一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法
【專利摘要】一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，屬于電化學免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。將納米材料超聲分散于殼聚糖溶液制備納米材料/殼聚糖復合物，利用該納米復合物修飾玻碳電極固定牛細胞因子抗體，獲得新穎的牛細胞因子免疫傳感器，然后將其應用于牛細胞因子的電化學無標記阻抗免疫檢測。該檢測方法無需標記、簡單、快速、成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，可以用于牛結(jié)核病的早期診斷及牛細胞免疫機理的研究。
【專利說明】—種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及牛細胞因子的免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是對奶牛健康和產(chǎn)乳品質(zhì)影響最為嚴重的傳染疾病之一。Y-干擾素(IFN-Y)是在特定誘生劑刺激作用下，由T細胞分泌的一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等生物活性的糖蛋白，是發(fā)現(xiàn)最早、關(guān)注最多的細胞因子。白細胞介素_4 (IL-4)于20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)，是由Th2型細胞分泌的一種多效性T細胞活化因子，是有機體體液免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子。在結(jié)核感染早期，牛機體內(nèi)IFN-Y和IL-4分泌水平顯著提高。若以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激潛伏感染期間的牛免疫記憶細胞，也會產(chǎn)生高水平的IFN-Y和IL-4。因此，牛IFN-Y和IL-4可以作為牛結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷的檢測指標，對牛結(jié)核病的控制具有重要意義。
[0003]目前，生物學分析是常用的牛IFN-Y和IL-4檢測方法，這些生物學分析方法靈敏度低，費力、耗時、且難于標準化。另外，它們對檢測樣品中的緩沖劑和其它細胞因子敏感，容易受到干擾。雖酶聯(lián)免疫吸附分析也被建立來檢測牛IFN-Y和IL-4，但是這些方法同樣操作繁瑣，費力、耗時，并且靈敏度也不能令人滿意。由于牛IEN-Y和IL-4分子量較小且在機體體液中的量極少，所以目前測定牛IEN-Y和IL-4的方法的靈敏度距離臨床實際應用還有較大差距。因此，當前急需建立一種超高靈敏度、快速、可靠的方法檢測牛的IFN- Y、IL-4，為牛結(jié)核病的早期診斷提供一個平臺。
[0004]近年來，電化學阻抗免疫分析法由于其無需標記，靈敏度高，特異性好，樣品消耗量小、簡單快速等特點，成為一種極有競爭力的現(xiàn)場檢測方法。納米材料具有獨特化學、物理和機械性能的納米材料，為電化學免疫分析研究提供了新研究途徑。因此，利用納米材料固定牛細胞因子抗體，建立一個電化學無標記組抗型免疫分析法檢測牛細胞因子，對牛結(jié)核病的早期診斷具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述牛細胞因子檢測方法的缺陷，建立一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟；
1)將納米材料超聲分散在殼聚糖醋酸溶液中，形成納米材料和殼聚糖的復合物，然后再混入牛細胞因子抗體，形成納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液；所述納米材料為還原石墨烯、介孔二氧化硅納米顆?；虬魻疃趸?；
2)將納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，晾干后，再經(jīng)牛血清蛋白封閉活性位點后，制得具有牛細胞因子免疫傳感器的玻碳電極材料；
3)將具有牛細胞因子免疫傳感器的玻碳電極材料置于含有37°C的牛細胞因子樣品體系中，溫育40分鐘后以蒸溜水沖洗，制得牛細胞因子免疫傳感器；
4)將制得的牛細胞因子免疫傳感器置于已知的含有牛細胞因子的緩沖液中，在37°C條件下溫育40 min后，取出溫育后的牛細胞因子免疫傳感器，以蒸餾水沖洗；
