次，加入I: 3000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，37°C孵育Ih ;同上洗滌3次，加入TMB底物顯色，以正常BALB/c小鼠的血清為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。
[0061]表1間接ELISA特異性檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種抗洪湖碘泡蟲殼瓣蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCCN0.C2013189的雜交瘤細(xì)胞株3B7所分泌的。
2.權(quán)利要求1中所述的雜交瘤細(xì)胞株3B7，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0.C2013189。
3.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于:從保藏號(hào)為CCTCCN0.C2013189的雜交瘤細(xì)胞株3B7的培養(yǎng)上清液中或從注射所述雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)洪湖碘泡蟲的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)洪湖碘泡蟲的 試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103755806SQ201410017099
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】顧澤茂, 賈洛, 翟艷花, 柳陽(yáng), 袁軍法, 秦建華, 李丹, 郭慶祥 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)