5)以蒸餾水沖洗后的牛細胞因子免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極作為輔助電極、鉬片電極作為對電極，進行交流阻抗實驗，制得同一種牛細胞因子和不同濃度的該牛細胞因子的交流阻抗譜圖；
6)從各交流阻抗譜圖中取得各譜圖的直徑，然后制成牛細胞因子濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖；
7)將牛細胞因子免疫傳感器置于待測樣品的緩沖液中，在37°C條件下溫育40min后，取出溫育后的牛細胞因子免疫傳感器，以蒸餾水沖洗；然后以與步驟5)相同的條件進行交流阻抗實驗，取得牛細胞因子的交流阻抗譜圖，然后讀取譜圖的直徑值；
8)在步驟6)取得的線性關(guān)系圖中查找步驟7)取得的譜圖的直徑值所對應的值，即待測樣品的牛細胞因子濃度的對數(shù)值。
[0007]以上步驟I)至6)是制作牛細胞因子濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖，步驟7)則是對待測樣品的阻抗前后相對變化值檢測，通過線性關(guān)系圖可直接取得待測樣品的牛細胞因子濃度的對數(shù)值。本發(fā)明以殼聚糖為制作傳感器的成膜劑，利用具有比表面積較大的納米材料來固定牛細胞因子抗體，以提高分析效果。該免疫傳感器可用于牛干擾素-Y、白介素-4等細胞因子的定量檢測。
[0008]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
(I)該分析方法無需任何標記、簡單、快速、成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，可以用于牛結(jié)核病的早期診斷及牛細胞免疫機理的研究。
[0009](2)納米材料具有比表面積大，良好的生物相容性,利用其固定細胞因子抗體,有利于保持抗體的生物活性，拓寬檢測的線性范圍，提高免疫應特異性和反應效率，減少非特異性吸附，提高檢測靈敏度。
[0010](3)殼聚糖是天然高分子聚合物甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，它具有良好的成膜性和支持能力，并且生物相容性好，常用于生物材料的固定基質(zhì)，表現(xiàn)出顯著的生理活性和生物可降解性。
[0011]另外，本發(fā)明在將納米材料超聲分散在殼聚糖醋酸溶液中時，所述殼聚糖醋酸溶液中的殼聚糖質(zhì)量百分比為1%，所述納米材料與殼聚糖醋酸溶液的投料比為2mg:lmL?？墒辜{米材料均勻的分散在殼聚糖醋酸溶液中，以便更好的固定抗體。
[0012]以牛血清蛋白封閉活性位點的具體方法是:將晾干后的玻碳電極插置于常溫的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min。
[0013]為了排除電極表面雜質(zhì)對測定的影響，在所述滴涂納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液之前，將玻碳電極用0.05 _的氧化鋁粉拋光，再用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉，然后放入稀硝酸溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面，取得潔凈的玻碳電極。
[0014]所述稀硝酸溶液是由硝酸和水以體積比為1:1的比例混合形成的硝酸溶液。由于硝酸具有強氧化性，能夠去除電極表面頑固的雜質(zhì)。
[0015]所述交流阻抗實驗的試液由體積比為1:1的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的混合物5mM、0.1 M磷酸鹽緩沖溶液和0.1 M氯化鉀溶液組成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為實施例1中將制備的牛IFN- Y免疫傳感器加入到不同濃度牛IFN- Y后得到的交流阻抗譜圖。
[0017]圖2為從圖1制得的牛IFN- Y濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0018]下面對本發(fā)明的實驗過程進行詳細的說明，旨在使本發(fā)明的設(shè)計流程、設(shè)計目的及其創(chuàng)新點和優(yōu)點更加清楚。
[0019]實施例1:
一、制作牛IFN-Y濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖:
(I)采用化學分散法制備還原石墨烯納米材料:取氧化石墨0.1g與IOOmL蒸餾水混合，超聲振蕩30 min。之后將振蕩分散好的氧化石墨加入到三頸瓶中，并加入Ig硼氫化鈉，在100°C下加熱回流8h。靜置過濾，自然晾干后收集生成的即為還原石墨烯。
[0020](2)制備還原石墨烯/殼聚糖/牛IFN- Y抗體的混合液:將2mg還原石墨烯超聲分散于ImL的殼聚糖質(zhì)量百分比為1%的殼聚糖醋酸溶液中，形成還原石墨烯/殼聚糖的復合物。
[0021]然后向以上復合物中加入牛IFN-Y抗體40(^g/mL，攪拌混合均勻，形成還原石墨烯/殼聚糖/牛IFN- Y抗體的混合液。`
[0022](3)清潔玻碳電極材料:將玻碳電極用0.05mm的氧化鋁粉拋光，用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉，放入稀硝酸溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面。
[0023](4)取還原石墨烯/殼聚糖/牛IFN- Y抗體混合液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，電極晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min,以封閉非特異性位點，制得牛IFN-Y免疫傳感器。
[0024](5)將制得的牛IFN-Y免疫傳感器分別置于由緩沖溶液稀釋成的不同的濃度的牛IFN-Y緩沖溶液中，然后分別在37°C溫育40 min，蒸餾水沖洗后，分別檢測其電化學阻
抗信號。
[0025](6)交流阻抗實驗在Autolab電化學工作站上進行，交流阻抗測定的頻率范圍是10—1 Hz到IO5 Hz，使用開路電位，正弦波電位的振幅為10 mV，阻抗測試液為含有5 mM鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀(體積比為1:1進行混合制成)的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液和0.1 M氯化鉀溶液。
[0026]以蒸餾水沖洗后的各個牛IFN-Y免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極作為輔助電極、鉬片電極作為對電極，分別進行交流阻抗實驗，制得牛IFN-Y免疫傳感器和不同濃度的牛IFN-Y的交流阻抗譜圖，如圖1所示。圖1中，Zre為實軸，Zim為虛軸。
[0027](7)從各交流阻抗譜圖中取得各譜圖的直徑，然后制成牛IFN-Y濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖，如圖2所示。圖2中l(wèi)ogCB()IFN_Y為牛干擾素- Y濃度的對數(shù)圖，ARrf (ο/ο)為阻抗前后相對變化值。
[0028]二、對樣品進行牛IFN-Y濃度的對數(shù)值檢測:
(I)將以上步驟(4)制成的牛IFN-Y免疫傳感器置于待測樣品的緩沖液中，在37°C條件下溫育40 min后，取出溫育后的牛IFN-Y免疫傳感器，以蒸餾水沖洗。
[0029](2)以與以上步驟(6)相同的條件進行交流阻抗實驗，取得牛IFN-Y的交流阻抗譜圖，然后取得譜圖的直徑值。
[0030](3)在步驟(7)取得的線性關(guān)系圖中查找待測樣品的譜圖的直徑值所對應的值，SP待測樣品的牛IFN-Y濃度的對數(shù)值。
[0031]實施例2:
一、制作牛IL-4濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖:
(I)棒狀二氧化鈦的合成:在冰水浴條件下，將1.8 mL的四氯化鈦緩慢加入到盛有19mL蒸懼水的50 mL燒杯中，劇烈攪拌10 min,得到白色懸池液。將15 mL氯仿溶劑加入到此懸濁液中，磁力攪拌10 min,再轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應釜中，置于160°C的烘箱中，水熱反應12 h。將所得產(chǎn)物用無水乙醇離心洗滌至中性后，置于60°C真空箱中烘干24 h，室溫下研磨得到產(chǎn)物。
[0032](2)制備二氧化鈦/殼聚糖/牛IL-4抗體的混合液:將2 mg 二氧化鈦納米棒超聲分散于I mL的I %殼聚糖醋酸溶液中，然后加入牛IL-4抗體，攪拌混合均勻，形成二氧化鈦/殼聚糖/牛IL-4抗體的混合液。
[0033](3)清潔玻碳電極材料:將玻碳電極用0.05 mm的氧化鋁粉拋光，用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉，放入稀硝酸溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面。
[0034](4)取二氧化鈦/殼聚糖/牛IL-4抗體混合液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min，以封閉非特異性位點，制得牛IFN-Y免疫傳感器。
[0035](5)將制得的牛IL-4免疫傳感器分別置于由緩沖溶液稀釋成的不同的濃度的牛IL-4緩沖溶液中，然后分別在37°C溫育40 min，蒸餾水沖洗后，分別檢測其電化學阻抗信號。
[0036](6)交流阻抗實驗在Autolab電化學工作站上進行，交流阻抗測定的頻率范圍是10—1 Hz到IO5 Hz，使用開路電位，正弦波電位的振幅為10 mV，阻抗測試液為含有5 mM鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀(1:1)的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液和0.1 M氯化鉀溶液。
[0037]以蒸餾水沖洗后的各個牛IL-4免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極作為輔助電極、鉬片電極作為對電極，分別進行交流阻抗實驗，制得牛IL-4免疫傳感器和不同濃度的牛IL-4的交流阻抗譜圖。
[0038](7)從各交流阻抗譜圖中取得各譜圖的直徑，然后制成牛IL-4濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖。
[0039]二、對樣品進行牛IL-4濃度的對數(shù)值檢測:
(I)將以上步驟(4)制成的牛IL-4免疫傳感器置于待測樣品的緩沖液中，在37°C條件下溫育40 min后，取出溫育后的牛IL-4免疫傳感器，以蒸餾水沖洗。
[0040](2)以與以上步驟(6)相同的條件進行交流阻抗實驗，取得牛IL-4的交流阻抗譜圖，然后取得譜圖的直徑值。
[0041](3)在步驟(7)取得的線性關(guān)系圖中查找待測樣品的譜圖的直徑值所對應的值，SP待測樣品的牛IL-4濃度的對數(shù)值。
[0042]實施例3:
一、制作牛IL-4濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖:
(I)介孔二氧化硅納米顆粒的合成:稱取IOg十六烷基三甲基溴化銨溶解在480 mL蒸餾水中，并加入氫氧化鈉溶液(2.00 M, 3.50 mL)，保持溶液溫度在80°C。將5 mL三乙氧基硅烷逐滴加入該溶液中，并在80°C條件下攪拌2 h，得到的白色沉淀物經(jīng)過濾法分離。將分離得到的二氧化硅顆粒在550°C馬沸爐中煅燒5 h得到最終產(chǎn)物。
[0043](2)制備二氧化硅/殼聚糖/牛IFN- Y抗體的混合液:將2 mg介孔二氧化硅超聲分散于I mL的I %殼聚糖醋酸溶液中，然后加入牛IFN-Y抗體，攪拌混合均勻，形成二氧化硅/殼聚糖/牛IFN- Y抗體的混合液。
[0044](3)清潔玻碳電極材料:將玻碳電極用0.05 mm的氧化鋁粉拋光，用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉，放入稀硝酸溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面。
[0045](4)取二氧化硅/殼聚糖/牛IFN- Y抗體混合液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min,以封閉非特異性位點，制得牛IFN-Y免疫傳感器。
[0046](5)將制得的牛IFN-Y免疫傳感器分別置于由緩沖溶液稀釋成的不同的濃度的牛IFN-Y緩沖溶液中，然后分別在37°C溫育40 min，蒸餾水沖洗后，分別檢測其電化學阻
抗信號。
[0047](6)交流阻抗實驗在Autolab電化學工作站上進行，交流阻抗測定的頻率范圍是10—1 Hz到IO5 Hz，使用開路電位，正弦波電位的振幅為10 mV，阻抗測試液為含有5 mM鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀(1:1)的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液和0.1 M氯化鉀溶液。
[0048]以蒸餾水沖洗后的各個牛IFN-Y免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極作為輔助電極、鉬片電極作為對電極，分別進行交流阻抗實驗，制得牛IFN-Y免疫傳感器和不同濃度的牛IL-4的交流阻抗譜圖。
[0049](7)從各交流阻抗譜圖中取得各譜圖的直徑，然后制成牛IFN-Y濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖。
[0050]二、對樣品進行牛IFN-Y濃度的對數(shù)值檢測:
(I)將以上步驟(4)制成的牛IFN-Y免疫傳感器置于待測樣品的緩沖液中，在37°C條件下溫育40 min后，取出溫育后的牛IFN-Y免疫傳感器，以蒸餾水沖洗。
[0051](2)以與以上步驟(6)相同的條件進行交流阻抗實驗，取得牛IFN-Y的交流阻抗譜圖，然后取得譜圖的直徑值。
[0052](3)在步驟(7)取得的線性關(guān)系圖中查找待測樣品的譜圖的直徑值所對應的值，SP待測樣品的牛IFN-Y濃度的對數(shù)值。
【權(quán)利要求】
1.一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟； 1)將納米材料超聲分散在殼聚糖醋酸溶液中，形成納米材料和殼聚糖的復合物，然后再混入牛細胞因子抗體，形成納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液；所述納米材料為還原石墨烯、介孔二氧化硅納米顆?；虬魻疃趸?； 2)將納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，晾干后，再經(jīng)牛血清蛋白封閉活性位點后，制得具有牛細胞因子免疫傳感器的玻碳電極材料； 3)將具有牛細胞因子免疫傳感器的玻碳電極材料置于含有37°C的牛細胞因子樣品體系中，溫育40分鐘后以蒸溜水沖洗，制得牛細胞因子免疫傳感器； 4)將制得的牛細胞因子免疫傳感器置于已知的含有牛細胞因子的緩沖液中，在37°C條件下溫育40 min后，取出溫育后的牛細胞因子免疫傳感器，以蒸餾水沖洗； 5)以蒸餾水沖洗后的牛細胞因子免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極作為輔助電極、鉬片電極作為對電極，進行交流阻抗實驗，制得同一種牛細胞因子和不同濃度的該牛細胞因子的交流阻抗譜圖； 6)從各交流阻抗譜圖中取得各譜圖的直徑，然后制成牛細胞因子濃度的對數(shù)值與阻抗前后相對變化值的線性關(guān)系圖； 7)將牛細胞因子免疫傳感器置于待測樣品的緩沖液中，在37°C條件下溫育40min后，取出溫育后的牛細胞因子免疫傳感器，以蒸餾水沖洗；然后以與步驟5)相同的條件進行交流阻抗實驗，取得牛細胞因子的交流阻抗譜圖，然后讀取譜圖的直徑值； 8)在步驟6)取得的線性關(guān)系圖中查找步驟7)取得的譜圖的直徑值所對應的值，即待測樣品的牛細胞因子濃度的對數(shù)值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于在將納米材料超聲分散在殼聚糖醋酸溶液中時，所述殼聚糖醋酸溶液中的殼聚糖質(zhì)量百分比為1%，所述納米材料與殼聚糖醋酸溶液的投料比為2mg:lmL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于以牛血清蛋白封閉活性位點的具體方法是:將晾干后的玻碳電極插置于常溫的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于在所述滴涂納米材料/殼聚糖/牛細胞因子抗體混合液之前，將玻碳電極用0.05 mm的氧化鋁粉拋光，再用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉，然后放入稀硝酸溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面，取得潔凈的玻碳電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于所述稀硝酸溶液是由硝酸和水以體積比為1:1的比例混合形成的硝酸溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種牛細胞因子電化學無標記阻抗型免疫檢測方法，其特征在于所述交流阻抗實驗的試液由體積比為1:1的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的混合物5 mM、0.1M磷酸鹽緩沖溶液和0.1 M氯化鉀溶液組成。
【文檔編號】G01N33/68GK103472238SQ201310443715
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】楊占軍, 趙潔, 陳祥 申請人:揚州大學